1、本科毕业论文系列开题报告生物工程鱼类嗅觉基因的SOUTHERN杂交分析研究一、选题的背景与意义鱼类的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊构成，鱼类嗅觉器官的进化与发展也经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的过程。鱼类的嗅觉器官在鱼类的生活中，诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上发挥着重要的作用。本研究主要利用SOUTHERN印迹杂交技术检测本实验室已经鉴定出9个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、从大黄鱼内脏或肌肉组织中提取DN
2、A，并电泳检测DNA的浓度；2、用两种酶（HINDIII和ECOLII）酶切目的DNA；3、地高辛标记的探针制备；4、探针与目的DNA的SOUTHERNBLOT杂交；5、杂交膜的洗脱和显色。拟解决的问题1、大黄鱼DNA的提取；2、地高辛标记探针的制备；3、电转法转膜的效率；4、杂交膜的洗脱与显色的控制。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1DNA的提取和回收从大黄鱼的肝脏或肌肉组织中提取适量基因组DNA；2随机引物法标记探针分别用两种酶（ECOLI1,HIND3）酶切大黄鱼基因组DNA，电泳胶回收目的DNA片段，制作地高辛标记探针；3电转法转膜采用电转法将目的DNA片段转移到尼龙膜上（80V
3、，50MIN）；4SOUTHERNBLOT膜烘干（120,30MIN）后，先用预杂交液进行预杂交，再用DIG标记探针杂交过夜；5杂交膜的洗脱和显色杂交完毕，经洗膜后，再用抗体与DIG标记探针杂交，再次用WASHINGBUFFER洗膜后，即可加入显色剂，将被显色剂充分浸透的杂交膜装入一封闭的袋子中，并置于暗室显色过夜。显色完全后，查看膜上的条带从而获得相应家族基因的拷贝数，最后将膜烘干并拍照。这样用9种不同的DIG标记探针就可以获得大黄鱼嗅觉基因系统9大家族基因的拷贝数。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201011201012实验前1毕业论文选题。2进行文献查阅和资料收集。3制定具体研究计
4、划和试验方案。4开题答辩与综述。电转法转膜探针杂交BLOTINGAGROSE电泳大黄鱼基因组DNA提取DIG标记探针制备酶切效率检测与浓缩基因组DNA酶切洗膜后，显色剂显色洗膜后，抗体与DIG标记探针杂交烘干，拍照20101220111实验中1试验相关试剂准备。2数据和材料整理、分析。2011120115实验后1完成2篇外文翻译。2论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1陈星玉,中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821942孟庆闻,殷名称鳐类和银鲛类嗅觉器官的研究J水产学报,1981,532092143孟庆闻,殷名称鲨类嗅觉器官的研究C鱼类学论文集,北京科学出版社,1
5、9812012094孟庆闻,苏锦祥,李婉端鱼类比较解剖C鱼类学论文集,北京科学出版社,19873273345陈星玉中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821946郑文莲鳞科鱼类的嗅觉器官及其在分类上的意义J热带海洋,1987,611117FISHELSONCOMPARATIVEMORPHOLOGYANDCYTOLOGYOFTHOLFACTORYORGANSINMORAYEELSWITHREMARKSONTHEIRFORAGINGBEHAVIORJANATOMICALRECORD,1995,24344034128王艺磊,张子平,郑微云黑鲷嗅上皮的超微结构J台湾海峡,199
6、4,1321291329EVANSRE,ZIELINSKIB,HARATJDEVELOPMENTANDREGENERATIONOFTHEOLFACTORYORGANINRAINBOWTROUTJCHEMORECEPTIONINFISHES,1982,1537410MMTHEWSJA,KFIEKALJANMBIOEHEMJ1988,169202511SDANM,EDUARDEJBIOCHEMBIOPHYSMETHODSJ1997,3515315912顾红雅,翟礼嘉植物分子生物学实验手册M北京北京高等教育出版社,1988134213杨克强,王跃进,张今今等鱼类嗅觉系统研究J农业生物技术学报,200
7、5,13329429814黄培堂分子克隆实验指南M北京科学出版社,200248751515HAUPTC,TOLNEREA,HEINEMANNU,ETA1BRAINRESJ2006,18123223816SOUTHERNEMDETECTIONOFSPECIFICSEQUENCESAMONGDNAFRAGMENTSSEPARATEDBYGELELECTROPHORESISJMO1BIO1,1975,9850351717ENGLERBLUMG,MEIERM,FRANKJ,ETA1REDUCTIONOFBACKGROUNDPROBLEMSINNONRADIOACTIVENORTHERNANDSOUTH
8、ERNBLOTANALYSESENABLESHIGHERSENSITIVITYTHANPBASEDHYBRIDIZITIONJANALYTBIOEHEM,1993,21023524418刘垣,郑文杰,赵卫东等转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立J口岸卫生控制,2005,104101219陆小平,周文军,小岛峰雄地高辛标记探针在SOUTHERN杂交分析中的技术要点J生物学通报,2003,381525320闫新甫,李润植,苗泽伟等转基因植物M北京科学出版社,200315419321祝梅香,邹星,沈沽等转人组织蛋白酶K基因小鼠的SOUTHERN杂交鉴定J中国比较医学杂志,2005,151
9、404222刘成武,张西臣,李建华等犬贾第虫端粒重复序列的SOUTHERN印迹杂交分析J中国病原生物学杂志,2008,3318318523杨克强,王跃进,张今今等用限制性酶切和SOUTHERN杂交对葡萄无核基因分子标记的分析J,农业生物技术学报,2005,13329429824马小波,王芙蓉,张传云等多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定J棉花学报,2008,20191325陈昆松,李方,徐昌杰等改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取J遗传,2004,26452953126陈德富,陈喜文现代分子生物学原理与技术M北京科学出版社,2006158165毕业论文文献综述海洋生物资源与环境
10、鱼类嗅觉基因的SOUTHERN杂交分析研究摘要采用地高辛标记探针的SOUTHERN印迹杂交技术来检测鱼类嗅觉各族基因的基因拷贝数。关键词嗅觉器官；构造；功能；嗅觉基因；地高辛；SOUTHERN杂交鱼类的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊构成，鱼类嗅觉器官的进化与发展也经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的过程。鱼类的嗅觉器官在鱼类的生活中，诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上发挥着重要的作用。SOUTHERN印迹杂交技术是检测特定DNA片段的常规方法之一，其操作程序繁琐，对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需要反复摸索。1鱼类嗅觉系统的
11、研究11鱼类嗅觉器官的形态和功能111鱼类鼻孔的类型多数的鱼类都具有2个鼻孔，即前鼻孔和后鼻孔，前鼻孔是进水孔，后鼻孔是出水孔，凭借前后鼻孔控制水流的进出。也有少数鱼类只有1个鼻孔，如绵鲥ZOARCES、狮子鱼LIPARIS、慈鲷鱼科CICHLIDAE鱼类等，这可能是在其演化过程中后鼻孔退化并逐渐消失造成的有些则是因为前后鼻孔愈合成为1个鼻孔，如刺鱼属GATEROSTEUS。还有些鱼类没有鼻孔，例如绒科鱼类HALFBEAKS，其鼻腔只是一开放的凹坑。112鱼类鼻腔的形态结构鼻腔又称嗅腔，每个鼻腔都通过鼻孔与外界相通。一些硬骨鱼类还具有与嗅囊相连通的附属囊，它在鼻腔内的数量和位置因种而异有些种类
12、只具有一个附属囊，位于鼻腔的背面、后面或腹面，例如大西洋鲭SCOMBERSCOIBBFHS有些则具有2个附属囊，分别位于背面和腹面，例如淡水石首鱼APLODINOTUSGRUNNIENS、舌齿鲈DICENTRARCBUSLABRAX、黑口新缎虎鱼NEOGOBIUSMELANOSTOMUS等。附属囊在鱼体中主要起泵的作用，控制外界水流进出鼻腔。113鱼类嗅囊的形态结构嗅囊是1对内陷的构造由嗅囊膜、嗅轴和嗅板组成。嗅囊多开口于头部背前方，以外鼻孔与外界相通。嗅板由2层嗅觉上皮中间夹一基质层或称固有膜构成，基质内有结缔组织、血管和成束的神经轴突组成的无髓神经纤维，无髓神经纤维末端与嗅球相连嗅板上皮细
13、胞主要由纤毛非感觉细胞、纤毛感觉细胞支持细胞和基细胞等组成。鱼类对于嗅觉的感受，主要是通过分布于嗅板上的感觉细胞来完成。在嗅板上，纤毛感觉细胞和微绒毛感觉细胞占据的嗅板区称为感觉区，纤毛非感觉细胞或无纤毛的区域可称为非感觉区。114鱼类嗅觉器官的生理功能（1）摄食鱼类摄食主要靠嗅觉和味觉，但二者分工不同，嗅觉主要负责远距离地识别和搜寻食物的气味嗅觉对深海鱼类以及杂食性鱼类尤为重要，特别是底层鱼类和一些在夜间进行捕食的肉食性鱼类如鲨类、鳐类和江鳕。通常认为多数鱼类的嗅觉对氨基酸敏感，且不同鱼类的嗅觉的敏感性不同。（2）警报一些鱼类可以通过识别和躲避捕食者的气味，来发现和躲避潜在的捕食者，如一种太
14、平洋鲑ONCORHYNCHUSSP在溯河洄游时能够躲避捕食者的捕食，因为捕食者皮肤沾过的水中溶有L一丝氨酸LSERINE，而L一丝氨酸对太平洋鲑可能有忌避作用。（3）生殖鱼类在性成熟时都能产生性信息素SEPHEROMONES，它们向同类发出信息，这些信息素可以被嗅觉系统感受，嗅觉在鱼类的求偶和繁殖等活动中起着相当重要的作用，如金鱼的嗅觉器官切除后就无法进行繁殖活动。（4）集群嗅觉信息物质对于调节同种鱼类的集群有着重要的作用，鱼类集群活动中与嗅觉功能有关的行为活动是亲缘识别。如云斑鲴ICTALURUSNEBULOSUS集群生活并且能识别同种个体身体的气味，云斑鲴的社群等级行为和领域行为也是依靠气
15、味来实现的，云斑鲴的代谢产物及信息素在调节它的社群行为中起着重要的作用。12鱼类嗅觉基因的研究目前在我们实验室已在大黄鱼中鉴定出2个家族的嗅觉受体基因（OR），共100多个基因。为了估计每个家族基因在大黄鱼基因组当中的拷贝数，于是，我们采用SOUTHERNBLOT的方法估计所获得的嗅觉基因在基因组中的拷贝。2地高辛标记探针SOUTHERN杂交21地高辛探针的标记和使用211探针的标记方法标记方法有缺口平移法、末端标记法、随机引物法和聚合酶链反应法PCR等。SOUTHERN杂交探针的制备一般用随机引物法，模板量应达到LUG以上，模板量不足1UG，可适当延长37温育时间。当模板序列已克隆在载体上而
16、且多克隆位点附近有特异引物时。可以用PCR法制备探针。杨克强等采用PCR法制备探针，发现比用KLENOW酶随机标记探针效率要高，而且省时。SOLANAS等的研究表明，用地高辛标记探针最好的方法是使用PCR法，同时也提出如果模板DNA量足够多，用随机标记法也可以达到满意效果，上述观点在本实验室也得到验证。PCR法制备探针时有时会出现非特异条带，从而降低了探针的特异性，故在用地高辛标记探针之前，一定要对PCR条件进行优化以保证标记探针的特异性。212探针最适工作浓度探针的最适工作浓度要根据不同特定实验来确定，探针浓度过低则杂交信号较弱；太浓则会产生一些非特异性背景。在杂交袋中杂交需要02MLCM2
17、的杂交液；使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积，约01MLCM2。22DNA样品的准备221DNA的量不管是基因组还是DNA限制性内切核酸酶消化产物，目的基因必须达到一定浓度。一般需要10UGDNA样品，如果样品中目的基因含量较高，可以按比例减少DNA用量。在做转基因植物分子检测时，常常发现PCR检测为阳性，而SOUTHERN检测为阴性，其原因在于转基因植株的材料往往较少，或在转基因植物的基因组中目的基因的拷贝数较低，致使常规的基因组用量不能满足SOUTHERN杂交的需要，此时可加大基因组的用量。222判断是否完全消化取适量的基因消化产物和未消化基因组进行预电泳，若消化产物呈弥散状，位置较
18、未消化基因组低，且在最上方没有出现很明显的条带，则说明消化充分。在选酶时应尽量避免星号活性。双酶切时，应优先选择有相同反应缓冲液的酶，或者在同一种反应缓冲液中活性接近的酶；在进行双酶切前，用每一种酶进行单独酶切，以判断每种酶在选用的反应缓冲液中的活力。酶切体积较大时，可以在消化结束后用无水乙醇沉淀浓缩DNA片断。消化后的DNA样品保存在4加样前56水浴23MIN，以破坏突出黏性末端可能形成的任何碱基对。23转移及固定231转移方法将DNA片段从凝胶转移至固相支持物有5种方法。即向上毛细管转移法、向下毛细管转移法、同时向两张膜转移、电转法、真空转移。经典的凝胶转膜方式为SOUTHERN提出的向上
19、转移法，其操作简便，然而在转移过程中，由于凝胶受压、脱水而变薄，凝胶的孔径变小，转移效率下降向下转移法克服了上述缺点，转移效率有所提高。根据经验，当目的基因的含量较低或转移基因组时，采用向下转移法能提高转移效率和检测信号的强度。232固定方法有3种方法可以将DNA样品固定于膜上，即真空烘烤、微波炉固定、紫外交联。紫外交联法快速、方便，大多实验室采用该法。进行紫外交联时，要避免膜被过量照射，照射的目的是使DNA的一小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团形成交联，过量的照射将导致大部分胸腺嘧啶共价结合，继而降低了胸腺嘧啶残基与氨基基团的交联。照射时应该使膜上带有DNA的面朝向紫外光源。24杂
20、交最适温度、反应时间根据所选择的预杂交液确定杂交温度，选用STANDARDBUFFER时，杂交温度控制在6568；STANDARDBUFFER中加入50FORMAMIDE或选用HIGHSDSBUFFER时，杂交温度控制在3742。在满足温度条件的情况下，杂交的成败取决于杂交时间，时间过短则杂交不充分；时间过长则可能导致非特异结合增多。杂交时间一般控制在20H左右。25祛除背景的方法利用地高辛标记探针进行SOUTHERN杂交时，最常见的问题是高背景，以下2种措施可降低背景1适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；2控制地高辛抗体的浓度。SOLANAST认为使用足够量的地高辛抗体以获得较好的杂交信号
21、，但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。一些杂交试剂盒说明书提到EB对背景有一定的影响。但是SOLANAS认为EB对背景的影响不大，SOLANAS亦采用不同量的多种DNA上样缓冲液，发现其对背景影响不大。26杂交膜的选择与保存杂交膜有3种尼龙膜、硝酸纤维素膜和PVDF膜。尼龙膜是一种较为理想的核酸固相支持物，有多种类型，其结合能力、温度适应性、韧性比硝酸纤维素膜都强，是最常用的杂交膜。硝酸纤维素膜与DNA和RNA尤其是小片段核酸结合能力相对较弱，膜较脆，易破碎。PVDF膜的性能介于尼龙膜、硝酸纤维素膜之间。杂交膜用TE漂洗2次后封存，膜干燥或久置后，信号将会有所减弱或褪色，但经TE润湿
22、后仍然会重现原有的杂交信号。参考文献1陈星玉,中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821942孟庆闻,殷名称鳐类和银鲛类嗅觉器官的研究J水产学报,1981,532092143孟庆闻,殷名称鲨类嗅觉器官的研究C鱼类学论文集,北京科学出版社,19812012094孟庆闻,苏锦祥,李婉端鱼类比较解剖C鱼类学论文集,北京科学出版社,19873273345陈星玉中国鲤科鱼类嗅觉器官的研究J动物分类学报,1988,1321821946郑文莲鳞科鱼类的嗅觉器官及其在分类上的意义J热带海洋,1987,611117FISHELSONCOMPARATIVEMORPHOLOGYANDCYTO
23、LOGYOFTHOLFACTORYORGANSINMORAYEELSWITHREMARKSONTHEIRFORAGINGBEHAVIORJANATOMICALRECORD,1995,24344034128王艺磊,张子平,郑微云黑鲷嗅上皮的超微结构J台湾海峡,1994,1321291329EVANSRE,ZIELINSKIB,HARATJDEVELOPMENTANDREGENERATIONOFTHEOLFACTORYORGANINRAINBOWTROUTJCHEMORECEPTIONINFISHES,1982,1537410MMTHEWSJA,KFIEKALJANMBIOEHEMJ1988,16
24、9202511SDANM,EDUARDEJBIOCHEMBIOPHYSMETHODSJ1997,3515315912顾红雅,翟礼嘉植物分子生物学实验手册M北京北京高等教育出版社,1988134213杨克强,王跃进,张今今等鱼类嗅觉系统研究J农业生物技术学报,2005,13329429814黄培堂分子克隆实验指南M北京科学出版社,200248751515HAUPTC,TOLNEREA,HEINEMANNU,ETA1BRAINRESJ2006,18123223816SOUTHERNEMDETECTIONOFSPECIFICSEQUENCESAMONGDNAFRAGMENTSSEPARATEDBYG
25、ELELECTROPHORESISJMO1BIO1,1975,9850351717ENGLERBLUMG,MEIERM,FRANKJ,ETA1REDUCTIONOFBACKGROUNDPROBLEMSINNONRADIOACTIVENORTHERNANDSOUTHERNBLOTANALYSESENABLESHIGHERSENSITIVITYTHANPBASEDHYBRIDIZITIONJANALYTBIOEHEM,1993,21023524418刘垣,郑文杰,赵卫东等转基因油菜地高辛标记DNA探针杂交检测方法的建立J口岸卫生控制,2005,104101219陆小平,周文军,小岛峰雄地高辛标记探
26、针在SOUTHERN杂交分析中的技术要点J生物学通报,2003,381525320闫新甫,李润植,苗泽伟等转基因植物M北京科学出版社,200315419321祝梅香,邹星,沈沽等转人组织蛋白酶K基因小鼠的SOUTHERN杂交鉴定J中国比较医学杂志,2005,151404222刘成武,张西臣,李建华等犬贾第虫端粒重复序列的SOUTHERN印迹杂交分析J中国病原生物学杂志,2008,3318318523杨克强,王跃进,张今今等用限制性酶切和SOUTHERN杂交对葡萄无核基因分子标记的分析J,农业生物技术学报,2005,13329429824马小波,王芙蓉,张传云等多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定
27、J棉花学报,2008,20191325陈昆松,李方,徐昌杰等改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取J遗传,2004,26452953126陈德富,陈喜文现代分子生物学原理与技术M北京科学出版社,2006158165本科毕业设计（20_届）鱼类嗅觉基因的SOUTHERN杂交分析研究目录1引言12材料与方法121材料1211原料与试剂1212主要仪器2213主要试剂及其配制222方法2221实验动物的采集2222大黄鱼基因组DNA提取3223基因组DNA电泳检测及其浓度测定3224基因组DNA的酶切及电泳检测后回收3225地高辛探针制备3226电转法转膜4227预杂交及杂交5228
28、杂交膜的洗脱5229杂交膜的显色52210拍照并记录53结果和分析531RNA提取与RTPCR532大黄鱼基因组DNA提取与限制性内切酶的酶切633大黄鱼嗅觉受体基因SOUTHERNBOLT74讨论85结论9致谢9参考文献10摘要鱼类的嗅觉器官是其重要的化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊构成，鱼类嗅觉器官的进化与发展也经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的过程。鱼类的嗅觉器官在鱼类的生活中，诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上发挥着重要的作用。本研究主要利用SOUTHERN印迹杂交技术检测本实验室已经鉴定出2个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷
29、贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。关键词大黄鱼；嗅觉受体基因；SOUTHERNBLOT；拷贝ABSTRACTTHEOLFACTORYOFFISHISONEOFTHEIMPORTANTCHEMICALSENSORS,ITFORMSBYTHENOSTRILS,THENOSEANDTHESMELLOFTHESACINNASALOLFACTORYORGANS,FISHEVOLUTIONANDDEVELOPMENTALSOEXPERIENCEDAPROCESSFROMLOWTOHIGH,FROMTHESIMPLETOTHECOMPLEXTHEOLFACTORYOFFISHPLAYEDAN
30、IMPORTANTROLEINTHELIFEOFFISH,SUCHASFEEDING,FOOT,REPRODUCTIVEANDCLUSTERBEHAVIORTHISRESEARCHMAINLYUSETHESOUTHERNIMPRINTINGHYBRIDTECHNOLOGYTESTINGDISTRIBUTIONOFTWOFAMILYOLFACTORYRECEPTORGENEORINTHEGENOMEWHICHHASIDENTIFIEDINLABORATORY,ANDPREDICTINGCOPYSOFOLFACTORYGENE,FORTHEPURPOSEOFPROVIDINGTHEORETICAL
31、FOUNDATIONINORDERTOUNDERSTANDTHEOLFACTORYMOLECULARANDPHYSIOLOGICALOFTHELARGEYELLOWCROAKERKEYWORDSLARGEYELLOWCROAKEROLFACTORYGENESOUTHERNBLOTCOPYS1引言在多彩的生物界中，各种动物都具有丰富的化学感受器官，如视觉、嗅觉、味觉和触觉。其中嗅觉是动物感受外界气味、寻觅食物、与同类联络的重要器官1。其发展经历了一个由低级到高级、由简单到复杂的进化过程。其中脊椎动物的嗅觉器官与无脊椎动物相比，进化得较为完善，结构也较复杂。而对于鱼类来说，它们的嗅觉器官是其重要的
32、化学感受器之一，由鼻孔、鼻腔和位于鼻腔内的嗅囊OLFACTORYSAC构成，在鱼类的生活诸如摄食、御敌、生殖和集群等行为上起着主要的作用24。嗅觉器官作为鱼类的重要化学感受器，可以感受的刺激十分广泛，如食物的气味、地理位置和同类的识别等。对嗅觉和神经细胞生理机制的深入研究，具有重要的理论和实际意义一方面可以探讨嗅觉神经生物学、同源器官间的形态进化、嗅觉器官的功能形态学和化学信号的识别等基本理论问题；另一方面对于人工养殖的嗅觉灵敏鱼类，可以设计高效低廉的饲料配方，从而直接服务于生产57。SOUTHERN杂交是分析基因结构或检测DNA中是否含有特定序列的有效技术之一。其原理是DNA经过标准琼脂糖电
33、泳按分子大小分离，再经原位变性，从胶上转到固相支持物上。附于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影或加入相应的显色剂等可以确定与探针互补的条带位置。该方法是对转基因植株进行分子生物学鉴定的非常经典的方法，能在DNA水平上检测外源基因是否转入并整合到植物染色体上。SOUTHERN杂交中探针有同位素标记或非同位素标记，其中非同位素标记系统主要有地高辛标记系统和生物素标记系统。地高辛标记系统与生物素标记系统两者相比，由于地高辛一般不存在生物体中，消除了内源性背景，因而应用更为广泛。随着化学发光底物的运用与不断的改进，地高辛标记系统灵敏度也在不断增强，
34、甚至超过放射性同位素标记系统，因而大多数实验室已将此项技术运用在转基因，分子杂交等研究方面89。但是其操作程序繁琐，对基因组DNA的提取、纯化、酶切等均有较高要求，要获得理想杂交结果需要反复摸索。本研究主要利用SOUTHERN印迹杂交技术10检测本实验室已经鉴定出的大黄鱼两个家族的嗅觉受体基因（OR）在基因组中分布情况，同时预测嗅觉基因在基因组的拷贝数，旨在为了解大黄鱼的嗅觉分子生理提供理论基础。利用地高辛标记探针进行SOUTHERN杂交时，最常见的问题是高背景，以下两种措施可降低背景1适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；2控制地高辛抗体的浓度。SOLANAST认为使用足够量的地高辛抗体以获
35、得较好的杂交信号，但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。一些杂交试剂盒说明书提到EB对背景有一定的影响。但是SOLANAS认为EB对背景的影响不大，SOLANAS亦采用不同量的多种DNA上样缓冲液，发现其对背景影响不大1112。2材料和方法21材料211原料与试剂1大黄鱼2工具酶AECOLIITAKARA公司BHINDIIITAKARA公司C蛋白酶KTAKARA公司DTAQTM酶TAKARA公司3主要化学试剂A60BPDNAMAKERTAKARA公司B100KBDNAMAKERTAKARA公司CNAOH上海生物工程公司DMALEICACID上海生物工程公司EEB上海生物工程公司FHCL
36、上海生物工程公司G琼脂糖上海生物工程公司HTRISCL上海生物工程公司INACL上海生物工程公司JEDTA上海生物工程公司212主要仪器（1）台式离心机MICROCL17，THERMO（2）电子分析天平（上海科达测试仪器厂）（3）DYY11B电泳仪（北京市六一仪器厂）（4）分子杂交炉（上海实验仪器厂有限公司）（5）涡旋振荡器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）（6）PCR仪（MASTERCLERPERSONAL，EPPENDORF）（7）凝胶成像系统（UVP，W/VISIONWORKS）213主要试剂及其配制1洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）01M马来酸（MALEICACID），015MNAC
37、L；加NAOH调PH至75（20OC），加03V/VTWEEN20，121OC灭菌30MIN，室温保存。2马来酸缓冲液（MALEICACIDBUFFER）01M马来酸（MALEICACID），015MNACL；加NAOH调PH至75（20OC），121OC灭菌30MIN，室温保存。3检测缓冲液（DETECTIONBUFFER）01MTRISHCL，01MNACL；调PH至95（20OC），121OC灭菌30MIN，室温保存。4碱性转移缓冲液04MNAOH，1MNACL；室温下容量瓶定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。5中和缓冲液05MTRISHCL，1MNACL；室温下容量
38、瓶定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。65TBE溶液TRIS40MM，硼酸40MM，EDTA1MM；室温下定容至1000ML，室温保存。720SSC溶液30MNACL，03M柠檬酸钠；室温下定容至1000ML，121OC灭菌30MIN，室温保存。22方法221实验动物的采集2010年9月采集于浙江省宁波市象山西沪港水产养殖育苗中心，共10条，70OC冰箱保存待用。222大黄鱼基因组DNA提取1用灭过菌的小剪刀剪取大黄鱼背上的肌肉组织于研钵（已灭菌，加有液氮）中，并不断加入液氮，用研杵研磨至粉末状；2研磨充分后转入20ML管中，用分析天平迅速称取1G组织粉末于每管，称取2管；
39、3在超净工作台上，向每管加入15ML的组织裂解液，然后再各加入500L的蛋白酶K；将管子用保鲜膜裹紧，侧置于摇床中酶解4H；4向酶解后的组织液中各加入15ML的苯酚氯仿混合液，混合均匀，12,000RPM，4OC离心10MIN；5取上清液，移至新的管中，加入145ML氯仿，充分混匀，12,000RPM，4OC离心10MIN；6取上清液，加入15ML的无水乙醇（20OC预冷），轻轻混匀，这时已可见白色絮状沉淀（即DNA），12,000RPM，4OC离心10MIN；7倒掉上清液，向管中加入1ML70乙醇（20OC预冷），混匀，12,000RPM，4OC离心10MIN，倾去上清液，在超净工作台中晾干
40、DNA；8待干燥后，用少量无菌水溶解，待其溶解后，用移液枪轻轻地将其吸出注入到EP管中放在20OC冰箱中冷冻保藏。223基因组DNA电泳检测及其浓度测定1制电泳胶称取015G的琼脂粉，将其倒入锥形瓶；再量取15ML1TAE加入到锥形瓶，用微波炉稍稍加热溶液，使琼脂粉溶解；待溶液冷却后，用移液枪加入1L的EB到溶液中，振荡混匀，然后将其倒在座胶器上（以上是制作1，15ML的胶；全过程要带EB手套，注意选择合适的座胶器以及梳子）；2电泳检测将DNA从20OC冰箱中取出置于冰上，用移液枪分别吸取3LDNA溶液与1L6LOADINGBUFFER，混匀后点样，设定电泳仪电压为80V，跑60MIN，电泳结
41、束后，使用凝胶成像系统观察基因组DNA提取的质量，并拍照；3使用DNA浓度检测仪测定所提取的DNA的浓度。224基因组DNA的酶切及电泳检测后回收先制备如下体系，将体系置于水浴锅（37OC）中酶切过夜试剂HINDIII试剂ECOLII体积/LHINDIII10MBUFFERECOLII10HBUFFER12DNA无菌水DNA无菌水1GUPTO201制备一定浓度的电泳胶（1，30ML）；2将酶切过夜后的基因组DNA溶液作为样品，从冰箱中取出DNAMAKER和6LOADINGBUFFER，用移液枪分别吸取3LDNA溶液与1L6LOADINGBUFFER，混匀后点样，DNAMAKER单独点一个样，设
42、定电泳仪电压为80V，跑50MIN，电泳结束后，使用凝胶成像系统观察酶切的质量，拍照；3DNA回收向酶切DNA溶液中加入4L的DNAMATE溶液，混合均匀，再加入25倍体积的无水乙醇（20OC预冷），充分混匀；12,000RPM，4OC离心15MIN；弃溶液，加入70乙醇（20OC预冷）1ML，轻轻上下颠倒洗涤，12,000RPM，4OC离心5MIN后弃去乙醇，真空干燥；最后用适量的无菌水溶解，置于20OC冰箱中冷冻保藏。225地高辛（DIG）探针制备1总RNA的提取TRIZOL法提取A提取组织RNA时，每50100MG组织用1MLTRIZOL试剂对组织进行裂解；B将上述组织的TRIZOL裂解
43、液转入EP管中，在室温1530OC下放置5MIN；C在上述EP管中，按照每1MLTRIZOL加02ML氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15S，在室温下（15OC30OC）放置23MIN后，12,000RPM（2OC8OC）离心15MIN；D取上层水相置于新EP管中，按照每1MLTRIZOL加05ML异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15OC30OC）放置10MIN，12,000RPM（2OC8OC）离心10MIN；E弃上清，按照每1MLTRIZOL加1ML75乙醇进行洗涤，涡旋混合，7,500RPM（2OC8OC）离心5MIN，弃上清；F让沉淀的RNA在室温下自然干燥，然后用RN
44、ASEFREEWATER溶解RNA沉淀。2反转录将反转录用的引物、DNTPMIXTURE、模板RNA混合65OC、5MIN后4OC添加5PRIMESCRIPTTMBUFFER和PRIMESCRIPTTMRTASE30OC、10MIN；42OC、1530MIN；95OC、5MIN后4OC。3RTPCR将反转录反应液的一部分作为模板，进行PCR反应。温度时间循环94OC94OC5565OC72OC1MIN30S30S1MIN/KBP30CYCLES30CYCLES30CYCLES4切胶回收A琼脂糖电泳，将特异电泳带用灭过菌的刀片切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；B按照每100MG加400L的量
45、加入BINDINGBUFFER，放入到EP管振荡器中，45OC55OC温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5MIN）；C取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2MIN，8,000RPM离心1MIN，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；D加500L的WASHBUFFER至柱中，8,000RPM离心1MIN。弃管中的溶液；E重复操作4步的操作一次，最后将纯化柱放入EP管中10,000RPM离心30S，除去痕量的WASHBUFFER；F将纯化柱放入一个新的EP管。加3040L无菌水或ELUTIONBUFFER至纯化柱膜的中央，在37OC或50OC下放置2MIN，10,000RPM离心
46、1MIN洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在20OC冰箱保存。5地高辛标记探针A加入1G的模板DNA（TEMPLATEDNA）到16L的无菌水中；B将装有DNA的EP管放入热水中煮沸10MIN后迅速插入冰中，使其变性；C加入4L的DIGHIGHPRIME到已变性的DNA中，轻轻混匀，37OC培养1H；D加热混合液到65OC，维持10MIN，结束反应。226电转法转膜1AGROSE电泳将酶切回收好的DNA样品电泳（电泳胶不加EB），设定电泳仪电压为70V，跑120MIN；2电泳结束后，将电泳胶放入干净的培养皿中；先用适当体积的04M的HCL处理15MIN，然后再用适当体积的碱性转移缓冲液浸泡（
47、210MIN），期间在水平摇床上轻轻振荡，使DNA充分变性；3以05TBE溶液润洗、平衡电泳胶（210MIN）；4按照电泳胶的大小切滤纸4张，杂交膜一张，连同纤维垫一起用05TBE溶液浸泡平衡；5清洗电转印装置后装板，从负极到正极依次放入纤维垫、2层滤纸、电泳胶、杂交膜、2层滤纸、纤维垫，压紧后别上开关组装成一体，按凝胶转印膜（负极正极）的方向插入转印槽中；6倒入4OC预冷的05TBEBUFFER，放入COOLINGUNIT，80V电转印2H。227预杂交及杂交1起板，将杂交膜转入一玻璃容器，置于烘箱中120OC烤膜30MIN；2预杂交预热一定体积的预杂交液（42OC），将杂交膜轻轻放入杂交管
48、，向管中加入适当体积的预杂交液（10ML/100CM2），在杂交管中预杂交30MIN；3探针变性将装有地高辛标记探针的EP管先在沸水中煮5MIN，然后迅速插入冰中，使其变性；4制备杂交液将变性的探针加入到预热的预杂交液中（35ML/100CM2），混合均匀，避免气泡；5杂交倒掉预杂交液，向杂交管中加入已配好的杂交液，使杂交液浸没杂交膜，在杂交炉中杂交过夜。228杂交膜的洗脱1用2SSC，01SDS洗膜25MIN，1525OC；2用05SSC，01SDS洗膜215MIN，6568OC（杂交炉需提前预热到65OC）。229杂交膜的显色（都是在杂交炉中洗，并且以100CM2杂交膜为例）1用适当体积的
49、洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）洗膜5MIN；2制备一定浓度的封闭液（BLOCKINGSOLUTION）；3用100ML封闭液（BLOCKINGSOLUTION）培养30MIN；4制备一定浓度的抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）；5用20ML抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）培养30MIN；6用100ML洗涤缓冲液（WASHINGBUFFER）洗膜215MIN；7用20ML检测缓冲液（DETECTIONBUFFER）平衡5MIN；8制备显色剂（COLORSUBSTRATESOLUTION）；9将杂交管中液体倒出，将提前准备的显色剂加入到一密闭袋子中，然后再将膜小心地移入袋子，膜杂交的一面朝外，并使显色剂浸没杂交膜。置于暗室显色过夜。附封闭液（BLOCKINGSOLUTION）将10BLOCKINGSOLUTION以110的比例稀释到马来酸缓冲液（MALEICACIDBUFFER）中；抗体溶液（ANTIBODYSOLUTION）先将ANTIDIGOXIGENINAP10,000RPM离心5MIN，以15000稀释在封闭液（BLOCKINGSOLUTION）中；显色剂（COLORSUBSTRATESOLUTION）加入200L的NBT/BCIP到10ML检测缓冲液（DETECTI
