1、本科毕业论文系列开题报告生物技术大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列特征一、选题的背景与意义大黄鱼，隶属于脊索动物门（CHORDATA）、脊椎动物亚门（VERTEBRATA）、硬骨鱼纲（OSTEICHTHYES）、鲈形目（PERCIFORMES）、鲈形亚目（PERCOIDEI）、石首鱼科（SCIAENIDAE）、黄鱼属（LARIMICHTHYS），为暖温性集群洄游鱼类，为传统“四大海产”之一，是我国主要海产经济鱼类之一。大黄鱼肉质较好且味美，含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素，除鲜食和制成特色风味水产品外，还具有药用价值。中医认为，黄鱼有和胃止血、益肾补虚、健脾开胃、安神止痢、益气填精之功效；对
2、贫血、失眠、头晕、食欲不振及妇女产后体虚有良好疗效。但由于过度捕捞以及海洋环境恶化，野生大黄鱼产量急剧下降，大黄鱼养殖因此兴起。然而，近年来，在大黄鱼的人工养殖过程中，出现性成熟提早、病害频繁发生等问题，这些都说明大黄鱼的种质资源出现退化现象。在长期的鱼类病害防治过程中，人们逐步认识到通过鱼类的适应性免疫系统进行病害免疫防治的重要性。由于免疫球蛋白是鱼类适应性体液免疫应答中最主要的介质。免疫球蛋白基本结构是由四肽链组成的，即由二条相对分子量较小的轻链和二条相对分子量较大的重链组成，在免疫球蛋白分子轻链和重链的N端，氨基酸的种类和排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，称为可变区，它赋予抗体以特异性
3、。因此，通过对大黄鱼免疫球蛋白基因的研究对增强大黄鱼免疫力，提高抗病害能力显得尤为重要。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）、课题研究的基本内容随机测序大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库的克隆菌，获得免疫球蛋白重链可变区序列；运用生物信息学进行序列同源性分析，进行系统进化树分析，蛋白质结构预测分析，总结分析其特征。（二）、拟解决的主要问题1大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因的结构分析。2大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列与其他物种相比有何特征。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201011201012查询与论文有关的资料，撰写综述、试验计划。201012201101确定实验方法，熟
4、悉相关软件的应用，翻译外文文献。201103201105进行实验，收集整理实验材料和撰写论文，准备答辩。五、主要参考文献1刘红柏,王荻史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性J动物学报,2006,5235575632刘英,朱平,胡亚关儿童急性B淋巴细胞白血病免疫球蛋白重链可变区基因的分子特征J中华血液学杂志,2004,2519123ZHANGYA,SALINASI,LIJ,ETALIGTAPRIMITIVEIMMUNOGLOBULINCLASSSPECIALIZEDINMUCOSAL大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库菌扩大培养提取质粒EST测序BLAST比对获得目的基因生物信息学分析序列同源性分析系
5、统进化树分析蛋白质结构分析IMMUNITYJNATUREIMMUNOLOGY,2010,118278354王俊相,李玉萍,孔令富,等鱼类免疫系统的研究进展J四川畜牧兽医,2010,729315RUMFELTLL,DIAZM,LOHRRL,ETALUNPRECEDENTEDMULTIPLICITYOFIGTRANSMEMBRANEANDSECRETORYMRNAFORMSINTHECARTILAGINOUSFISHJJIMMUNOL,2004,1732112911396肖凡书,聂品鱼类免疫球蛋白重链基因与基因座的研究进展J水产学报,2010,3410161716287GAMBNDF,SNCHEZ
6、EC,MAGADNMSPRESENCEOFANUNIQUEIGTONTHEIGHLOCUSINTHREESPINEDSTICKLEBACKFISHGASTEROSTEUSACULEATUSANDTHEVERYRECENTGENERATIONOFAREPERTOIREOFVHGENESJDEVELOPMENTALIMMUNOGLOBULINMHEAVYCHAINVARIABLEREGIONSEQUENCEANALYSIS引言大黄鱼（LARIMICHTHYSCROCEA），属于脊索动物门（CHORDATA）、硬骨鱼纲（OSTEICHTHYES）、鲈形目（PERCIFORMES）、鲈形亚目（PERC
7、OIDEI）、石首鱼科（SCIAENIDAE）、黄鱼属（LARIMICHTHYS），俗称黄鱼、黄瓜鱼、黄花鱼等，为暖温性集群洄游鱼类，分布于我国东海、南海和黄海南部，是我国主要海产经济鱼类之一。主要生活在近海的中、下层，分为3个地理种群岱衢族、闽一粤东族和硇洲族。大黄鱼肉质较好且味美，含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素，除鲜食和制成特色风味水产品外，还具有药用价值。中医认为，黄鱼有和胃止血、益肾补虚、健脾开胃、安神止痢、益气填精之功效；对贫血、失眠、头晕、食欲不振及妇女产后体虚有良好疗效。免疫球蛋白（IMMUNOGLOBULIN,IG）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，具有高特异性
8、和高亲和性，普遍存在于哺乳动物的血液、组织和外分泌中1。免疫球蛋白分子的基本结构是由四肽链组成的，即由二条相对分子量较小的轻链（LIGHTCHAIN,L链）和二条相对分子量较大的重链（HEAVYCHAIN,H链）组成，链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的“Y”形的单体分子。在IG分子L链和H链的N端，L链1/2和H链约1/4处区域，氨基酸的种类和排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，称为可变区（VARIABLEREGION,V区），它赋予抗体以特异性2。硬骨鱼类体内主要的免疫球蛋白种类为四聚体的IGM3，其重链基因座的组织形式与两栖动物和哺乳动物的一样，即上百个可变区基因区段（V
9、ARIABLESEGMENT,VH）位于多变区基因区段（CLUSTEROFDIVERSITYSEGMENT,D）的上游，然后是连接区基因区段（JOININGSEGMENT,JH），在3端则是4个恒定区基因区段（CONSTANTSEGMENT,C14）和2个跨膜区基因区段（TRANSMEMBRANESEGMENT,TM12）4。在一个物种内，VH基因显示出广泛的序列多样性，一个物种的VH基因家族数越大，则表明其VH基因的多样性可能越大，产生的免疫球蛋白种类就越多。一直以来，在科学家们的不懈努力下，已经成功突破了大黄鱼网箱养殖、人工繁殖的难关，使大黄鱼人工养殖得到迅猛发展，生产规模逐渐扩大，大黄鱼
10、己成为我国海水网箱养殖数量最大的鱼种之一。但是随着大黄鱼养殖密度的提高、养殖规模的扩大、养殖管理相对滞后以及养殖环境的污染，病害问题也陆续出现，已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。近年来，多方面的研究结果表明长期人工繁殖育种的大黄鱼出现了养殖品系的遗传退化、病危害频生、生长缓慢、性成熟提早、亲鱼个体变小及肉质变差等一系列问题。目前，养殖大黄鱼的主要疾病有病毒病、细菌病和寄生虫病。病害的防治主要使用抗生素。滥用抗生素造成了耐药性增加、药物残留、污染环境等一系列负面影响56。所以从大黄鱼自身的抗病能力入手，通过提高鱼体的自身免疫力来抵御病原微生物的侵袭是一个很好的途径。免疫球蛋白是鱼类适
11、应性体液免疫应答中最主要的介质，其基因结构是免疫球蛋白多样性产生的最根本的原因，它们代表了所能够产生的抗体种类的最少数量。因此，大黄鱼免疫蛋白分子基础研究，相关基因分子特点与功能的研究，不仅可以对以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统有个更深入的了解和认识，也可以为大黄鱼病害防治提供更为明确的理论证明。获得整个基因组的信息有两种途径，一种是源于MRNA的CDNA测序，另一种是全基因组DNA测序。全基因组测序虽然很有效，但耗费资金数额巨大，并且需要有效的计算机软件，有时还需要国际间合作；而CDNA是指用于编码的基因，仅占全部基因组的27，长度为5008000BP，方便克隆和测序，CDNA测序的流程一
12、般是从CDNA文库中随机挑取克隆，然后进行单向测序，产生大量的约300500BP的部分CDNA短序列，即ESTS（EXPRESSEDSEQUENCETAGS）序列。自ADAMS等8在人类基因组计划研究中使用ESTS这一概念以来，ESTS技术已被广泛应用于组织特异性基因表达谱分析、新基因的克隆和基因组序列功能分许等多项研究领域。EST技术是将MRNA反转录成CDNA并克隆到载体构建成CDNA文库后，大规模随机挑选CDNA克隆，对其5或3端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术9。ESTS测序分析目前已经成
13、为大规模获取功能基因的一种最为有效和快捷的研究技术10。本实验通过对大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库进行EST测序及分析，获得免疫球蛋白重链可变区基因序列片段，然后对所得基因进行生物信息学分析。1材料和方法11实验材料111材料80冷藏的大黄鱼肌肉组织CDNA文库质粒。112实验试剂（1）质粒提取溶液I50MMOL/L葡萄糖，10MMOL/LEDTAPH80，25MMOL/LTRISCLPH80，高压蒸汽锅灭菌15MIN，40贮存；（2）质粒提取溶液II02MO1/LNAOH（使用前需要用10MOL/L贮存液稀释），1SDS；（3）质粒提取溶液III5ML冰乙酸，60M15MOL/L乙酸钾，乙酸
14、根终浓度为5MOL/L，钾离子终浓度为3MO1/L，285M1水；（4）异丙醇购于宁波奥博科学仪器有限公司；（5）70的乙醇取70ML的无水乙醇，加入蒸馏水定容到100ML。无水乙醇为AR级，购于宁波奥博科学仪器有限公司；（5）LB液体培养基蛋白胨10G，YEASTEXTRACT5G，NACI5G，氨苄青霉素终浓度100G/ML，PH70，定容到1L，高温高压灭菌30MIN；（6）质粒提取试剂盒，TIANPREP。113主要仪器（1）DYY8B型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；（2）LX100手掌型离心机江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；（3）吉尔森可调精密移液器PEPETMAN法国GILSO
15、N公司；（4）TCL16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂；（5）HZ9211K恒温振荡器太仓市科教器材厂；（6）DELTA320PH计梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；（7）REVCD13863V型超低温冰箱美国REVCD公司；（8）BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机美国SORVALL公司。114主要耗材15ML离心管、各型号枪头、无粉乳胶手套和口罩均购自江苏省通州市南兴申海玻璃仪器厂。12实验方法121细菌扩大培养将带有质粒的大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37振荡培养1216小时，直至长出菌落。122质粒提取常规提取质粒步骤按文献1112进行，再根据本实验室情况加以调整。（1）
16、将菌落接种到96孔板上，每孔中加入1ML的培养物，37过夜，室温培养；3000RPM离心5MIN，弃去上清液，倒置至晾干。（2）加入200L质粒提取液SOLUTIONI，封膜后，用振荡器充分振荡，直到板底无沉淀出现为止，再加入200L质粒提取液SOLUTIONII，用胶带封住口，轻轻反复颠倒5次（切勿剧烈振荡）。（3）然后加入200L冷的质粒提取液SOLUTIONIII，同样用胶带封口，反复颠倒15次。4000RPM离心20MIN，将上清液倒入另一个新的96孔深孔板中。（4）深孔板中每孔加入450L异丙醇，用胶带封牢口，反复颠倒5次，4000RPM离心20MIN，DNA沉淀。（5）弃去上清液，
17、加入600L70乙醇，用硅胶垫封口，充分振荡后，离心4000RPM，5MIN。（6）去掉上清液，重复上一步。（7）晾干，加入30L超纯水用于溶解DNA，20贮存备用。（8）电泳检测。先加入3L溴芬兰，再加入3L质粒。然后将6L液体全部点入加样孔。电压200V，时间20MIN。123EST测序通过对大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库进行随机测序及分析，大规模测序工作由北京华大基因公司完成，使用型号为ABI3730的测序仪进行大规模测序12。采用M13正向引物从CDNA的5端测取，通用引物可以用5DGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA3。测得序列再通过CROSSMATCH软件以及辅以手工处理，
18、剪切去掉载体序列和低质量序列，然后经过BLASTX检索NCBI及SWISSPROT蛋白质数据库，最终获得免疫球蛋白重链可变区基因序列片段。124目的基因的生物信息学分析序列同源性比对和相似性搜索用BLASTN（HTTP/BLASTNCBINLMNIHGOV/）进行，采用DNAMAN软件将其翻译成对应的氨基酸序列；多重序列的比对采用CLUSTALW2（HTTPWWWEBIACUK/TOOLS/MSA/CLUSTALW2/）；采用EXPASY（EXPERTPROTEINANALYSISSYSTEM）中的PROTPARAMHTTP/EXPASYORG/TOOLS/PROTPARAMHTML）分析蛋白
19、质的一级结构，SOPMA（HTTP/NPSAPBILIBCPFR/CGIBIN/NPSA_AUTOMATPLPAGENPSA_SOPMAHTML）分析蛋白质的二级结构，并且使用SWISSMODEL（HTTP/SWISSMODELEXPASYORG/）对蛋白质三级结构进行预测；采用CLUSTALX和MEGA31软件，以邻位相连法（NEIGHBORJOINING）构建进化树等生物信息学方法分析大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列特征。参与同源性比对和构建进化树的物种如下花狼鱼ANARHICHASMINO（EU6270081）、双棘牛鱼BOVICHTUSDIACANTHUS（EU2405843）、条纹
20、婢翁LATRISLINEATA（FJ8647151）、斜带石斑鱼EPINEPHELUSCOIOIDES（GU9886941）、伯氏豚鰕虎鱼PSEUDOTREMATOMUSBERNACCHII（AF3035641）、南极鳕鱼NOTOTHENIACORIICEPS（AF4377391）、乌鳢CHANNAARGUS（EU8225101）、笛鲷LUTJANUSSANGUINEUS（HQ3224941）、硬头鳟ONCORHYNCHUSMYKISS（HQ3224941）、北极红点鲑SALVELINUSALPINUS（AJ0003611）。2结果与分析21大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列测定通过对大黄鱼肌
21、肉组织CDNA全长文库部分序列的EST测定及分析，获得免疫球蛋白重链可变区序列片段，经BLAST在NCBI上查询可得知，得到的是大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因部分序列，长度为422BP，编码117个氨基酸。169位是非编码区，70位出现起始密码子ATG，无终止子。序列如图1所示。图1大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因部分序列22大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列分析221与NCBI数据库中大黄鱼免疫球蛋白重链的比对本实验得到的序列只是大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列的一部分，与NCBI数据库中大黄鱼免疫蛋白重链CDNA完整序列比对后有如下不同，如图2所示。在核苷酸序列比对中发现，在实验序列中，第
22、1924位核苷酸是AAATCGC，第6983位核苷酸是CAATGATCAGACCTG，第92116位核苷酸是GGTTGTTTTTCTCATCCTGTCTATTAA，在第290292位核苷酸序列是ATG，但在数据库序列中，相应位置上的核苷酸都表现为缺少；保守区大体集中在117199位，235289位，294422位。在氨基酸序列比对中发现，本实验获得的序列中，第34位氨基酸是RP，第7位氨基酸是L，第9位氨基酸是V，第1617位氨基酸是NC，第45位氨基酸是Y，第5253位氨基酸是PP，第50位缺少，第55位氨基酸是S，第73位氨基酸是H，第79位氨基酸是E，第116位氨基酸是N；而在数据库中的
23、序列中，第34位氨基酸缺失，第7位氨基酸是R，第9位氨基酸是G，第1617位氨基酸是CW，第45位氨基酸是A，第5253位氨基酸是NY，第50位氨基酸是F，第55位氨基酸是T，第73位氨基酸是T，第79位氨基酸是L，第116位氨基酸是Y。图21核酸序列比对。“”表示该列核苷酸完全一致。图22氨基酸序列比对。“”表示该列氨基酸完全一致，“”和“”表示该列都含有保守氨基酸，其中前者保守性大于后者。图2实验序列与GENBANK中的大黄鱼重链CDNA完整序列的比对222与其他鱼类的同源性的对比通过BLAST（HTTP/BLASTNCBINLMNIHGOV/）将大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列与其它鱼
24、类即上述实验方法中所提及的鱼类免疫球蛋白重链可变区基因序列的序列进行同源性比对13，如表1所示。结果显示，本实验得到的序列与花狼鱼、双棘牛鱼、条纹婢翁、斜带石斑鱼、伯氏豚鰕虎鱼、南极鳕鱼的同源性较高，都有72，与北极红点鲑的同源性较低，只有68。表1大黄鱼与其他鱼类的免疫球蛋白重链可变区基因序列同源性比较登录号基因名称同源性AY1887821花狼鱼ANARHICHASMINOR72EU2405843双棘牛鱼BOVICHTUSDIACANTHUS72FJ8647151条纹婢翁LATRISLINEATA72GU9886941斜带石斑鱼EPINEPHELUSCOIOIDES72AF3035641伯氏
25、豚鰕虎鱼PSEUDOTREMATOMUSBERNACCHII72AF4377391南极鳕鱼NOTOTHENIACORIICEPS72EU8225101乌鳢CHANNAARGUS71HQ3224941笛鲷LUTJANUSSANGUINEUS71HQ3224941硬头鳟ONCORHYNCHUSMYKISS69AJ0003611北极红点鲑SALVELINUSALPINUS68将本实验中得到的序列通过DNAMAN软件将其翻译成对应的氨基酸序列后，采用CLUSTALW2（HTTPWWWEBIACUK/TOOLS/MSA/CLUSTALW2/）进行多重序列的核酸比对和氨基酸比对14，参与比对的物种如实验方
26、法中所述，比对结果如图3所示。图3氨基酸同源性比对图中显示的三种符号，“”表示该列氨基酸完全一致，“”和“”表示该列都含有保守氨基酸，其中前者保守性大于后者。223免疫球蛋白重链可变区基因系统进化树分析系统进化树分析是根据同源性状的分歧来评估物种或分子之间的进化关系15。本实验中以大黄鱼LARIMICHTHYSCROCEA（EU6270081）、花狼鱼ANARHICHASMINO（EU6270081）、双棘牛鱼BOVICHTUSDIACANTHUS（EU2405843）、条纹婢翁LATRISLINEATA（FJ8647151）、斜带石斑鱼EPINEPHELUSCOIOIDES（GU988694
27、1）、伯氏豚鰕虎鱼PSEUDOTREMATOMUSBERNACCHII（AF3035641）、南极鳕鱼NOTOTHENIACORIICEPS（AF4377391）、乌鳢CHANNAARGUS（EU8225101）、笛鲷LUTJANUSSANGUINEUS（HQ3224941）、硬头鳟ONCORHYNCHUSMYKISS（HQ3224941）、北极红点鲑SALVELINUSALPINUS（AJ0003611）的免疫球蛋白重链可变区基因氨基酸序列来构建进化树。如图4所示，主要有两个进化支链，大黄鱼与笛鲷的亲缘关系较近，与硬头鳟、北极红点鲑的关系较远。图4免疫球蛋白重链可变区基因在鱼类中的进化比较。
28、每个节点代表一个分类单元（物种或序列），而物种之间的连线代表物种之间的进化关系。23大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因蛋白质结构分析蛋白质结构分析是通过氨基酸序列结构来推断其一级结构、二级结构、三维结构。通过已获得的大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因的氨基酸序列，在网站EXPASY上进行操作。231一级结构分析蛋白质一级结构（PRIMARYSTRUCTURE），指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。在EXPASY上的PROTPARAM（HTTP/EXPASYORG/TOOLS/PROTPARAMHTML）分析蛋白质的一级结构，检索蛋白质序列理化参数，包括分子数量、理论等电点、氨基酸组成、原子组成、
29、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数和总平均疏水性。本实验中得到的大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列编码的氨基酸有117个，分子量为132078DA，等电点为671，如图51所示。氨基酸组成如图52所示，丝氨酸（SER）含量相对最高，占总量的137，含硒半胱氨酸（SEC）、吡咯赖氨酸（PYL）的含量均无。图51图52图5大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因蛋白质一级结构参数232二级结构分析蛋白质二级结构（SECONDARYSTRUCTUREOFPROTEIN），指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕的方式，是多肽链局部的空间构象。二级结构主要有螺旋、折叠、转角和无规则卷曲四种形式16。本实验中得到的大黄
30、鱼免疫球蛋白重链可变区基因的蛋白质二级结构分析如图6、7所示。其中1，715，2425，3133，4045，6671，7881，8892，100104，114117位的氨基酸是随即延伸链；23，1623，2630，34，3739，4852，60，6365，72，7577，82，87，9398，106112位的氨基酸的构象单元是无规则卷曲；45，3536，4647，6162，7374，8386位的氨基酸的构象单元是转角；6，5359，99，105，113位的氨基酸的构象单元是螺旋。图6大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因二级结构。H代表螺旋，C代表无规则卷曲，T代表转角，E代表随即延伸链。图7大黄鱼免
31、疫球蛋白重链可变区基因蛋白质二级结构中各构象单元所占比例。HH螺旋，占94；TT转角，占1197；EE随即延伸链，占3846；CC无规则卷曲，占4017。233三级结构分析蛋白质三级结构（PROTEINTERTIARYSTRUCTURE），指一条多肽链在二级结构或者超二级结构甚至结构域的基础上，进一步盘绕，折叠，依靠共价键的维系固定所形成的特定空间结构。采用空间结构预测软件SWISSMODEL1719，及模型查看软件WLVIEWERLITE40对获得的大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因空间结构进行预测，图8为空间结构模拟图。图8大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因三级结构3讨论鱼类免疫系统是用于鱼类进行
32、免疫防御的，包括免疫细胞、免疫组织和体液免疫因子三大类20。其中免疫细胞和免疫组织是鱼类免疫系统的基础，是鱼体防止病原侵人最初的防线，而体液免疫因子是作为免疫应答的效应分子对病原直接进行防御的。鱼类的体液免疫包括两个方面一是非特异性免疫因子，主要有溶菌酶、补体、C反应蛋白等体液因子参与；二是特异性免疫因子，主要有免疫球蛋白参与。免疫球蛋白主要存在于血浆中，但在其他组织、某些分泌液和一些体液中也有少量存在，它是机体受到抗原的刺激后才产生的，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原抗体复合物，进而抵制病原体对机体的伤害，使病原体失去致病作用。鱼类免疫球蛋白以两种形式存在，即可溶型和膜结合型，可溶型免
33、疫球蛋白是由B细胞分泌的，主要出现在血液和其他体液中，是一种免疫效应分子；膜结合型免疫球蛋白分子则是嵌入B细胞的细胞膜，以抗原受体的形式存在，通过与辅助分子结合形成B细胞受体复合物。硬骨鱼IGM由重链（IGH）和轻链（IGL）通过二硫键连接在一起形成单体，主要以四聚体形式存在，但是也存在单体和二聚体形式2122。根据重链所带电荷、分子质量以及与单克隆抗体的免疫反应推测硬骨鱼存在不同类型IGH分子以弥补抗体类型的差异在硬骨鱼特异性免疫反应上的缺陷23。免疫球蛋白的多样性非常复杂，除了免疫球蛋白重链和轻链由于恒定区不同而形成不同类型或亚类免疫球蛋白外，重链和轻链可变区的氨基酸组成多样化是决定抗体多
34、样性的重要因素24。基因重排多样性是免疫球蛋白多样化的基础，它依赖于动物基因组水平的多拷贝可变区基因片段（V）、多样化基因片段（D）以及连接区基因片段（J）的选择性重组以及非胚系基因编码碱基序列（N区）的插入来实现，另外，体细胞超突变通过可变区单碱基突变来增加抗体的多样性，基因转换通过功能V基因与假基因的重组来产生不同的免疫球蛋白是抗体多样性产生的又一个重要机制。V区位于重链靠近N端的1/5或1/4处。V区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于V区中氨基酸的种类排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。一条重链和一条轻链的可变区结合形成一个抗原结合部
35、位。可变区的不均一性是存在多种多样抗原结合部位而形成庞大抗体库的结构基础。由此被机体用来启动有效的免疫反应。然而序列的不一致性的发生主要集中分布在一些由510个氨基酸组成的高变区（HYPERVARIABLEREGION,HVR），它们形成与抗原结合的部位。大部分氨基酸的变化发生在每条链上的3个高变区。这些高变区组成了抗体和抗原结合的主要接触残基，并且位于与抗原相互作用的短氨基酸环上。因为高变区是与抗原真正结合的部位，故又称为互补决定区（COMPLEMENTARITYDETERMININGREGIONS,CDRS）。CDR以外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区（FR）。FR的功能
36、为支持CDR，并维持V区三维结构的稳定性，在VH中有4个FR。4小结本实验通过EST测序方法得到大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因部分序列，该序列全长为422BP。经分析得到该序列不具备完整的ORF，第70位出现起始密码子ATG，可编码的氨基酸个数为117个。通过BLAST和CLUSTALW比对后可知其与花狼鱼（ANARHICHASMINOR）、双棘牛鱼（BOVICHTUSDIACANTHUS）、条纹婢翁（LATRISLINEATA）、斜带石斑鱼（EPINEPHELUSCOIOIDES）、伯氏豚鰕虎鱼（PSEUDOTREMATOMUSBERNACCHII）、南极鳕鱼（NOTOTHENIACICEP
37、S）编码的IGM重链可变区序列均有较高的同源性，高达72，说明通过全长测序获得了大黄鱼IGM重链可变区的序列。在与NCBI数据库中大黄鱼免疫蛋白重链CDNA完整序列比对时发现在核苷酸和氨基酸中都有所不同。造成这种差异的原因可能本实验中所得序列是来自大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库，而数据库中的序列来自脾脏，WILSONMR等25的研究中表明鱼类免疫球蛋白的结构不仅在不同的鱼类，甚至同一鱼类的不同部位都有所差异。根据免疫球蛋白重链可变区的蛋白质序列与10种不同鱼类构建系统进化树，说明了大黄鱼免疫球蛋白重链可变区与其他10种鱼类的进化关系，其中大黄鱼与笛鲷的亲缘关系较近，与硬头鳟、北极红点鲑的关系较
38、远。说明了免疫球蛋白重链可变区基因序列还是积累了不少变异，这对物种的进化的影响大小，还有待于进一步研究。随着生物信息学的迅速发展，生物信息学技术已广泛应用于基因的结构分析和功能预测，成为一种常用的试验手段。本研究在已经建立的大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库中获得大黄鱼IGM重链可变区的部分基因序列，并利用生物信息学技术对其编码的氨基酸及结构进行分析，为对IG的研究与应用奠定了基础。参考文献1张福淼,袁金铎,安利国,等鱼类免疫球蛋白多样性产生机制的研究进展J水产科学,2005,24945482周光炎免疫学原理M2版上海上海科学技术出版社,20073RAMS,AZUMIA,MIKIN,ETALDIS
39、COVERYOFANOVELIMMUNOGLOBULINHEAVYCHAINGENECHIMERAFROMCOMMONCARPCYPRINUSCARPIOLJIMMUNOGENETICS,2005574584634杨汉春动物免疫学M2版北京中国农业大学出版社,20035林克冰,周哀,刘家富等海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究J海洋科学,1999,458626林星,肖靓哲大黄鱼弧菌病的诊治J水产养殖,1998,429327SCHULERGDPIECESOFTHEPUZZLEEXPRESSEDSEQUENCETAGSANDTHECATALOGOFHUMANGENESJOURNALOFMOLECULARM
40、EDICINE,1997,756946988ADAMSMD,KELLEYJM,GOCAYNEJD,ETALCOMPLEMENTARYDNASEQUENCINGEXPRESSEDSEQUENCETAGSANDHUMANGENOMEPROJECTSCIENCE,1991,252165116569孙亮先,谢进金,王周英表达序列标签ESTJ泉州师范学院学报自然科学,2002,204757910DELSENYM,COOLEK,RAYNAOLMANDGRELLETFTHEARABIDOPSISTHALIANACDNASEQUENCINGPROJECTFEBSLETTER,1997,40322122411孙
41、晓东,韩立敏,王转等质粒DNA提取方法比较J陕西教育学院学报,2009,252868812王伟,薛良义,李婷等大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库的构建及EST分析J台湾海峡,2010,29218919513吴铁军,梁万文罗非鱼免疫球蛋白M重链基因全长CDNA序列分析J广西农业科学,2009,4081084108714郓崇志,孙曼墨CLUSTALW一蛋白质与核酸序列分析软件J生物技术通讯,2000,21114614915吕宝忠分子进化树的构建J动物学研究,1993,14218619316GEOURJONC,DELAGEGSOPMASIGNIFICANTIMPROVEMENTINPROTEINSECO
42、NDARYSTRUCTUREPREDICTIONBYCONSENSUSPREDICTIONFROMMULTIPLEALIGNMENTSJCABIOS,1995,1168168417ARNOLDK,BORDOLIL,KOPPJ,ETALTHESWISSMODELWORKSPACEAWEBBASEDENVIRONMENTFORPROTEINSTRUCTUREHOMOLOGYMODELLINGBIOINFORMATICS,2006,22,19520118SCHWEDET,KOPPJ,GUEXN,ETALSWISSMODELANAUTOMATEDPROTEINHOMOLOGYMODELINGSERVE
43、RJNUCLEICACIDSRESEARCH,2003,313381338519GUEXN,PEITSCHMCSWISSMODELANDTHESWISSPDBVIEWERANENVIRONMENTFORCOMPARATIVEPROTEINMODELLINGJELECTROPHORESIS,1997,182714272320张永安鱼类免疫组织和细胞的研究概况J水生生物学报,2000,24664865221贾伟章,周秀霞乌鳢免疫球蛋白M重链和免疫球蛋白轻链的克隆与特征分析J华中农业大学学报,2010,129798422YULH,LVYZ,LIXX,ETALDISCOVERYOFANUNUSUALA
44、LTERNATIVESPLICINGPATHWAYOFTHEIMMUNOGLOBULINHEAVYCHAININATELEOSTFISH,DANIORERIOJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,20113525325723HORDVIKI,BERVENFS,SOLEMST,ETA1ANALYSISOFTWOIGMISOTYPESINATLANTICSALMONANDBROWNTROUTJMOLIMMUNOL,2002,3931332124秦立红,张金玉,赵志辉动物免疫球蛋白可变区多样性机制与抗病育种J中国兽医学报,2009,29121645164825WILSONMR,WARRGWFISHIMMUNOGLOBULINSANDTHEGENESTHATENCODETHEMJANNUALREVIEWOFFISHDISEASE,1992,2201221
