1、本科毕业论文系列开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体的鉴定一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI是世界上广泛分布的一类寄生虫，在许多种类的海水养殖鱼类体内均有发现，它们主要寄生在鱼类体表、鳃丝和鳍等部位，其分类位置为单殖目、分室科、新贝尼登虫属。寄生虫通过识别宿主体表分泌的黏液侵染宿主，以宿主体内血液或体表某些组织为食。受到感染的鱼体通过摩擦养殖网箱以制止皮肤搔痒，进而使自身皮肤大面积受伤糜烂，鳞片脱落，最终导致病鱼精神不定，拒食而亡杨文川等,2001LEONG,ETAL,2002黄艳平等,2003。相关文献报道称，梅氏新贝尼登虫病害经常在我国沿
2、海地区爆发，给水产养殖业带来巨大损失，养殖鱼类感染此寄生虫的数目已占一半以上，在某些地区甚至已达100杨文川等,2004。由此可见，对此类寄生虫的防治已迫在眉睫。目前针对梅氏新贝尼登虫的防治方法主要有三淡水加20106氟本尼考等抗菌素浸洗510MIN，绝大部分虫体变白脱落死亡，这也是本尼登虫病最安全、有效的防治方法，但缺点是操作繁琐、劳动强度较大；250106福尔马林海水增氧浸洗20MIN；用生石灰等泼洒或挂袋亦可防治。这些方法虽有一定疗效，但很难从根本上制止梅氏新贝尼登虫对鱼类的侵害，尤其是难以杀死虫卵，使疾病屡治屡发。深入研究梅氏新贝尼登虫寄生过程的分子机制，开发针对关键蛋白的抗体药物成为
3、控制此种疾病的关键。MUCIN基因是生命体广泛表达的一类基因，其编码的黏蛋白是一类高度糖基化蛋白（HWARDANDCAROLYN,2005），集中分布在呼吸道和消化道等组织的粘膜表面，行使润滑及保护的作用。蛋白骨架核心区域丝氨酸、苏氨酸残基上连接的大量寡糖链构成黏蛋白的基本结构，其中总分子量的一半以上由这些寡糖链占据。科学家对梅氏新贝尼登虫和鱼类体表分泌的黏液成分进行分析，发现其中都含有MUCIN基因家族编码的黏蛋白，EMMANUELROGER等研究证明它们在寄主的识别与入侵以及宿主的免疫反应中发挥着重要作用EMMANUELANDBENJAMIN,2008。目前，国内对MUCIN基因的研究才刚
4、刚起步，国外对MUCIN基因及其蛋白已经作了大量研究。初步对MUCIN基因序列的分析与比对证明，这类基因是由可变数目的重复序列组成VNTAVARIABLENUMBEROFTANDEMREPEATS，VNTRS，因此具有多种异构体。其所编码的黏蛋白在核心蛋白部位具有相应的特异性连续重复模体TANDEMREPEATS，TRS结构，它们也因此具有多态性（高峰等,2007）。推测这种多态性与寄主和宿主进化过程中的双向选择具有密切关系（GEORGIOS,ETAL,2001）。本课题对梅氏新贝尼登虫的RNA进行提取以获得其MUCIN基因的异构体CDNA序列，通过分析与比对来鉴定此基因的分子特征，为进一步探
5、究梅氏新贝尼登虫寄生过程中MUCIN基因发挥的作用和寻找防治此种病原虫疾病的新方法提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是从梅氏新贝尼登虫CDNA文库中获得MUCIN基因异构体CDNA全长序列，并进行序列分析比对及糖基化分析，最后利用实时荧光定量PCR分析梅氏新贝尼登虫不同发育阶段MUCIN基因的表达情况。拟解决的问题梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体分子特征鉴定。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫
6、成虫，经系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于EPPENDOFF管中，70C冰箱保存备用。2总RNA提取利用RNAISO试剂提取健康香鱼肝脏组织总RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无
7、色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以
8、免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3构建寄生虫CDNA文库构建实验采用的载体为PBLUESCRIPTIISK，根据选择的ECORI和XHOI酶切位点和锚定引物。31CDNA第一链的合成（
9、1）模板RNA（POLYARNA）500G中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到108L。（2）65加热5MIN后，冰中放置5MIN（冷却。（3）在微量离心管中配制下列反应液。试剂体积/L51STSTRANDSYNTHESISBUFFER1STSTRANDDNTPMIXTURERNASEINHIBITOR20U/LOLIGODT18ANCHORPRIMER1G/L40121020（4）向3的反应液里加入2的热处理后的POLYARNA溶液（5G），轻轻混匀。（5）室温放置10MIN后，加入REVERSETRANSCRIPTAE（MMLV10L（全量为20L，轻轻混匀。（6）42反应1H。（7）
10、反应结束后置于冰中冷却2MIN。32CDNA第二链的合成（1）在CDNA第一链合成液（20L）中按下列顺序加入反应试剂，进行2NDSTRANDCDNA的合成反应（反应液总量为146L。试剂体积/L灭菌DEPC水52NDSTRANDSYNTHESISBUFFER2NDSTRANDDNTPMIXTURERNASEFREEH2OECOLIRNASEH/ECOLIDNALIGASEMIXTUREECOLIDNAPOLYMERASEI总体积可变304587522146（2）用移液枪轻轻混匀后16反应2H。（3）70加热10MIN后，室温放置5MIN。（4）加入4L的T4DNAPOLYMERASE后，轻轻
11、搅拌。（5）37反应10MIN。（6）向2NDSTRANDCDNA合成反应液（150L）中加入等量（150L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液。VORTEX搅拌510S。（7）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（8）向水相中加入等量（150L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，VORTEX搅拌510S。（9）在室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。（10）加入1/10量（15L）的3MSODIUMACETATE、4L的DRGENTLEPRECIPI
12、TATIONCARRIER、225倍量的100乙醇。（11）均匀混合后立即进行15,000RPM、30MIN的离心室温下。（12）除去上清后用70的乙醇清洗。（13）干燥沉淀后，用125L的不含RNA酶的灭菌水溶解沉淀。33接头连接ADAPTORLIGATION向上述双链CDNA溶液125L中加入下列试剂，全量20L。试剂体积/L灭菌DEPC水10T4DNALIGASEBUFFERECORISMAIADAPTOR04G/LT4DNALIGASE350U/L总体积可变2352202轻轻混匀后，8过夜反应（16H以上。370保温30MIN后，室温放置5MIN。44下12000G离心15MIN，小心
13、弃去上清液，用70乙醇洗涤沉淀，4下12000G离心5MIN。34限制酶XHOI酶切反应1向ADAPTORLIGATION溶液20L中加入下列试剂，全量50L。试剂体积/L灭菌DEPC水XHOISUPPLEMENTXHOI50U/L总体积可变273502轻轻混匀后，37反应3H。35使用SPINCOLUMN除去短链CDNA以下的COLUMN处理可以除去400BP以下的短链CDNA。SPINCOLUMN的准备（1）反复上下颠倒悬浊COLUMN内的GEL。（2）先取下上盖后，慢慢取下下盖，COLUMN上下盖不要丢弃。（3）让COLUMN内的BUFFER自然流出（大约需要15MIN。（4）安装下盖，
14、向COLUMN中加入2ML的TEBUFFER后再盖上盖，反复上下颠倒悬浊GEL。（5）重复上述操作24。（6）取下COLUMN的上下盖，让COLUMN内的BUFFER自然流出。（7）将去盖的15MLMICROTUBE放置于FALCONTUBE中，然后将SPINCOLUMN插入FALCONTUBE中，将COLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE内2，400G离心2MIN。（8）丢弃FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE，向FALCONTUBE中放入新的去盖的15MLMICROTUBE，再将SPINCOLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15ML
15、MICROTUBE内。（9）向XHOI酶切溶液（50L）中加入下列试剂，充分混合。试剂体积/LTEBUFFERTRNA10G/L401（10）将上述1的溶液向操作1中准备好的SPINCOLUMN中添加。请注意要添加在COLUMN中的GEL表面的中央位置，每次添加约10L，分数次慢慢添加。（11）400G离心2MIN。（12）COLUMN洗脱液约100L转移至新的15MLMICROTUBE中，加入等量（100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液，剧烈振荡混匀。（13）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（1
16、4）加入等量（100L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，剧烈振荡混匀。（15）室温下15,000RPM离心5MIN，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中。（16）加入1/10量（10L）的SODIUMACETATE、4L的PRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混匀。（17）室温下15,000RPM离心30MIN，除去上清，再用70乙醇清洗沉淀。（18）干燥沉淀后用15L的RNASEFREEH2O溶解沉淀。36连接到特定质粒载体载体结合反应（1）配制下列LIGATION反应液。试剂PURIFIEDCDNA10T4DNALIGASEBUFFE
17、RPBLUESCRIPTIISKT4DNALIGASE350U/L体积/L15212（2）轻轻混合后12过夜反应。（3）向LIGATION反应液中加入80L的TEBUFFER，用等量100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）抽提1次，再用等量（100L）的氯仿/异戊醇（241抽提1次。（4）向上清中加入1/10量（10L）的3MSODIUMACETATEPH52）、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混合。（5）室温15,000RPM离心30MIN，除去上清。（6）用70乙醇清洗沉淀。（7）干燥沉淀后，用20L的TEBUFFER溶解沉淀
18、。（8）20保存。37质粒转化（1）将80保存的DH10BELECTROCELLS于冰上融解。（2）将LIGATION溶液的一部分（0510L）加入至DH10BELECTROCELLS中，轻轻混匀。（3）将2的菌液迅速转移至冰上预冷的01CM冲击槽中，施加电压脉冲进行电击转化。LIGATION溶液宿主大肠杆菌机种冲击条件0510LDH10BECOLIPULSER（BIORAD公司）15KV,200，25F（4）向冲击槽内快速加入冰上预冷的SOC。（5）全量取出回收后，转移至培养TUBE中（FALCONTUBE等，37振荡培养1H（使用1ML的SOC培养基。（6）取部分5的培养液（1L或10L）
19、涂布于LB/AMP琼脂平板培养基上培养，剩余的培养液请于4保存。（7）37过夜培养。（8）计算菌落数，求取CDNAPRIMARYLIBRARY效率。（9）使用T7PROMOTERPRIMER及T3PROMOTERPRIMER进行COLONYPCR反应，确认本LIBRARY的INSERT分布情况。4PCR扩增、RACE及荧光定量PCR检测设计兼并引物，获取MUCIN基因异构体全长序列，若基因未获全长，可根据已获得的序列设计特异引物，进行末端扩增，从而获得MUCIN异构体的全长序列序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由华大基因公司测定。序列分析采用BLASTP分
20、析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DNAMAN软件，糖基化分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，梅氏新贝尼登虫不同发育阶段MUCIN基因的表达情况由实时荧光定量PCR分析完成。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。20101120111获得梅氏新贝尼登虫MUCIN基因异构体全长CDNA序列，对其进行BLAST分析，比对分析和MUCIN基因异构体进化树构建2011120112数据和材料整理、分析。2
21、011220113开题答辩与综述。2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1曹红,东风,郑伟MUC1、MUC3在结石性胆囊炎和胆囊腺瘤样息肉粘膜组织中的表达及其意义J中国普外基础与临床杂志,200373793822高峰,郭洪斌,史鹏MUC1蛋白的研究进展J中国老年学杂志,20075101410153康美和MUC1基因,CA153与肺癌的临床研究进展J江西医药,2008,4321661684贾彦彬,张建祖MUC6基因的一个单核苷酸多态性与胃癌没有关联J包头医学院学报,2010,26313梅氏新贝尼登虫成虫的分离与保存梅氏新贝尼登虫总RNA的提取构建寄生虫CDN
22、A文库构建PCR扩增进行5RACE获得MUCIN基因异构体全长序列序列分析与比对糖基化分析REALTIMEPCR检测基因表达量变化设计MUCIN基因的兼并引物5黎国伟急性白血病患者MUG1与WT1基因表达的临床意义J中国肿瘤临床,2005,32148018036陈淑靖,白春学气道黏液中黏蛋白MUCSAC的研究进展J中华结核和呼吸杂志,2007,3064614637杜立阳青黛颗粒对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜MUC2和INOS基因表达的影响J世界华人消化杂志,2010,1899379418王超,秦宜德,王巍人MUC16基因启动子区域的初步分析J安徽医科大学学报,2009,4455335359汪荣泉人
23、正常腺上皮组织中MUC6基因的表达J中国组织化学与细胞化学杂志,2001,102182010陈健食管癌中癌基因MUC4的变化及临床病理意义JDIASPATH,20041110811011杨静文,张伟生,吴立玲唾液和汨液中主要黏蛋白MUC5B和MUC7协同互补功能J现代生物医学进展,200882330233312汪荣泉胃癌及癌前病变组织中MUC6核粘蛋白的表达及其意义J第三军医大学学报,2001,23191213汪荣泉消化道癌患者胃肠道粘膜中MUC2和MUC3基因的表达J基础医学与临床,2000,205373914高文涛胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS7细胞的表达
24、J南京医科大学学报,2007,27121358136015李贵森MUC20基因串联重复片段多态性及其对IGA肾病的影响J中华医学杂志,2005,85191333133516ZENY,HARADAK,SASAKIM,ETA1LIPOP0IYSACCHARIDEINDUCESOVEREXPRESSIONOFMUC2ANDMUC5ACINCULTUREDBILIARYEPITHELIALCELLSPOSSIBLEKEYPHENOMENONOFHEPATOLITHIASISJAMJPATHOL,2002,16L41475148417SLOMIANYBL,SLOMIANYAIMPEDANCEOFHELI
25、COBACTERPY1ORILIPOPOLYSACCHARIDEINTERFERENCEWITHGASTRICMUCINSYNTHESISBYPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORGAMMAACTIVATIONINVOLVESPHOSPHATIDYLINOSITOL3KINASE/ERKPATHWAYJLUBMBLIFE,2003,5529710218SLOMIANYBL,SLOMIANYALEPTINMODULATESTHEDETRIMENTALEFECTOFPORPBYROMONASGINGIVALISLIPOPOLYSACCHARIDEINDUCE
26、DCYTOSOLICPHOSPH0LIPASEA2ACTIVATIONONSALIVARYMUCINSYNTHESISVIAERKSIGNALTRANSDUCTIONJINFLAMMOPHARMACOLOGY,2006,145425025519JUANPV,ROBERTLHTHESTRUCTUREANDASSEMBLYOFSECRETEDMUCINSJBIOLCHEM,1999,27431720MONIAUXN,ESCANDEF,PORCHETN,ETA1STRUETURALORGANIZATIONANDCLASSIFICATIONOFTHEHUMANMUCINGENESJFRONTBIOSC
27、IENCE,2001,619221DESSEYNJL,BUISINEMP,PORCHETN,ETA1EVOLUTIONARYHISTORYOFTHE1LP15HUMANMUCINGENEFAMILYJMOLEVOL,1998,461101222TURNERBS,BHASKARKR,HADZOPOULOUCLADARASM,ETA1CYSTEINERICHREGIONSOFPIGGASTRICMUCINCONTAINVONWILLEBRANDFACTORANDCYSTINEKNOTDOMAINSATTHECARBOXYLTERMINALJBIOCHIMBIOPHYSACTA,L999,14471
28、779223WICKSTRTIMC,DAVIESJR,ERIKSENGV,ETA1MUC5BISAMAJORGELFORMING,OLIGOMERICMUCINFROMHUMANSALIVARYGLAND,RESPIRATORYTRACTANDENDOCERVIXIDENTIFICATIONOFGLYCOFORMSANDCTERMINALCLEAVAGEJBIOCHEM,1998,334PT368569324LINDHL,GLANTZPO,CARLSTEDTI,ETA1ADSORPTIONOFMUC5BANDTHEROLEOFMUCINSINEARLYSALIVARYFILMFORMATION
29、JCOLLOIDSANDSURFACESBIOINTERFACES,2002,25213914625HABTEHH,MALLAS,DEBEERC,ETA1THEROLEOFCRUDEHUMANSALIVAANDPURIFIEDSALIVARYMUC5BANDMUC7MUCINSINTHEINHIBITIONOFHUMANIMMUNODEFICIENCYVIRUSTYPE1INANINHIBITIONASSAYJVIROLJ,2006,3249926SHIMINLI,BOBEKLAFUNCTIONALANALYSISOFHUMANMUC7MUCINGENE5FLANKINGREGIONINLUN
30、GEPITHELIALCELLSJAMERICANJOURNALOFRESPIRATORYCELLANDMOLECULARBIOLOGY,2006,35559360127INTINIG,AGUIRREA,BOBEKLAEFICACYOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7DERIVEDPEPTIDEANDHISTATIN5INAMURINEMODELOFCANDIDIASISJINTJANTIMICROBAG,2003,22659460028GURURAJATL,LEVINEJH,TRANDT,ETA1CANDIDACIDALACTIVITYPROMPTEDBYNTERMINUSHIS
31、TATINLIKEDOMAINOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7JBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA,1999,1431110711929SOARESRV,LIUB,OPPENHEIMFG,ETA1STRUCTURALCHARACTERISATIONOFCYSTEINESINABACTERIALBINDINGMOTIFOFHUMANSALIVARYMUCINMG2JARCHIVESOFORALBIOLOGY,2002,47859159730INTINIG,AGUIRREA,BOBEKLAEFICACYOFHUMANSALIVARYMUCINMUC7DERIVED
32、PEPTIDEANDHISTATIN5INAMURINEMODELOFCANDIDIASISJINTJANTIMICROBAG,2003,22659460031WEIGX,BOBEKLAINVITROSYNERGICANTIFUNGALEFECTOFMUC712MERWITHHISTATIN512MEROFMICONAZOLEJJANTIMICROBCHEMOTH,2004,53575075832KOV6TABM,TOUSSAINTMJM,GRUYSE,ETA1EVALUATIONOFGOOSESERUMAMYLOIDAACUTEPHASERESPONSEBYENZYMELINKEDIMMUN
33、OSORBENTASSAYJACTAVETHUNG,2007,55334935733EMMANUELROGER,BENJAMINGOURBALEXPRESSIONANALYSISOFHIGHLYPOLYMORPHICMUCINPROTEINSSMPOMUCFROMTHEPARASITESCHISTOSOMAMANSONIJMOLECULARJULENIUS,ETA1,2005）。12几种重要MUCIN基因的介绍目前，科学家确认的十一种粘蛋白标记为MUC14、MUC5AC、MUC5B、MUC68、MUC1112（康美和等,2008）。现选择几种较为常见的做简要介绍。MUC1基因是最为常见的人体M
34、UCIN基因，其长度约1821BP，串联重复序列位于MUC1基因第2个外显子，序列特征符合典型的小卫星序列。人类MUC1基因具有多个异构体，而其它物种此基因没有这样的多态性（高峰等,2007）。MUC7基因长度为11KB左右，其蛋白产物是一条单独的肽链，由五个结构域组成SOARES,2002。MUC2基因是从人类小肠正常杯状细胞所特有的CDNA文库中克隆到的一种基因，其编码的蛋白产物是小肠粘液中不可缺少的组成成分（翁羽蕙等,2010）。MUC6基因是从人类胃CDNA文库中所克隆到的一种基因，它的核心区域由可变数目的串联重复序列组成，此区域可编码160个氨基酸残基（汪荣泉等,2001）。MUC1
35、6基因由84个外显子组成，基因长度在100KB以上，约编码156个氨基酸残基（王超等,2009）。这些基因都具有MUCIN基因家族共有的序列特征。2MUCIN基因的研究与疾病的防治MUCIN基因蛋白广泛分布于机体多种器官和组织的黏膜表面，如消化道、呼吸道、生殖道、角结膜等。它们有些是膜蛋白，有些是分泌蛋白，起到细胞识别与信号传递的作用。这就决定了此类蛋白与细胞癌变、免疫、生物寄生等生命现象的密切关系。深入研究MUCIN基因对人们了解各种疾病的致病机理与防治具有重要意义。21MUCIN基因与癌症治疗大量实验证明MUCIN基因与癌症有密切关系，且不同的MUCIN基因与癌症关系各不相同。冯美燕等研究
36、发现MUC1在正常胃癌演进的过程中，表达率呈下调趋势，而MUC2在此过程中为上调表达（冯美燕等,2002）。相关文献报道称，肺癌患者手术后的平均生存时间和肺癌组织中MUC1基因蛋白产物的表达量成反比，MUC1基因阳蛋白产物表达量越高，肺癌患者接受手术后的寿命越短（康美和,2008）。汪荣泉等在研究中发现，胃粘膜表面成分中含有MUC6基因编码的蛋白产物，胃癌患者患病后和患病前相比，MUC6基因蛋白产物的表达量明显下降（汪荣泉等,2001）；科学家还发现，胃粘膜表面成分中同样含有MUC5AC基因编码的蛋白产物，相对于正常细胞而言，此蛋白在癌变细胞中的表达量显著下调（汪荣泉等,1999）。曹红等在研
37、究中发现，与正常细胞相比，结石性胆囊炎和胆囊腺瘤样息肉病变部位的细胞中MUC1和MUC3基因蛋白产物的表达量大大减少，这为结石病和胆囊癌的病前诊断提供了新的思路（曹红等,2003）。22MUCIN基因在其他疾病中作用的研究刘剑波等研究发现，人以及动物体内的支气管壁表面分泌的粘液中含有大量MUCIN基因编码的蛋白产物，而哮喘患者呼吸不畅是因支气管粘膜分泌了大量黏液堵塞气道引起，由此推测减少MUIN基因的表达量可有效降低气喘病的发病率。进一步的实验证实MUCIN基因蛋白产物表达量上调可导致哮喘病（刘剑波,2004）。杜立阳等研究发现，人体肠道粘膜表面的粘液中集中分布着大量粘蛋白，其中MUC2基因编
38、码的蛋白产物含量最多。粘液成分是肠黏膜重要化学屏障，肠道炎症的发生大多源于粘液成分的损伤。MUC2基因蛋白产物表达量的异常会导致粘液层受到破坏，调整粘蛋白表达量通常是治疗此类疾病的关键（杜立阳等,2010）。黄雪琨等在研究中发现，人类鼻窦粘膜表面含有大量以MUC2基因蛋白产物为主的粘蛋白，鼻窦炎患者炎症区域黏液过度分泌，这是由于细胞中MUC2基因的表达量显著上调引起黄雪琨等,2007。黎国伟等通过实验探讨了急性白血病患者MUCL基因的表达情况及临床意义，发现与健康人相比，患者MUCL基因蛋白产物表达量显著异常，这可作为分子生物学指标诊断急性白血病患者（黎国伟等,2005）。3MUCIN基因在寄
39、主向宿主侵袭过程中所起的重要作用的探究目前，国内对MUCIN基因的研究才刚刚起步，而且仅限于人体MUCIN基因的研究和相关疾病的治愈，对其它动物体内的MUCIN基因研究甚少。然而，国外对MUCIN基因及其蛋白作了大量研究，研究范围已经从脊椎动物延伸到无脊椎动物。在研究过程中，MUCIN基因在寄主向宿主侵袭过程中所起的重要作用成为一个新的重要发现（ISAACANDJOSEDEJESUS,2008）。寄主和宿主在漫长的进化过程中是相互选择，互相促进的。很多寄主是依靠自身分泌的一类黏液物质来实现对宿主的识别和寄生部位的确定。这类黏液含有多种蛋白质，其中有一类蛋白质在侵袭寄主过程中发挥着关键作用ALV
40、ARO,ETA1,2001，它们接触到宿主细胞表面后能与细胞膜上的受体特异性结合，甚至水解某些宿主的结构和功能蛋白，帮助寄主识别并入侵宿主体内。与此同时，宿主自身也分泌类似的含有多种蛋白的黏液物质，其中有一类蛋白同样具有识别和消化的作用，所不同的是，有时候这类蛋白会成为宿主识别寄主的靶位点或者成为寄主维持生存的营养物质GEORGIOS,ETA1,2001。研究发现，寄主和宿主具有的这类蛋白有共同的结构特征和高度的多态性。EMMANUELROGER等对其基因序列分析比对后初步认定此类基因属于MUCIN基因家族（EMMANUELANDBENJAMIN,2008）。寄主和宿主体内的MUCIN基因具有
41、显著多态性（JAVIER,ETA1,1998），说明此类基因在进化过程中发生过多次突变与重排，这对在分子水平上解释宿主与寄主进化过程中相互选择的机制具有重要参考价值。进一步研究这类MUCIN基因蛋白的结构功能，有助于加深了解动物寄生的复杂过程，对动物以及人类病原寄生虫的防治具有重要意义。4展望从发现至今，MUCIN基因家族的研究已有20多年的历史，新的MUCIN基因家族成员正在不断被发现，例如MUC20就是2004年在IGA肾病患者中通过差异显示技术筛选出来的一个上调表达的基因（李贵森等,2005）。随着对MUCIN基因家族的研究不断深入，相关疾病治病机理会逐渐明朗，许多新的免疫防治手段会得到
42、研发。特别是近来国外科学家对MUCIN基因在寄生过程中扮演重要角色的发现可能会为养殖业中病虫害的防治带来新的突破。本文对MUCIN基因进行了大体介绍并对目前的研究状况做了简要阐述，希望能对将来的研究有一些参考价值。参考文献1曹红,东风,郑伟MUC1、MUC3在结石性胆囊炎和胆囊腺瘤样息肉粘膜组织中的表达及其意义J中国普外基础与临床杂志,200373793822高峰,郭洪斌,史鹏MUC1蛋白的研究进展J中国老年学杂志,20075101410153康美和MUC1基因,CA153与肺癌的临床研究进展J江西医药,2008,4321661684贾彦彬,张建祖MUC6基因的一个单核苷酸多态性与胃癌没有关联
43、J包头医学院学报,2010,263135黎国伟急性白血病患者MUG1与WT1基因表达的临床意义J中国肿瘤临床,2005,32148018036陈淑靖,白春学气道黏液中黏蛋白MUCSAC的研究进展J中华结核和呼吸杂志,2007,3064614637杜立阳青黛颗粒对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜MUC2和INOS基因表达的影响J世界华人消化杂志,2010,1899379418王超,秦宜德,王巍人MUC16基因启动子区域的初步分析J安徽医科大学学报,2009,4455335359汪荣泉人正常腺上皮组织中MUC6基因的表达J中国组织化学与细胞化学杂志,2001,102182010陈健食管癌中癌基因MUC4的
44、变化及临床病理意义JDIASPATH,20041110811011杨静文,张伟生,吴立玲唾液和汨液中主要黏蛋白MUC5B和MUC7协同互补功能J现代生物医学进展,200882330233312汪荣泉胃癌及癌前病变组织中MUC6核粘蛋白的表达及其意义J第三军医大学学报,2001,23191213汪荣泉消化道癌患者胃肠道粘膜中MUC2和MUC3基因的表达J基础医学与临床,2000,205373914高文涛胰腺癌MUC4抗原多表位嵌合基因重组腺病毒载体的构建及其在COS7细胞的表达J南京医科大学学报,2007,27121358136015李贵森MUC20基因串联重复片段多态性及其对IGA肾病的影响J
45、中华医学杂志,2005,85191333133516SOARESRV,LIUB,OPPENHEIMFG,ETA1STRUCTURALCHARACTERISATIONOFCYSTEINESINABACTERIALBINDINGMOTIFOFHUMANSALIVARYMUCINMG2JARCHIVESOFORALBIOLOGY,2002,47859159717ALEXL,MARTINH,DIETMARL,ETALAFAMILYOFSECRETEDMUCINSFROMTHEPARASITICNEMATODETOXOCARACANISBEARSDIVERSEMUCINDOMAINSBUTSHARESS
46、IMILARFLANKINGSIXCYSTEINEREPEATMOTIFSJTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2000,275396003960718GEORGIOST,SALLYJ,HICKS,ETA1THEROLEOFMUCINSINHOSTPARASITEINTERACTIONSPARTIIHELMINTHPARASITESJTRENDSINPARASITOLOGY,2001,17313013519EMMANUELR,BENJAMINGEXPRESSIONANALYSISOFHIGHLYPOLYMORPHICMUCINPROTEINSSMPOMUCFROMT
47、HEPARASITESCHISTOSOMAMANSONIJMOLECULARNEOBENEDENIAMELLENIISOFOM1引言2梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI是世界上广泛分布的一类寄生虫，在许多种类的海水养殖鱼类体内均有发现，它们主要寄生在鱼类体表、鳃丝和鳍等部位，其分类位置为单殖目、分室科、新贝尼登虫属。寄生虫通过识别宿主体表分泌的黏液侵染宿主，以宿主体内血液或体表某些组织为食。受到感染的鱼体通过摩擦养殖网箱以制止皮肤搔痒，进而使自身皮肤大面积受伤糜烂，鳞片脱落，最终导致病鱼精神不定，拒食而亡1,2。相关文献报道称，梅氏新贝尼登虫病害经常在我国沿海地区爆发，给水产
48、养殖业带来巨大损失，养殖鱼类感染此寄生虫的数目已占一半以上，在某些地区甚至已达1003。由此可见，对此类寄生虫的防治已迫在眉睫。目前针对梅氏新贝尼登虫的防治方法主要有三250106福尔马林海水增氧浸洗20MIN；用生石灰等泼洒或挂袋防治；淡水加20106氟本尼考等抗菌素浸洗510MIN，绝大部分虫体变白脱落死亡，这是目前梅氏新贝尼登虫病最安全、有效的防治方法，但操作繁琐、劳动强度较大。这些方法虽有一定疗效，但很难从根本上制止梅氏新贝尼登虫对鱼类的侵害，尤其是难以杀死虫卵，使疾病屡治屡发4。深入研究梅氏新贝尼登虫寄生过程的分子机制，开发针对关键蛋白的抗体药物成为控制此种疾病的关键。目前许多国内外
49、研究发现，包括梅氏新贝尼登虫在内的真核生物寄生虫的基因组能够编码许多与宿主体内蛋白相类似的分子，这些分子具有生理或免疫活性。寄生虫入侵宿主后，此类分子被释放到宿主体内环境中，它们模拟和干涉宿主分子的活动，破坏其正常的功能，从而使寄生虫能够长期存活5。科学家证明MUCIN蛋白就是寄生虫模拟宿主表达的一类分子，它也能由宿主表达。MUCIN蛋白是分子量在40万以上的糖蛋白，广泛分布于许多生物机体器官和组织的黏膜表面，如消化道、呼吸道、生殖道、角结膜等。在机体非特异性免疫应答中，MUCIN蛋白发挥着十分重要的作用6。其基本结构是由核心蛋白和连接在核心蛋白丝、苏氨酸残基上的大量糖链构成7。它帮助梅氏新贝尼登虫识别广泛的寄生对象，并在宿主体内长期生存。宿主的免疫系统之所以对梅氏新贝尼登虫作用微弱，一部分是因为它在受到攻击时能脱掉富含糖蛋白的外壳，一部分是因为它能大量分泌一类高度糖基化的不易识别的抗原，而MUCIN蛋白在外壳糖蛋白和分泌的糖基化抗原中都有存在并发挥了作用3。此外，科学家通过对梅氏新贝尼登虫和鱼类体表分泌的黏液成分的分析也证明了MUCIN蛋白的存在8。以上
