1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全铁对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究一、选题的背景与意义由细菌、病毒和霉菌等导致的微生物危害，使人们长期以来采用各种方法与各类微生物的危害进行斗争，抗菌一直是人类所关注的课题。目前，已研制及应用的抗菌剂可归为天然抗菌剂、有机抗菌剂及无机抗菌剂。当有些致病菌产生抗药性后，寻找新型抗菌剂及检验它们的抗菌效果就成了非常急迫的问题。铁是微生物最重要的营养之一，它是电子传递链中铁硫蛋白的氧化还原中心，它参与核苷酸前体的还原反应，是必不可少的营养因子。通过螯合作用，去除微生物生长环境中的铁以达到抗菌的效果，作用温和，可作为一种新型的抗菌剂应用于食品中。二、研究的基
2、本内容与拟解决的主要问题1、基本内容1分光光度法测定铁含量；2确定基本培养基成分；3确定细菌生长最适铁浓度；4抑菌效果研究螯合能力研究；抑菌实验；5抑菌作用机理研究2、拟解决的主要问题1基础培养基最佳成分的确定2最适铁浓度的确定3铁测定方法的选择4总菌数测定方法的选择三、研究的方法与技术路线1、研究方法1文献研究法2比色法3原子吸收法4稀释倒平板法2、技术路线铁依赖实验四、研究的总体安排与进度2010年10月11月查找相关文献资料，撰写开题报告和综述2010年12月开题论证会，实验设计，预实验2011年1月2011年3月正式实验，进行外文翻译2011年4月28日前撰写论文并完成修改2011年5
3、月4日11日论文答辩五、主要参考文献1陆德源主编医学微生物学M5版北京人民卫生出版社,200129302FISHBANESREVIEWOFISSUESRELATINGTOIRONANDINFECTIONJAMJKIDNEYDIS,1999,344SUPPL2S47S523张培茵,阎喜霜,姜淑梅等铁、锌对啤酒酵母生物特性的影响研究J食品工业科技J,1996,113154BERLUTTIF,MOREAC,BATTISTONIA,ETALIRONAVAILABILITYINFLUENCESAGGREGATION,BIOFILM,ADHESIONANDINVASIONOFPSEUDOMONASAERU
4、GINOSAAND培养基中铁含量测定培养基成分确定微生物最适铁浓度确定螯合剂抑菌效果研究螯合能力；抑菌效果螯合剂抑菌机理研究BURKHOLDERIACENOCEPACIAJINTJIRNMUNOPATHOLPHARMACOL,2005,186616705BANINE,BRADYKM,GREENBERGEPCHELATORINDUCEDDISPERSALANDKILLINGOFPSEUDOMONASAERUGINOSACELLSINABIOFILMJAPPLENVIRONMICROBIOL,2006,72206420696SINGHPK,PARSEKMR,GREENBERGEP,ETA1ACOM
5、PONENTOFINNATEIMMUNITYPREVENTSBACTERIALBIOFDMDEVELOPMENTJNATURE,20024175525557MUSKDJ,BANKODA,HERGENROTHERPJIRONSALTSPERTURBBIOLILMFORMATIONANDDISRUPTEXISTINGBIOFILMSOFPSEUDOMONASAEMGINOSAJCHEMBIOL,2005,127897968王伟,肖明微生物嗜铁素介导的铁摄取J生物学杂志,2005,22411159李国刚静脉补铁在肾性贫血治疗中的应用J国外医学泌尿系统分册,2001,212515310钱钟明主编铁代谢
6、基础与临床M北京科学出版社,200036411孙洪,夏英,陈莉等国内外抗菌剂的研究现状及发展趋势J塑料工业,2006,3491412李和平,王月影,高峰霞绿色抗菌剂壳聚糖J畜牧与饲料科学,2009,30617918013许彪抗菌剂及抗菌材料在个体防护产业中的应用和发展J中国个体防护装备,2006,52114杨飞,陈克复,杨仁党,等抗菌剂及其在抗菌纸中的应用J中国造纸,2006,2585115张红抗菌剂及其在食品包装纸中的应用J黑龙江造纸,2009,2262716夏海民,孙斌,冯新星无机抗菌剂的分类、应用及发展J纺织导报,2010,611511717万素英,李琳,王慧君常用酚类抗氧剂和螯合剂的抑
7、菌作用J中国食品添加剂,1998,3172218徐海军,刘俊良,胡方宏等禽霍乱蜂胶灭活疫苗研制中的铁螯合剂适宜浓度确定J安徽农业科学,2007,3551378137919霍健聪,邓尚贵,谢超多肽亚铁螯合物制备及抑菌活性研究食品与机械,2009,251868920TOMBERGAN,JOKLAVENESSCHELATINGAGENTSJCHEMOTHERAPY2001,471014毕业论文文献综述食品质量与安全铁对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究摘要抗菌一直是人们所关注的话题，特别是当有些致病菌产生抗药性后，寻找新型抗菌剂及检验它们的抗菌效果就成了非常急迫的问题。而铁在微生物生命活动中占有及
8、其重要的作用。本文概述了铁的作用，对现有抗菌剂作一回顾，同时介绍了新型抗菌剂铁螯合剂的研究进展和应用。关键词铁；微生物；螯合剂铁是微生物生长必需的微量元素之一。它是电子传递链中铁硫蛋白的氧化还原中心，参与核苷酸前体的还原反应，是必不可少的营养因子。据此，有学者提出了新的抗菌理论通过螯合作用，螯合培养基中的铁离子来达到抗菌的目的。1、铁对微生物生长的影响铁在微生物生长过程中的作用主要有构成有机化合物，合成菌体组分；作为酶的组成成分，维持酶的活性；参与能量的储存于转运；调节细胞的渗透压；与微生物生长繁殖和致病作用密切相关1。动物实验证实，如果给予充足的铁剂，微生物的感染能力将增强，如果铁缺乏，微生
9、物的生长将受到限制2。张培茵3等研究发现，通过在培养基中添加一定量的铁盐，可提高酵母体内铁元素的含量，并且提高酵母活性，但超过一定的范围反而对酵母的生长有抑制作用。铁离子在铜绿假单胞菌生物被膜（BF）的形成过程中起到至关重要的作用4，EHUDBANIN5等发现往培养基中加入EDTA，已形成的铜绿假单胞菌生物被膜会发生降解破裂，促使铜绿假单胞菌从被膜中游离出来，并且EDTA对游离出被膜的细菌有杀灭作用。发现只有加入FE2后能完全阻断EDTA的效应，证明铁离子对BF具有重要的稳定作用。SINGH6等发现极度缺铁抑制BF形成，适量的铁利于BF的形成并对其毒性有重要作用，而MUSK7等人又发现高浓度的
10、铁可强烈抑制BF形成，这可能是其通过抑制参与铁载体和群体感应的多种基因的表达来实现的。2、微生物获取铁的机制21合成嗜铁素获取铁大多数微生物能根据环境中铁的浓度，分泌嗜铁素作为螯合因子来获取FE3或者将铁变为可溶性形式以便微生物利用。嗜铁素的合成和释放是细菌和真菌对低铁离子浓度环境的一个应激反应8，它们是一类低分子量的、对铁具有高度亲和性的微生物复合物，其功能是介导微生物细胞的铁摄取9。它与FE3的结合能力非常强，并且有特异性，可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走FE31022利用乳铁蛋白获取铁有些细菌如链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、溶血性巴斯德氏菌和肺炎支原杆菌不能合成嗜铁素，但它
11、们的菌体膜上表达乳铁蛋白受体，这样也可以直接地和宿主乳铁蛋白结合，从而由宿主含铁蛋白上获取铁11。23合成蛋白水解酶获取铁有些微生物还可以通过合成蛋白水解酶释放到周围环境中，去降解宿主铁结合蛋白，从中获取所需要的铁12。3、抗菌剂的研究现状抗菌剂ANTISEPTIC是指用于活组织如皮肤、黏膜防止微生物的药物，有别于通常用于无生命体上微生物控制的化学制剂称之为防腐剂13。抗菌剂具有刺激性小、使用浓度下毒性较低、不会引起过敏反应、作用温和等特点。目前，已研制及应用的抗菌剂可归为天然抗菌剂、有机抗菌剂及无机抗菌剂。31天然抗菌剂天然抗菌剂是人类最早使用的抗菌剂，是从自然界中获取的物质。目前使用最普遍
12、的是壳聚糖，它是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同程度的抑制作用14，其次是山梨酸、黄姜根醇、孟宗竹提取物、日柏醇等。单一的天然抗菌剂抗菌性能好、药效高、安全无毒、对环境友好，但其耐热性低、药效持续时间短、加工性能差、商品化困难15。32有机抗菌剂有机抗菌剂已达500多种，但常用的仅几十种。主要品种有季胺盐类、双胍类、醇类、酚类、有机金属类、吡啶类、咪唑类、噻吩类等。其抗菌机理是通过化学反应，破坏细胞膜，使蛋白质变性，代谢受阻，从而起到杀菌、防腐及防霉等作用16。有机抗菌剂作用速度快，可操作性好，稳定性强，对微生物的抑制作用具有一定的特异性，但它同时具有毒性较大、耐
13、热性较差、药效持续时间短等缺点17。33无机抗菌剂无机抗菌剂是通过将无机抗菌成分与载体结合而制成。一类抗菌剂是指将银、铜、锌等本身具有抗菌能力的金属或金属离子，通过物理吸附或离子交换等方法负载于沸石、硅胶等多孔材料表面的制剂18；另一类是利用陶瓷本身的特性，如以TIO2为中心的氧化物光催化系和氧化物陶瓷本身具有的催化活性而实现抗菌的无机系抗菌剂19。无机抗菌剂的突出特点是耐久性及安全性好、耐热性好、抗菌范围广、有效期长20。4、螯合剂在抗菌中的应用螯合剂在食品和化妆品中具有抑菌作用是近些年才发现的。食品中常用的螯合剂有柠檬酸盐、乳酸盐、焦磷酸盐和EDTA等21。铁螯合剂就是其中比较重要的一种，
14、铁螯合剂能够与铁离子形成螯合物，因而降低环境中游离铁的浓度，从而达到抑制细菌生长的作用。LEEN22等人于93年就发现具有螯合三价铁功能的HMP能有效抑制大肠杆菌和李斯特氏菌的生长。徐海军23等人以含4鸡血清的营养琼脂为培养基，进行了铁螯合剂2,2联吡啶对禽多杀性巴氏杆菌C483株的抑茵试验。结果表明，对于含4鸡血清的营养琼脂培养基，当铁螯合剂2,2联吡啶的添加量为200MOL/L时能有效诱导禽多杀性巴氏杆菌在体外表达交叉保护因子，交叉保护因子可以诱导机体产生交叉保护抗体，从而对各血清型的禽多杀性巴氏杆菌感染均有保护作用。而霍健聪24等人利用舟山带鱼下脚料为原料制备得到的多肽亚铁螯合物对除普通
15、变形杆菌之外的所有细菌均有较强抑制作用。基于铁螯合剂有效的抗菌作用，在医药、食品等领域得到了广泛的应用。例如已经商品化的二乙烯三胺五乙酸（DIETLYLENETRIAMINEPENTAACETICACID,DTPA）作为一种铁离子螯合剂成功地应用到医疗领域25。MA,MD,DCHROBERTMCDONALD26利用去铁胺和DTPA对四名患有珠蛋白生成障碍性贫血并尿液中伴有大量铁的患者进行治疗。结果表明，在铁积累最大的那个患者中获得最好疗效；但是对于那个没有积累太多铁的患者效果就不显著。参考文献1陆德源主编医学微生物学M5版北京人民卫生出版社,200129302FISHBANESREVIEWOF
16、ISSUESRELATINGTOIRONANDINFECTIONJAMJKIDNEYDIS,1999,344SUPPL2S47S523张培茵,阎喜霜,姜淑梅等铁、锌对啤酒酵母生物特性的影响研究J食品工业科技J,1996,113154BERLUTTIF,MOREAC,BATTISTONIA,ETALIRONAVAILABILITYINFLUENCESAGGREGATION,BIOFILM,ADHESIONANDINVASIONOFPSEUDOMONASAERUGINOSAANDBURKHOLDERIACENOCEPACIAJINTJIRNMUNOPATHOLPHARMACOL,2005,1866
17、16705BANINE,BRADYKM,GREENBERGEPCHELATORINDUCEDDISPERSALANDKILLINGOFPSEUDOMONASAERUGINOSACELLSINABIOFILMJAPPLENVIRONMICROBIOL,2006,72206420696SINGHPK,PARSEKMR,GREENBERGEP,ETA1ACOMPONENTOFINNATEIMMUNITYPREVENTSBACTERIALBIOFDMDEVELOPMENTJNATURE,20024175525557MUSKDJ,BANKODA,HERGENROTHERPJIRONSALTSPERTUR
18、BBIOLILMFORMATIONANDDISRUPTEXISTINGBIOFILMSOFPSEUDOMONASAEMGINOSAJCHEMBIOL,2005,127897968GWINKELMANNMICROBIALSIDEROPHOREMEDIATEDTRANSPORTJBIOCHEMISTRYSOCIETYTRANSACTIONS,2002,3046916969ALBRECHTGARY,AANDCRUMBLISS,ALMETALLONSBIOLSYST1998,3523932710王伟,肖明微生物嗜铁素介导的铁摄取J生物学杂志,2005,224111511李国刚静脉补铁在肾性贫血治疗中的
19、应用J国外医学泌尿系统分册,2001,212515312钱钟明主编铁代谢基础与临床M北京科学出版社,200036413孙洪,夏英,陈莉等国内外抗菌剂的研究现状及发展趋势J塑料工业,2006,3491414李和平,王月影,高峰霞绿色抗菌剂壳聚糖J畜牧与饲料科学,2009,30617918015许彪抗菌剂及抗菌材料在个体防护产业中的应用和发展J中国个体防护装备,2006,52116杨飞,陈克复,杨仁党,等抗菌剂及其在抗菌纸中的应用J中国造纸,2006,2585117李晓英抗菌剂及抗菌材料的应用J中国塑料,2001,152687018张红抗菌剂及其在食品包装纸中的应用J黑龙江造纸,2009,2262
20、719夏海民,孙斌,冯新星无机抗菌剂的分类、应用及发展J纺织导报,2010,611511720曾秋苑,敖宁建新一代抗菌剂季鏻类抗菌剂的研究与应用J材料导报,2010,2415192221万素英,李琳,王慧君常用酚类抗氧剂和螯合剂的抑菌作用J中国食品添加剂,1998,3172222MINHUAFENG,LEENVANDERDOES,ADRIAANBANTJESIRONCHELATINGRESINS3SYNTHESIS,IRONCHELATINGPROPERTIES,ANDINVITROANTIBACTERIALACTIVITYOFCOMPOUNDSCONTAINING3HYDROXY2METHY
21、L4LHPYRIDINONELIGANDSJJOURNALOFMEDICINALCHEMISTRY,1993,36192822282123徐海军,刘俊良,胡方宏等禽霍乱蜂胶灭活疫苗研制中的铁螯合剂适宜浓度确定J安徽农业科学,2007,3551378137924霍健聪,邓尚贵,谢超多肽亚铁螯合物制备及抑菌活性研究食品与机械,2009,251868925TOMBERGAN,JOKLAVENESSCHELATINGAGENTSJCHEMOTHERAPY2001,47101426MA,MD,DCHROBERTMCDONALDDEFEROXAMINEANDDIETHYLENETRIAMINEPENTAA
22、CETICACIDDTPAINTHALASSEMIAJJOURNALOFPEDIATRICS,2006,694563571本科毕业设计（20_届）铁离子对微生物生长的影响及螯合剂抑菌机理研究目录1引言22材料与方法311试验材料与设备3211菌株3212主要试剂3213培养基3214主要设备322试验方法4221菌种保藏与活化4222铁含量测定4223铁依赖实验5224螯合剂的抑菌作用53结果与讨论631培养基中的铁含量测定结果632四种菌的适宜铁浓度7321适宜铁浓度分析7322加入铁离子价态选择说明833培养基的选择834螯合剂的抑制效果9341细胞结构对抗菌效果的影响11342蜡样芽孢菌
23、抗性对抗菌效果的影响12343细菌适宜生长铁浓度对抗菌效果的影响124结论13致谢13参考文献140摘要本文通过研究铁对微生物生长的影响，从而进一步研究铁螯合剂的抑菌效果及抑菌机理。根据所测定的脑心浸液培养基及普通营养琼脂培养基中铁的含量，在基本培养中加入不同浓度的铁离子，通过微生物的长势得出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和铜绿假单胞菌四种细菌的适宜铁生长浓度分别为40、60、20、40MG/L。此外，测定了DTPA等五种不同铁螯合剂对这四种细菌的抑制效果，结果发现这五种铁螯合剂对四种菌有不同程度的抑制，但不能完全抑制，且对阳性菌的抑制效果好于阴性菌。关键词细菌；抗菌；铁；螯合剂ABS
24、TRACTTHEIMPACTOFIRONONMICROBIALGROWTHWASSTUDIED,THENTHEANTIBACTERIALACTIVITYOFIRONCHELATORSANDINHIBITIONMECHANISMWEREFURTHERSTUDIEDTHEOPTIMUMGROWTHCONCENTRATIONOFIRONOFESCHERICHIACOLI,STAPHYLOCOCCUSAUREUS,BACILLUSCEREUSANDPSEUDOMONASAERUGINOSAWERE40,60,20,60MG/LRESPECTIVELYBYADDINGDIFFERENTCONCENTRA
25、TIONSOFIRONINTOBASICCULTUREMEDIUM,ACCORDINGTOTHEMEASUREDBRAINHEARTINFUSIONAGARMEDIAANDTHEGENERALNUTRITIONCONTENTOFIRONINADDITION,TTHEINHIBITORYEFFECTONABOVEFOURKINDSOFBACTERIAOFDTPAANDOTHERFOURCHELATINGAGENTSWEREMEASUREDTHEGROWTHOFFOURKINDSOFBACTERIAHADBEENSUPPRESSED,BUTCANTCOMPLETELYINHIBITION,ANDT
26、HEEFFECTONGRAMPOSITIVEBACTERIAWEREBETTERTHANGRAMNEGATIVEBACTERIAKEYWORDSBACTERIAANTIBIOSISIRONCHELATINGAGENT11引言由细菌、病毒和霉菌等导致的微生物危害，使人们长期以来采用各种方法与各类微生物的危害进行斗争，抗菌一直是人类所关注的课题。近些年来，接连发生“非典”、“禽流感”、“甲流”等各种致病性微生物对人类社会的危害事件，细菌性食物中毒事件也时有发生，越来越引起人们对抗菌课题的关注。而当这些有害菌对传统的抗菌剂产生抗药性时，寻找新的安全有效的抗菌剂已成为亟需解决的重要课题。抗菌剂的研究始
27、于20世纪80年代初。近年来，随着合成技术的发展，人们开发了许多抗菌剂，在医药、食品中得到了广泛的应用。目前，已研制及应用的抗菌剂可归为天然抗菌剂、有机抗菌剂及无机抗菌剂。天然抗菌剂是人类最早使用的抗菌剂，它是从某些动植物体内提取出的具有抗菌活性的高分子有机物。最常用的天然抗菌剂是壳聚糖及其衍生物，它是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同程度的抑制作用1。壳聚糖具有质子化铵，质子化铵又带有正电荷，因此能与细菌带负电荷的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能，造成细菌体内细胞质流失，从而抑制细菌生长。分子量小的壳聚糖还可以通过直接进入细菌体内，干扰细菌的正常生理代谢，使之由内部
28、瓦解衰亡。有机抗菌剂是通过化学反应破坏细胞膜，使蛋白质变性、代谢受阻，从而起到杀菌、防腐及防霉等作用。其作用速度快，可操作性好，稳定性强，对微生物的抑制作用具有一定的特异性。季铵盐类是目前国际上使用最广泛的有机抗菌剂，早在1995年KOURAIH2等人就发表了关于含有不饱和烷基的季铵盐抗菌剂具有高效、广谱抗菌活性的报道。无机抗菌剂是通过将无机抗菌成分与载体结合而制成，其中，载银抗菌剂抗菌能力最强，故已商品化的抗菌剂多是银系抗菌剂。根据杀菌机理的不同，又可以分为溶出型和光催化型两种。溶出型无机抗菌剂的主要品种包括以沸石、活性炭、羟基磷灰石等为载体的银、铜、锌等金属离子无机抗菌剂。光催化型无机抗菌
29、剂的价格极为低廉，且无毒，主要品种有钛型TIO2、ZNO、SIO2等。铁是微生物生长的必需元素之一。它是电子传递链中铁硫蛋白的氧化还原中心，参与核苷酸前体的还原反应，是必不可少的营养因子。一切生物有机体从细菌到人类，其生存都需要有铁的参与。铁是地壳中含量居于第四位的元素，虽然含量丰富，但大多数生物机体却不能得到充分供给，因为FE3在PH7的条件下溶解度很小，FE3的浓度不超过1018M，而微生物生长的最低浓度约为107105M。嗜铁素是指一类由微生物在低铁条件下合成的小分子量的，能特异地螯合FE3的一种螯合因子。它们的合成受铁浓度的调节，它们被分泌到微生物的细胞外或细胞表面作为螯合因子来获取F
30、E3或者将铁变为可溶形式以便微生物利用。它与FE3的结合能力非常强，并且有特异性，可以从各种水溶性和非水溶性的化合物中夺走FE3。嗜铁素通常是在好氧和兼性厌氧微生物中产生，还没有发现在严格厌氧、乳酸杆菌和高等生物中产生3。嗜铁素先与寄主的铁结合形成铁嗜铁素复合物，这种复合物与细菌外膜上存在的一种特殊受体2专门结合，然后将铁释放到菌体内，提供细菌生长繁殖所需要的铁，从而使加重感染或扩散。同时，嗜铁素还可催化生成OH，进一步加重组织损伤，对细菌的生长繁殖实际上起到了辅助作用4。大多数微生物如大肠杆菌、克雷白杆菌、沙门氏菌及假单胞菌等都是通过释放铁螯合物与宿主的铁结合蛋白竞争而获得铁5。有些细菌如链
31、球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、溶血性巴斯德氏菌和肺炎支原杆菌不能合成嗜铁素，但它们的菌体膜上表达乳铁蛋白受体，这样也可以直接地和宿主乳铁蛋白结合，从而由宿主含铁蛋白上获取铁6。有些微生物还可以通过合成蛋白水解酶释放到周围环境中，去降解宿主铁结合蛋白，从中获取所需要的铁7。螯合剂在食品和化妆品中具有抑菌作用是近些年才发现的。TOM等人用多种螯合剂对细菌和酵母菌进行抗菌实验发现，EHPG能一直十种不同的葡萄球菌，而DTPA效果较差8。食品中常用的螯合剂有柠檬酸盐、乳酸盐、焦磷酸盐和EDTA等9。铁螯合剂就是其中比较重要的一种，铁螯合剂能够与铁离子形成螯合物，因而降低环境中游离铁的浓度，从而达到
32、抑制细菌生长的作用。LEEN10等人于93年就发现具有螯合三价铁功能的HMP能有效抑制大肠杆菌和李斯特氏菌的生长。基于铁螯合剂有效的抗菌作用，在医药、食品等领域得到了广泛的应用。例如已经商品化的二乙烯三胺五乙酸（DIETLYLENETRIAMINEPENTAACETICACID,DTPA）作为一种铁离子螯合剂成功地应用到医疗领域。因此，本文研究了铁对微生物生长的影响，并且对几种抗菌剂的抗菌效果及机理进行研究和探讨。2材料与方法11试验材料与设备211菌株大肠杆菌ESCHERICHIACOLI、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS、蜡样芽孢杆菌BACILLUSCEREUS、铜绿
33、假单胞菌PSEUDOMONASAERUGINOSA由实验室分离得到。212主要试剂邻菲罗啉、盐酸羟胺、硫酸亚铁胺、硫酸、盐酸、醋酸钠213培养基脑心浸液培养基（BHI）苏州兴化市联发化工试剂有限公司脑心浸液琼脂培养基（BHI）苏州兴化市联发化工试剂有限公司基本培养基G/L磷酸氢二钾6G；磷酸二氢钾3G；硫酸铵1G；琥珀酸4G；水1000ML。调节PH至7左右，灭菌后加入10ML1M硫酸镁，10ML45MM氯化钙。3214主要设备快速蒸汽灭菌锅天津超拓制造生化培养箱上海精宏实验设备有限公司无菌操作台上海精宏实验设备有限公司新型电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂密封式恒温可调电炉嘉兴市欣欣仪器设备有
34、限公司CARY100紫外/可见光分光光度计美国瓦里安公司电子天平余姚市金诺天平仪器有限公司AB204S电子天平上海台衡仪器仪表有限公司22试验方法221菌种保藏与活化普通营养琼脂斜面挑取一环至5MLBHI培养基中，37下培养24小时活化。菌种短期保藏可采用普通营养琼脂斜面划线，37下培养24小时后置于冰箱中冷藏保存；菌种长期保藏可采用普通营养琼脂斜面环线，37下培养24小时后，加入灭菌后的石蜡油至超过培养基1CM，置于冰箱中冷藏保存。222铁含量测定2221试剂配制012的邻菲罗啉水溶液称取012G邻菲罗啉置于烧杯中，加入60ML水，加热至80左右使之溶解，移入100ML容量瓶中，加水至刻度，
35、摇匀备用。10盐酸羟胺溶液称取10G盐酸羟胺NH2OHHCL，溶于纯水中，并稀释至100ML。铁标准贮备液准确称取07020G硫酸亚铁胺NH4FESO46H2O，溶于11硫酸50ML中，转移至1000ML容量瓶中，加水至标线，摇匀。该溶液为每毫升含铁100G。使用时用水配制成每毫升相当于2G铁。50醋酸钠溶液盐酸2222样品消化称取脑心浸液培养基与营养琼脂培养基各100G，置于瓷坩埚中，在小火上炭化后，移4入550高温炉中灰化成白色灰烬，取出，加入2ML11盐酸，在水浴上蒸干，再加5ML水，加热煮沸后移入100ML容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。2223标准曲线绘制准确吸取00、10、20、3
36、0、40、50ML每毫升相当于2G铁的标准溶液，分别移入50ML容量瓶中，各加入5ML水后，加入1ML19盐酸溶液、1ML10盐酸羟胺溶液及1ML012的邻菲罗啉溶液，用50醋酸钠溶液调节至PH35，混匀后用水稀释至50ML，摇匀后置于分光光度计510NM波长进行比色测定。2224样品测定准确吸取样品溶液5ML（由于BHI中铁含量较高，事先稀释一倍），移入50ML容量瓶中，各加入5ML水后，加入1ML19盐酸溶液、1ML10盐酸羟胺溶液及1ML012的邻菲罗啉溶液，用50醋酸钠溶液调节至PH35，混匀后用水稀释至50ML摇匀后置于分光光度计510NM波长进行比色测定，以空白为参比，并从标准曲线
37、中查出铁含量。223铁依赖实验2231试剂的配制不同含铁量培养基系列一的配制准确称取硫酸亚铁10G，溶解于1L超纯水中，分别吸取00、20、40、60、80ML至1L为灭菌的基本培养基中，调节PH至7左右，灭菌后加入10ML1M硫酸镁，10ML45MM氯化钙。不同含铁量培养基系列二的配制准确称取11050G、22099G、33149G、44199G脑心浸液培养基至1L未灭菌的基本培养基中，调节PH至7左右，灭菌后加入10ML1M硫酸镁，10ML45MM氯化钙。配成铁含量为20、40、60、80MG/L的培养基。2232菌悬液制备及铁作用斜面挑取一环到5ML脑心浸液培养基中，37培养24小时。用
38、移液器吸取50L菌悬液至5ML不同铁含量的培养基系列一、系列二中，37培养24小时。2233菌体计数菌体浓度采用比色法测定600NM光密度（OD600），每个OD相当于细胞干重0359G/L。同时取三个连续的合适的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个5平行。等待培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。224螯合剂的抑菌作用2241菌悬液的准备斜面菌种挑取一环接种到脑心浸液琼脂斜面上，37培养24小时。然后再挑取一环接种到5ML的脑心浸液培养基上，37再培养24小时。接着，用移液器吸取50L转移一支新的脑心浸液培养基上，放到37的培养箱中培养，直到其终浓度达
39、到106CFU/ML，大约需要1820小时。2242螯合作用所有的试样将在1575MM的试管中进行，培养基为脑心浸液培养基，所有的试管中包含80L抗菌剂和20L菌悬液。对照管中只包含20L菌悬液和80L无菌水。37，作用2小时。2243稀释培养与统计取三个连续的合适的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个平行。等待培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。3结果与讨论31培养基中的铁含量测定结果目前溶液中铁离子的测定方法有原子吸收法，极谱法，重铬酸钾法，容量法，分光光度法等。其中分光光度法测定铁的方法较多，有的用双波长法测定溶液中铁离子及其它离子含量，有的选用
40、不同显色剂测定铁离子含量如硫氢酸钾结晶紫、邻二氮菲等11。本文选用显色剂邻二氮菲的分光光度法测定脑心浸液培养基及普通营养琼脂培养基中铁的含量。邻二氮菲又称邻菲啰啉，是一种显色剂，它与FE2在PH2060溶液中形成橙红色配合物，该络合物在PH值为345时最为稳定避光情况下可稳定半年，普通实验条件下8H内溶液的吸光度没有变化12。邻菲罗啉能与某些金属离子形成有色络合物而干扰测定。但在乙酸乙酸胺的缓冲溶液中，不大于铁浓度10倍的铜、锌、钴、铬及小于2MGL的镍，不会干扰测定13。本实验条件相对容易控制，显色后溶液的稳定性好，方法简单易行。测定结果如表1所示，铁标准曲线如图1所示。表1邻菲啰啉法测定微
41、量铁试验的结果TABLE1THEOFRESULTSPHENANTHROLINEMETHODFORTHEDETERMINATIONOFIRONTEST6溶液铁标准溶液样品1样品2量取体积/ML01234555铁标液浓度/（G/ML000040080120160200X1X2吸光度/A0000000063001590026700333004410038900009注其中样品1为脑心浸液培养基，样品2为营养琼脂培养基。图1邻菲啰啉法测定微量铁标准曲线FIGURE1THESTANDARDCURVEPHENANTHROLINEMETHODFORTHEDETERMINATIONOFIRON由图1可以得出吸
42、光度与浓度的线性方程为Y00215X，相关系数R09927，按方程计算得出X1362G/ML，X2021G/ML，样品中铁的含量按式1计算XFE（MG/KG）M/W式1式中M为从标准曲线中查得的铁的质量（G）；W为测定时用品的质量（G）。求得脑心浸液培养基中XFE18150100/5181000MG/KG。同理求得营养琼脂培养中XFE2093MG/KG。32四种菌的适宜铁浓度铁是微生物生长必需的微量元素之一。细胞内许多的蛋白质，特别是一些酶类，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、核糖核苷酸还原酶等，都是含铁蛋白质，铁及其相关的化合物是相当重的酶辅基14。从呼吸链到核糖核苷酸的生物合成等细
43、胞内一系列重要的代谢活动都与铁离子有关。铁在微生物生长过程中作用主要有构成有机化合物，合成菌体组分；作为酶的组成成分，维持酶的活性；参与能量的储存于转运；调节细胞的渗透压；与微生物生长繁殖和致病作用密切相关15。通过该实验了解不同的铁浓度对微生物生长的影响。7321适宜铁浓度分析在基本培养基中加入直接加入硫酸亚铁来培养菌的，用分光光度法测OD值以及稀释到平板法，四种菌均不生长。而在基本培养基中加入不同量的脑心浸液培养基，测其OD值结果梯度不明显，分析其原因可能是随着脑心浸液培养基加入量的增加，培养基颜色会逐渐增加，并且会逐渐浑浊，因而影响实验结果的测定。图2所示为四种菌在基本培养基中加入不同量
44、的脑心浸液培养基用稀释到平板法所测得的结果，其中X轴表示，根据加入的脑心浸液培养基含量计算得出加入铁的含量脑心浸液培养基中铁含量为181000MG/KG，由邻菲啰啉法测得），Y轴表示菌落数。图2四种菌最适铁生长浓度结果曲线FIGURE2THECURVEOFFOURBACTERIASMOSTSUITABLECONCENTRATIONOFIRON从上图可知，蜡样芽孢杆菌的最适铁生长浓度为20MG/L，大肠杆菌的最适铁生长浓度为40MG/L，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的最适铁生长浓度为60MG/L，且四种菌的最适铁浓度条件下，其生长情况均不如在纯脑心浸液培养基中好，大肠杆菌的情况尤为明显。同时，我
45、们也可以看到，当铁含量达到一定浓度之后，随着铁加入量的增加，螯合剂对于这四种菌的促进作用并不增长。查阅文献也发现，通过在培养基中添加一定量的铁盐，可提高酵母体内铁元素的含量，并且提高酵母活性，但超过一定的范围反而对酵母的生长有抑制作用16。322加入铁离子价态选择说明细胞内许多氧化还原酶都是以二价铁为辅基。细菌在摄取利用环境中的FE3时，也是先将其还原成FE2之后再释放，尽管这是一个消耗能量的过程14。朱才庆17等人在葡萄糖为碳源的M培养基中添加FECL3或FESO4，发现无论是FE2还是FE3都能使DH5和DA19细胞生长改善，菌体得率增加，但是添加FE2效果比FE3明显。因此在本次实验过程
46、当中选择在基本培养基中直接加入FESO4，然而结果发现，其培养效果很差，四种细菌均不能8正常生长。现推测，可能是由于基本培养基中用磷酸盐作为缓冲液，FE2加入后会形成沉淀，细菌几乎不能利用，因而最终不能生长。而在基本培养中加入脑心浸液培养基，其中含有的铁多为生物结合态，不容易与磷酸盐形成沉淀，并能直接被微生物所利用。在前面的实验中，已经测出脑心浸液培养中铁的含量，因此可以根据加入的脑心浸液培养基量来确定微生物的最适铁生长浓度。33培养基的选择从上文可以看出，脑心浸液培养基中铁含量达到1810MG/KG，含量十分丰富，而普通营养琼脂培养基中铁含量仅为2093MG/KG，含量较少。同时我也对这两种
47、培养基的培养能力作了一个比较，分别从细菌浓度为107菌悬液中吸取50L菌液至5ML的牛肉膏蛋白胨培养基和脑心浸液培养基，37下培养24H后，选取三个连续的适宜的稀释度，吸取50L稀释液加到培养皿中，倒上培养基。并做两个平行。等待培养基干后倒置放到培养箱中培养24小时，第二天平板计数。结果如图4所示图4普通营养琼脂和脑心浸液培养基培养能力比较FIGURE4ORDINARYNUTRIENTAGARANDBRAINHEARTINFUSIONCULTUREMEDIUMCAPACITYCOMPARE从上图我们可以明显看出普通营养琼脂的培养能力远远不如脑心浸液培养基的培养能力。由此看来，脑心浸液培养基因其
48、富含铁而适宜细菌生长，因此铁螯合实验选择用脑心浸液培养基来培养菌。34螯合剂的抑制效果大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抑制曲线结果如下图所示表21四种抗菌剂对大肠杆菌抑制率TABLE21THERATEOFINHIBITIONOFFOURANTIMICROBIALAGENTSONESCHERICHIACOLI9浓度G/ML抗菌剂5001000150020002500SXF004006009012016CPD02004006011018024TZ27003006010013028TZ58003006008010029DTPA006009010018056注大肠杆菌原菌液浓度为
49、324106CFU表22四种螯合剂对金黄色葡萄球菌抑制率TABLE22THERATEOFINHIBITIONOFFOURANTIMICROBIALAGENTSONSTAPHYLOCOCCUSAUREUS浓度G/ML抗菌剂5001000150020002500SXF003005008023029CPD02002004013017026TZ27002006009015029TZ58001004006014029DTPA010020051065083注金黄色葡萄球菌原菌液浓度为379106CFU表23四种螯合剂对蜡样芽孢杆菌抑制率TABLE23THERATEOFINHIBITIONOFFOURANTIMICROBIALAGENTSONBACILLUSCEREUS浓度G/ML抗菌剂5001000150020002500SXF004005023027033CPD02003004009026032TZ27004004009028034TZ58003004010029035DTPA008010017053079注蜡样芽孢杆菌原菌液浓度为366106CFU表24四种螯合剂对铜绿假单胞菌抑制率TABLE24THERATEOFINHIBITIONOFFOURANTIMICROBI
