1、沙门氏菌及其检验,一、沙门氏菌简介二、案例分析三、检验,沙门氏菌属（Salmonella）是肠杆菌科的一个大属，有2600多个血清型，我国发现的约有100个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中。 本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要病原菌之一。,沙门氏菌及其检验,致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)。
2、,沙门氏菌及其检验,在食品卫生上，认为沙门氏菌所有血清型均对人类存在致病性，因此要求所有食品中均不得检出。,生物学特性1.形态染色特性G-无芽孢杆菌。菌端钝圆，散在，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。,沙门氏菌简介,生物学特性1.形态染色特性2.培养特性需氧或兼性厌氧菌。对营养要求不高，在普通培养基中生长旺盛。胆盐可促进其生长。,沙门氏菌简介,生物学特性1.形态染色特性2.培养特性普通琼脂：圆形、光滑、 无色半透明、中等大小(2 4mm)菌落。鸡白痢、鸡伤寒、猪副伤寒、甲型副伤寒沙门氏菌等只能长成细小菌落。麦康凯琼脂和伊红美兰琼脂（EMB）：菌
3、落无色半透明.琼脂和琼脂：无色半透明、中心黑色或几乎全部黑色（多数菌株）的菌落琼脂：形成蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌株菌落中心带黑色。,沙门氏菌简介,S.typhimurium. HE,Salmonella TyphiSS，无色Salmonella EnteritidisSS，黑色(H2S)Escherichia coli ATCC25922SS，粉红色,3.生化特性沙门氏菌属细菌一般生化特性硫化氢 + 枸橼酸盐利用 d 甘露醇 +尿素酶 - 赖氨酸脱羧酶 + 棉子糖 -靛基质 - 精氨酸双水解酶 （+） 鼠李糖 +M.R. + 鸟氨酸脱羧酶 + 蔗糖 -V-P - 苯丙氨酸脱羧酶 - 卫矛醇
4、 +KCN - 分解葡萄糖产气 + 丙二酸钠 -动力 + 侧金盏花醇 - 明胶（22） -水杨苷 - 氧化酶 - 乳糖 - O/F试验 发酵型 注：+ 阳性；- 阴性；d 有不同的生化型；（+） 迟缓阳性,生物学特性1.形态染色特性2.培养特性3.生化特性4血清学特性沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和包膜抗原 (Vi抗原) 等三种抗原。1）O抗原（菌体抗原）沙门氏菌的O抗原共有65种，以阿拉伯数字1、2、3、4代表凡含有共同O抗原组分的各个血清型划归于一个群。目前有58个血清群。 2）H抗原 63种 3） Vi抗原 为包膜抗原,沙门氏菌简介,生物学特性
5、5、抵抗力沙门氏菌属不耐热，55 1h、60 1530min即被杀死。但在水中、各种食品中以及冷冻条件下存活时间较长。由于沙门氏菌属不分解蛋白质，不产生靛基质，污染食物后无感官性状的变化，易被忽视而引起食物中毒。,沙门氏菌简介,二、案例浅析,原因食品： 主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，其次为禽肉、蛋类、乳类及其制品，由植物性食品引起者很少。 国内报道，猪的带菌率为10.734.8%，鸡的带菌率为2.36.8%，鸡蛋带菌率高达30%。国外，如荷兰报道猪的带菌率在30.1% 以上。 沙门氏菌食物中毒发病率较高，占总食物中毒的4060，最高可达90。,检验 食品中沙门氏菌的检验方法，应按中华
6、人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验方法(GB/ T4789. 42003)进行。主要程序： 前增菌和增菌 分离 生化试验 血清学分型鉴定（O、H、Vi抗原的鉴定） 结果报告,沙门氏菌及其检验,前增菌冷冻的肉类、蛋制品、乳制品等加工食品。方法是将样品25g（mL）用缓冲蛋白胨水（BP）225mL匀浆后于37培养4h。选择性增菌MM（TTB）及SC前增菌后的样品。取10mL加入到100mL选择性增菌液中培养1824h。 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经过加工的食品、病人样品等。可直接取样品25g（mL）用盐水混匀，并用MM（TTB）及SC进行选择性增菌。,细菌分离与菌落挑选 1. 取上
7、述增菌培养物分别划线接种于BS琼脂平板和DHL（或HE或SS）琼脂平板各一个，经37培养1824h（DHL、HE、SS）或4048h（BS），观察菌落形态。2. 挑选可疑菌落35个接种于三糖铁（TSI）琼脂斜面，37培养1824h。,根据三糖铁（TSI）上的反应结果判断斜面 底层 产气 H2S 可能的菌属和种- + +/- + 沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸菌、 变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌+ + +/- + 沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、 普通变形杆菌- + + - 沙门氏菌属、大肠埃希氏菌属、蜂 窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲 登斯菌属- + - - 伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏 菌属、大肠
8、埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚 菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+ + + - 大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏 菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸 杆菌,Triple Sugar Iron agar slant (TSI slant),Use : For the differentiation of members of the Entero-bacteriaceae base on their fermentation of lactose, sucrose and glucose and the productionof H2S.,生化检验结果判断：如果H2S+、KCN-、尿素-、靛基质-、赖氨酸+为
9、沙门氏菌典型反应；若其中尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，仍可判为沙门氏菌；若有2项异常，则判为弗劳地氏柠檬酸杆菌；若靛基质+，应补做甘露醇和山梨醇试验，若均为阳性，则判为沙门氏菌的变异；若均为阴性，则为缓慢爱德华氏菌。若H2S-补做ONPG，ONPG+为大肠埃希氏菌，ONPG-为沙门氏菌。凡临床分离菌乳糖、吲哚阳性或脲酶阳性者，均不考虑为沙门菌。,血清学鉴定 由于引起人和动物发病的沙门氏菌绝大多数分布于AF群中，所以通常只需做AF群O抗原成分和H抗原鉴定即可判定沙门氏菌的血清型。（1）O抗原鉴定：首先用市售A-F多价抗O血清做玻片凝集试验。出现凝集后，再用代表9个O群的O因子血清，逐一检
10、查，以确定待检菌属于哪个O群。 O多价1 A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）O多价2 13，16，17，18，21群O多价3 28，30，35，38，39群O多价4 40，41，42，43群O多价5 44，45，47，48群O多价6 50，51，52，53群O多价7 55，56，57，58群O多价8 59，60，61，62群O多价9 63，65，66，67群,血清学鉴定 （2）H抗原鉴定：一般最好使用63种规格诊断血清中的8个H多价血清来检查，方法类似于O抗原鉴定， （3）Vi抗原鉴定：用Vi因子血清检查。,检验 沙门氏菌的快速检验方法： 1荧光抗体法（以前列入进出口检验专业标准）
11、2E-15快速生化鉴定系统检查法 3噬菌体裂解法 4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）、DNA探针技术、PCR技术等,沙门氏菌及其检验,金黄色葡萄球菌及其检验Examination of Staphylococcus aureus,S. aureus 1000x,S. aureus cells attaching to, and invading, epithelial cells,葡萄球菌,葡萄球菌（Staphylococcus）是引起人类和动物化脓性感染的最重要病原菌，可引起人类丘疹、疖、脓肿、骨髓炎和脑膜炎以及奶牛的乳房炎，又是引起人类食物中毒的最常见细菌之一。 葡萄球菌包括金黄色葡萄球
12、菌（Staphylococcus aureus） 、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)和腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)。引起食物中毒的主要是金黄色葡萄球菌，致病因素是其在食品中繁殖后产生的肠毒素(enterotoxin)，故属于毒素型中毒。 中毒的原因食品主要是乳类、肉类、鱼类及含淀粉高的食物（如剩米饭等），特别是经过加热处理的食品。,1. 形态染色特性 革兰氏阳性球菌，致病性菌株形态较小，呈葡萄串状排列。无芽孢，无鞭毛，一般不形成荚膜。2. 培养特性 兼性厌氧，在普通培养基上生长良好。金黄色葡萄球菌在血平板通常产生金
13、黄色色素，多数溶血。在普通肉汤中培养24h后，均匀浑浊生长；23天后可形成菌膜；老龄培养物管底可有粘稠沉淀物。耐盐性强，在含10 15氯化钠培养基中亦能生长。,一、金黄色葡萄球菌简介,1. 形态染色特性2. 培养特性普通琼脂上：湿润、不透明的中等大小菌落，直径一般为12mm。Baird-Parker氏琼脂上：菌落为圆形、光滑、凸起、湿润，直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一浑浊带，其外层有一透明带。,一、金黄色葡萄球菌简介,菌落完全溶血,Characteristic gold/yellow colonies of penicillin-resistant Staphylococ
14、cus aureus,一、金黄色葡萄球菌简介,葡萄球菌不同菌株在固体培养基产生不同的颜色，从而分为金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌。,Staphylococcus aureus on Mannitol Salt Agar,Staphylococcus epidermidis on Columbia CNA Agar,Staphylococcus epidermidis does not normally produce pigment.,3. 生化特性本菌大多数能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。不产生靛基质，能还原硝酸盐，可凝固牛乳，MR试验阳性，V-P试验不定。多数致病性菌
15、株过氧化氢酶和血浆凝固酶阳性，产生金黄色色素，发酵甘露醇产酸不产气。,一、金黄色葡萄球菌简介,致病性和非致病性葡萄球菌的鉴别,4. 血清学特性葡萄球菌有蛋白质抗原和多糖类抗原。蛋白质抗原为完全抗原，有种属特异性，无型别特异性；存在于葡萄球菌表面，是细胞壁的成分，称为葡萄球菌A蛋白（Staphylo-coccus protein A，SPA）。 多糖类抗原为半抗原，有型特异性，可用来对葡萄球菌进行分型。,一、金黄色葡萄球菌简介,二）葡萄球菌肠毒素 在生长繁殖过程中产生很多毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。葡萄球菌肠毒素（enter
16、otoxin）是一种多肽单链结构的可溶性蛋白质，目前已发现的有A、B、C1、C2、C3、D、E、F共8个型，引起中毒的以A型最多。 葡萄球菌肠毒素耐热，一般烹饪温度不能将其破坏，经100煮沸30min不被破坏，100 60min仍保持部分活性。也不受胰蛋白酶的影响。,一、金黄色葡萄球菌,二、案例分析1.中毒事件 梧州市某大酒店200多名员工于2012年6月11日11时左右，在单位食堂集体进午餐，其中9名员工进食了同事从广州带回的卤鸭食品（封口塑料袋包装），中午13时30分左右，该9名员工中有5名出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，其中3名症状较重的患者到当地医院就珍；其他未食卤鸭食品的员工未出现
17、上述症状。,2.标本采集采集3名到医院就诊的患者肛拭子标本，置C-B运送培养基中保存。 在酒店现场采集患者吃剩的周黑鸭脖、绝味鸭脖、绝味鸭翅共3份可疑食品 3.标本处理 病人肛拭子 把病人肛拭子直接划到选择性平板分离培养后，用生理盐水把肛拭子冲洗稀释，分别接种到各种致病菌增菌培养基中作增菌培养，6-24h后划选择性平板作分离培养。,食品样品则用相应致病菌的增菌液225ml，分别取25g样品作1:10稀释后进行增菌培养，6-24h后划选择性平板进行分离培养。 4.可疑菌落挑选 从所有直接和增菌后接种到各种选择性培养基平板上，沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠埃希氏菌、副溶血弧菌、蜡样芽胞杆菌等均未见
18、生长。挑取在B-P平板上直径在2-3mm，灰黑色、边缘淡色、周围有一混浊带、外层有一透明圈的菌落进行革兰氏染色镜检，并接种至营养琼脂平板纯化后进行生化试验。,5.生化鉴定试验 挑取G+球菌的纯化菌株，接种至脑心浸液肉汤培养24h后，取0.3ml加入兔血浆中混匀，同时做金黄色葡萄球菌标准阳性菌株对照，表皮葡萄球菌阴性菌株对照，置361温箱。经1h后观察，样品菌株和标准阳性菌株的血浆凝固酶均呈现凝固，阴性菌株的血浆凝固酶在6 h内都不出现凝固。 另取样品菌株、阳性菌株和阴性菌株的肉汤菌液分别在2份甘露醇生化管中各滴加3d，分别作需氧和厌氧培养24h，结果样品菌株、阳性菌株均发酵甘露醇，阴性菌株不发
19、酵甘露醇。,6.肠毒素检测 对检出的金黄色葡萄球菌菌株送区CDC检测，肠毒素试验均为阳性，其毒素型均为B型。 7.结论 3份患者的肛拭子标本均检出金黄色葡萄球菌，未检出其它致病菌。3份可疑卤鸭食品中，绝味鸭脖检出金黄色葡萄球菌，未检出其它致病菌。其余2份可疑卤鸭食品未检出致病菌。根据本次病患者的临床表现、潜伏期、流行病学特点，以及实验室病原菌分离及鉴定结果，确认这是一起由金黄色葡萄球菌污染“绝味鸭脖”引起的食物中毒事件 。,一）常规检验（GB/T 4789.10-2003）,二、葡萄球菌检验,取检样进行增菌和分离培养，观察溶血情况，然后挑取可疑菌落做涂片镜检，并进行血浆凝固酶试验。凡形态和菌落
20、特征典型，溶血，血浆凝固酶阳性，即可报告为金黄色葡萄球菌。,二）葡萄球菌致病因子测定 血浆凝固酶试验、耐热核酸酶试验、酸性磷酸酶试验、钼酸铵还原试验和肠毒素检测等 。1、血浆凝固酶实验（血浆凝固酶有助于细菌抵抗宿主体内的吞噬细胞和杀菌物质的作用，同时也是感染局限化。 ） 致病性菌株一般为血浆凝固酶阳性(Coagulase positive )。 检验方法有玻片法、试管法和微管法,二、葡萄球菌检验,二）葡萄球菌致病因子测定 1、血浆凝固酶实验2、耐热核酸酶试验 近年来发现金黄色葡萄球菌产生的核酸酶能耐受煮沸而不被破坏，且其最适pH为9.0，这些特点与其它细菌不同，可作为鉴定方法之一。 （在感染部
21、位的组织细胞和白细胞崩溃时可释放核酸使渗出液粘性增加，核酸酶能迅速分解核酸，利于细菌的扩散 ）3M快速金黄色葡萄球菌数测试片：金黄色葡萄球菌呈红色或蓝色菌落，耐热核酸酶环带显示粉红色。,二、葡萄球菌检验,二）葡萄球菌致病因子测定 1.血浆凝固酶实验2.耐热核酸酶试验3.毒素测定 从食品检样中提取和检测肠毒素采用浓缩法层析法和ELISA法。,二、葡萄球菌检验,致病性（致泻性）大肠埃希氏菌及其检验Examination of diarrheogenic Escherichia coli,德国毒黄瓜事件2011年5月中旬，食用毒黄瓜引起的疫病在德国开始出现。2011年5月30日，德国因食用有毒黄瓜，
22、感染出血性大肠杆菌而死亡的人数已升至14人，目前疫情仍在蔓延。此外，包括瑞典、丹麦、英国和荷兰在内的多个国家均已出现感染病例，欧洲一时陷入恐慌,6月中旬已经造成至少16人丧生和1000多人生病住院，其中400多人病势严重，存在生命危险。,随后，德国指责西班牙黄瓜为罪魁祸首，西班牙黄瓜滞销。,西班牙得以澄清 德国有关实验室对此前已被查出带有EHEC菌的两根西班牙黄瓜进行了进一步化验，结果显示，黄瓜上携带的菌株特性与从德国两名患者粪便样本中分离出的血清型为O104的大肠杆菌并不相符。由此推断，西班牙进口黄瓜上虽然携带EHEC菌，但它并不是引起德国本次疫情的致病原。 西班牙蔬果种植业损失可能将达亿欧
23、元。,引发此次“毒黄瓜”事件的罪魁祸首正是五大致病性大肠杆菌中的EHEC，这种大肠杆菌不仅具有剧毒而且还能抵制多种抗生素。在德国汉堡接受治疗的感染者中有30%的人患上了溶血性尿毒症综合征，该疾病足以导致危及性命的肾脏衰竭。罪魁祸首：芽苗菜是这次疫情传染源头。这家农场已经完全查封。有关机构表示，正在检查其他生产芽苗菜的农场。但迄今，调查人员还没有从任何食物样本中找到病原体肠出血性大肠杆菌O104：H4。,大肠杆菌及其检验,条件性致病菌（opportunistic pathogen） 致病性大肠埃希氏菌 是指能使人、动物(esp.婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。致病性大肠埃希氏菌属
24、主要分为五大类 1、产肠毒素大肠埃希氏菌(ETEC) 2、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(EIEC) 3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC) 4、肠道出血性大肠埃希氏菌(EHEC) O157:H7 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC),致病大肠埃希菌种类,大肠杆菌简介,1形态与染色特性菌体两端钝圆，中等大小，杆状(有时呈卵圆形)；13m X 0.6m；周生鞭毛，能运动；不产生荚膜，无芽孢；革兰氏阴性。有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。,大肠杆菌简介,1形态与染色特性2培养特性1)需氧及兼性厌氧菌2)对营养要求不高3)在普通琼脂平板长成中等大小的菌落。与沙门氏菌菌落较相似。4)在普通肉汤中1824
25、h均匀浑浊，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。能形成菌膜。,大肠杆菌简介,1形态与染色特性2培养特性5）部分菌落可出现溶血。6）远藤琼脂：带金属光泽的红色菌落7）SS琼脂：多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落8）伊红美兰（EMB）琼脂：紫黑色菌落，有的有金属光泽9）麦康凯琼脂：菌落呈红色,一、生物学特性1形态与染色特性2培养特性3生化特性1）可发酵多种碳水化合物产酸产气，不典型菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；2）大多数菌株对赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸有脱羧基作用。3）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素4）不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。此
26、为典型的大肠埃希氏菌特性。,IMViC试验： I：吲哚（靛基质）试验， M：甲基红试验， Vi：V-P试验， C：枸橼酸盐利用试验典型大肠杆菌IMViC试验为+、+、-、-。如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。,一、生物学特性1形态与染色特性2培养特性3生化特性4.血清学特性 大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。1）O抗原本菌已发现有170种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。2）H抗原一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原。H抗原共有64种。,4.血清
27、学特性 3）K抗原 又称包膜抗原。共有103种。新分离的大肠埃希氏菌70具有K抗原。根据耐热性可把K抗原分为A、B、L三类，B抗原与L抗原不耐热，A抗原耐热性强。如：根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式，如O111：K58(B)H12。,一、生物学特性1形态与染色特性2培养特性3生化特性4. 血清学特性 5抵抗力 6毒素特性 有些大肠埃希氏菌产生肠毒素。1）不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：60 30分破坏。可引起肠道分泌增加，出现腹泻。2）耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：100 30分钟仍有活性。可引起肠分泌增加
28、。,中毒典型事例,事例1 日本 1996年7月 大肠杆菌O157: H7型食物中毒9017人中毒，10人死亡原因与生食萝卜苗有关。事例2 中国江苏、安徽等地 2001年大肠杆菌O157: H7食物中毒177人死亡，中毒人数超过2万人。,三、检验检验方法 包括增菌、细菌分离、生化试验、大肠杆菌致病性鉴定（血清学试验、毒素检测等）。致病性大肠杆菌的检验程序 见GB/T 4789.6-2003),三、检验 1. 增菌 2. 细菌分离 3. 生化试验 4. 血清学试验 5. 毒素检测 6. 结果判定与报告,增菌培养1、以无菌操作称取样品25g，加入225mL营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以
29、均质器打碎样品。2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN；其余移入500ml三角瓶中于361培养6h。挑取一环，接种于一管肠道菌增菌肉汤中，42增菌培养18h。,分离培养1、将发酵乳糖阳性管液和增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。2、于361培养1824h观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。,生化试验在鉴别平板上挑取菌落5个以上，分别接种于TSI琼脂，以及pH7.2尿素、蛋白胨水、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶培养基中。经36 培养1824h。TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性、KCN阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。 TSI底层不产
30、酸，或H2S、KCN和尿素酶任何一项阳性的为非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。,血清学试验假定试验：从平板上挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的培养物，用EPEC、EIEC、ETEC三种多价O血清和EHECO157诊断血清做玻片凝集试验。当与某一多价O血清凝集时，再用该多价血清包括的单价O血清分别做试验，出现凝集即为假定试验阳性。证实试验：单管凝集试验 （抗原血清）,肠毒素试验检测和：LT检测方法（双抗体夹心法） ST检测方法（抗原竞争法） 双向琼脂扩散试验检测：乳鼠灌胃试验检测,蜡样芽胞杆菌及其检验Examination of Bacillus cereus,蜡样芽孢杆菌（Bac
31、illus cereus）食物中毒于1950年由Hauge首次报道于挪威，此后欧美许多国家都有陆续报道。本菌引起的食物中毒在我国亦屡有发生。作为一种常见的腐败细菌，该细菌广泛分布于自然界中，极易污染食品。引起中毒的原因食品范围很广，包括肉类、乳类制品、蔬菜、汤汁、豆芽、点心、剩饭等，尤其多见于熟食品。 蜡样芽孢杆菌食物中毒的机制比较复杂，一般认为是由活菌及其产生的肠毒素共同作用所致。,蜡样芽胞杆菌可产生呕吐型和腹泻型两种。 两型均不发热，预后良好。 该细菌为条件致病菌，当食品中细菌含量达到106个/g时，人食入后可导致食物中毒发生。,一、生物学特性,蜡样芽孢杆菌的形态、染色、生化及培养特性与普
32、通培养下的炭疽杆菌极为相似，故又称之为“类炭疽”。1.形态染色特性本菌为革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，短链或长链状排列。无荚膜，芽孢呈椭圆形，位于菌体中央或稍偏于一端。有鞭毛，可运动。,Variations in endospore morphology. (1, 4) Central endospore (2, 3, 5) terminal endospore(6) lateral endospore,一、蜡样芽孢杆菌,2. 培养特性需氧菌对营养要求不高，在普通琼脂培养基上菌落为灰白色、表面粗糙，类似蜡滴状。在血液琼脂上，可形成浅灰色、不透明、扁平、边缘不整齐的毛玻璃样菌落，有-溶血。在
33、甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂上，本菌菌落为粉红色，菌落周围环绕白色轮晕。,B. cereus on sheep blood agar plate,普通琼脂上菌落,MYP上的蜡样芽胞杆菌,一、蜡样芽孢杆菌,3. 生化特性分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨苷和覃糖，不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、肌醇、山梨醇和侧金盏花醇；靛基质阳性；MR试验阴性，V-P试验阳性；不分解尿素；KCN试验阳性；卵磷脂酶阳性；能利用枸橼酸盐；能还原硝酸盐；过氧化氢酶阳性；可液化明胶。,过氧化氢酶（触酶）试验,二、检验,常规检验法： GB/T 4789.14-2003 1、菌数测定 2、证实试验3、动物试验
34、4、血清学试验,1菌数测定 无菌采取检样25g（mL），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液作101105的稀释液，每稀释度各取0.1mL均匀涂布于选择培养基（MYP琼脂），37培养1220h，选择典型菌落数在30个左右者进行计数，蜡样芽孢杆菌在此培养基上菌落为粉红色，周围有粉红色的轮晕。计数后，从中挑出5个典型菌落作证实试验。根据证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数计算出该平皿内的本菌数，然后乘以其稀释倍数，即得到每g（mL）检样中所含蜡样芽孢杆菌的数量。例如，MYP平板上可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，该平板样品稀释倍数为104，则1g（mL）检样中蜡样芽孢杆菌数为： 254/510410=210
35、6,检 样,作成101105的稀释液,选择性培养基 (菌数测定) MYP,选择性培养基(细菌培养)MYP,菌落计数,肉汤培养基营养琼脂培养基,报 告,361 1220h 361 1220h,生长及菌 染色镜检 生化试验 菌株保存落观察,蜡样芽孢杆菌的检验程序,2动物试验 将蜡样芽孢杆菌的24h肉汤培养物0.30.5mL接种于体重1820g 的小白鼠腹腔内。动物于24h内（通常1218h后）死亡。可从死亡小鼠的心脏血液中分离到此菌。也可利用动物做毒素试验，如用家兔肠管结扎法进行肠毒素试验，对猴子或猫采用灌胃法进行呕吐试验，及小白鼠尾静脉注射检测肠毒素等。3. 血清学试验 常用凝集试验检查该菌。也
36、可用反向间接血凝试验或琼脂扩散试验来检测肠毒素。,有毒有害物质筛选实验,1.许来尔氏三管法 此法可预试氰化物、磷化物、硫化物及重金属元素，是目前常用的一种方法。,氰化物,磷化物,硫化物,苦味酸钠试纸条,硝酸银试纸条,乙酸铅试纸条,变红,变黑,变黑,如上述三种试纸条均不变色，说明检材中不含氰化物、磷化物和硫化物。样品中加入洗好的铜片（或铜丝）23片（个），在沸水浴上加热45min，如果铜片（铜丝）变色，示有重金属毒物存在。如果铜片变灰黑色可能含砷，变黑色可能含铋，变灰紫色可能含锑，变银白色可能含汞，需进一步做确证实验。如果铜片（铜丝）不变色说明检材中不含有重金属毒物。,2.检毒管法 检毒管有5种
37、管（3、5、6、8、10号）可直接用于毒物检验。,汞的检测,水俣病事件,1956年发生于日本的由于工业废水排放（含汞）污染造成的公害病。,慢性甲基汞中毒以日本的水俣病最为闻名，1956年日本熊本县水俣湾地区发生甲基汞中毒事件，由于是第一次因环境污染而引起的，故因地而命名。当时中毒死亡41人，以后时有发病，截止到1979年，发病人数1004人，死亡206人。起因是附近的一家化工厂在生产乙醛和氯乙烯的过程中，将作为催化剂的无机汞排放到海水中，通过在鱼体中甲基化后被鱼体进一步浓缩（鱼体中的汞含量达到2040mg/Kg）。当时发病与食用鱼的关系是，不吃的不发病，吃多的早发病，吃少的迟发病。,汞(Mer
38、cury)是一种对人体有害的元素，汞及其化合物均有一定的毒性，汞在常温下的挥发作用和生物浓缩作用，使得汞对环境的污染尤其被人们重视。汞中毒已被列为世界上最严重的公害之一。,汞的自然来源 地壳气体的排出 火山喷发 水自然态中的蒸发人类对汞的使用 氯碱工业 电力工业（燃煤） PVC（聚氯乙烯） 金矿开采 节能灯 电池,（一）汞的来源,（二）汞对食品的污染1. 汞在鱼体内的甲基化 排放到环境中汞主要是无机汞，其次还有有机汞。无机汞对人体毒性不大，但是，一旦当无机汞进入到水体以后，则会通过微生物转化而甲基化，形成甲基汞。,环境中的无机汞,甲基汞,水中微生物作用,甲基化,食物链,人 体,生物浓缩,在水中
39、由无机汞经厌氧菌作用形成。经食物链富集后在鱼体内可形成较高浓度，从而对人体产生有害作用。,甲基化过程不但存在于水底淤泥中的微生物，鱼体表面的微生物也有极强的甲基化作用。 鱼体中的汞主要是甲基汞，甲基汞可占鱼体中汞含量的80%100%。甲基汞由于其脂溶性大，随食品进入到人体后排泄很慢，尤其是进入到脑中后，则很难排出。有人证明，鱼体中的甲基汞用冻干、油炸、煮、干燥等方法均不能除去。,（3）汞对食品的污染（续） 1. 汞在鱼体内的甲基化 2.汞的生物浓缩汞的生物浓缩作用在重金属元素中是最强的。 污染环境的汞，在土壤中通过陆生食物链浓缩；在水体中，可通过水生食物链得到加强，而最终进入到人体中。其中水生
40、食物链的浓缩作用更强。,藻类可将汞浓缩200017000倍，某些水生昆虫可达11700倍；淡水的浮游植物可将汞浓缩1000倍，淡水的无脊椎动物竟高达10万倍。 3. 汞的植物内吸作用 植物的根、茎、叶均可吸收环境中的汞。 植物只可吸收环境中的汞，不能将汞浓缩。,（四）汞对人体的危害,1.汞及其化合物的毒性各种汞化物都有毒，但毒性的大小差别很大，凡在水和稀酸中溶解度大的，其毒性就大。一般来说有机汞的毒性大于无机汞更大于金属汞 。金属汞在肠道的吸收率低于0.01%，因此金属汞基本无毒，但汞蒸气是一种对人体具有剧毒作用的气体，它可通过皮肤和呼吸道被人体吸收。无机汞肠道吸收率不超过15%，硫酸汞毒性最
41、强，硫化汞毒性最小；进入人体后主要蓄积在肾脏，其次为肝脏、脾脏。,甲基汞毒性：有机汞：在有机汞化和物中，甲基汞是毒性最强的。而且在人体内吸收率可达90%以上，进入人体后除蓄积于肾脏、肝脏外，还可通过血脑屏障，进入脑内。甲基汞的生物半衰期较长，在脑中甲基汞半衰期为240天，排出较慢，对人体危害较大。甲基汞还可透过胎盘侵入胎儿体内使胎儿发生中毒；另外，甲基汞对遗传基因的破坏作用也引起了人们的注意。,3.慢性汞中毒摄入微量汞，可排出，不致危害健康摄入高剂量有机汞急性中毒长期微量汞摄入蓄积中毒,汞中毒临床三大症状 神经症状：易兴奋症， 是汞中毒的特有症状， 肌肉震颤 口腔炎,1）神经症状： “易兴奋症
42、”是汞中毒的特有症状，表现为乏力、头痛、记忆力减退、不安、失眠、易激动、无故烦躁、易怒、爱哭等。 2）肌肉震颤： 最初可感觉全身无力，四肢肌肉痉挛或疼痛等。以后则出现震颤，多自手指开始，向上发展至腕、头、上肢或下肢。开始一般为非对称性、无节律的细小震颤，逐渐发展为粗大的意向性震颤。 3）口腔炎： 口中有金属味，流有增多，牙龈酸疼、口干。口唇粘膜、舌部可发生肿胀及溃疡。牙龈红肿、压疼、刷牙时易出血。有时在齿龈边缘形成暗蓝色色素沉着，称为“汞线”。,举例1-美白化妆品警惕汞中毒,美白是全世界的难题，目前还没有一种添加剂能让人既安全又快速达到美白目的，充其量只能减缓色斑生成过程，或者阻断黑色素形成的
43、中间体。而汞被称为“黑色素细胞的毒药”，它能杀死黑色素细胞，让皮肤变白。因此有些美白增白产品，便添加了“黑色素细胞的毒药”，长期使用这种含汞产品会造成人体积累性中毒。,举例 3“汞都”光环背后,贵州万山特区称为中国曾经的“汞都”，一点都不夸张。早在唐宋时期，这里就以盛产朱砂(一种含汞的矿物)、水银(汞的俗称)而闻名。其汞资源储量约为亚洲第一、世界第二，高峰时年产量更是一度占到全国的七成。30年累计上缴税利15亿元，工业产值折合现值达124亿元。,万山汞矿在从辉煌到衰落的短短45年间，共排放含汞废气202亿立方米，工业废渣426万立方米，废水5192万吨。其中废气超标高达5449倍，废水和废渣也分别超标236倍和214.5倍。矿区空气中的汞含量为0.0053mg/立方米，超标1.67倍;而生活饮用水最高含汞量，则超标36倍。小白菜含汞量超标将近100倍;主要检测农作物中含汞量最少的玉米，也超标10倍。没有直接参与汞作业的城乡居民汞中毒患病率也达4.18%，各种结石病的发病率位居国内最高水平，各种癌症的发病率也高企不下。 当地几乎90%的农产品全部依赖外省输入。“不喝本地水，不吃本地菜”，在当地已成为生活中的“常态”。,
