1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全酶法提取乌贼眼中透明质酸的研究一、选题的背景与意义透明质酸HYALURONICACID,简称HA,又名玻璃酸,是一种高分子量的直链多糖。它是由132乙酰氨基2脱氧D葡萄糖14DD葡萄醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖。作为蛋白聚糖的结构核心,它与胶原、纤粘连蛋白、层粘连蛋白一起,广泛分布在动物和人体组织和细胞外基质中,对细胞运动、增殖、分化和稳定细胞与组织的表现型等,均有重要作用。HA水溶液所形成凝胶的独特网状结构和分子内羟基氢键使其具有极好的保水性和流变特性，与传统的保湿剂相比,HA具有更高的保湿效果,且无油腻和阻塞皮肤等缺点，因而被广泛应用于医学、食品
2、、化妆品等领域。透明质酸广泛存在于动物组织中，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授MEYER等首先从牛眼玻璃体中分离得到的。目前，已经在动物眼玻璃体、皮肤、脐带，鸡冠等组织中分离得到了透明质酸。乌贼是我国四大海产大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼之一，是沿海常见的一种产量很高的软体动物，肉厚味美,营养丰富,具有重要的经济价值与药用价值。目前，人们对乌贼的利用与开发主要为其骨、肉、墨、血和卵。乌贼骨海螵蛸具有各种收敛作用,表现为止血,可治多种内外出血,单用有效表现为制酸,可中和过多胃酸,对胃溃疡、十二指肠溃疡沦生溃疡及部分慢性胃炎等有效,另外在皮肤、粘膜包括体内表面确有制泌、收敛、降低血管通透性的作用,化
3、学处理过的海螵蛸还可用作接骨材料,甚至还有抗肿瘤、防辐射的功效。乌贼肉质鲜美,营养丰富,药用价值高,是海洋带给人类的一种高蛋白、低脂肪的佳食良药。乌贼肉有活血化淤之效,不但补气、补血且可滋阴。乌贼墨在可以用于止血,增强对细胞免疫功能及抗肿瘤功能以及提取物制毛发强壮剂,用于生发、黑发。乌贼血据本草纲目载,可主治耳聋。乌贼卵可用于开胃利水，乌鱼蛋是同雌墨鱼的缠卵腺加工制成的。乌鱼蛋之所以名贵，系因其营养丰富、味道鲜美，有冬食去寒夏食解热之功效，且富含人体必需的多种微量元素。然而乌贼头两侧一对发达的眼睛，却没有得到很好的利用。据统计，水产品加工过程中产生大约1540的下脚料，其中鱼眼约占25，通常这
4、些下脚料包括乌贼眼会被人们忽视，乌贼眼较大，晶状体所占体积也大，如果对其加以利用，从中提取具有广泛应用的透明质酸，不仅能丰富我们对乌贼的开发利用，同时能带动水产品的加工利用，减少渔业资源浪费，而且提取出的透明质酸，能应用于人们的日常生活之中，提高人们的生活质量。因此，本课题利用乌贼眼提取透明质酸具有重要的经济利益和社会利益二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1查找相关文献，初步设计实验方案，确定透明质酸含量的测定方法2以透明质酸得率为指标，确定温度、PH、加酶量以及酶解时间对中性蛋白酶水解提取乌贼眼中透明质酸的影响3采用响应面法优化中性蛋白酶的酶解条件，确定最佳酶解方案。拟解决的
5、主要问题1研究各个酶解单因素对提取乌贼眼中透明质酸的影响，得出各个因素的最佳水平2根据单因素实验结果，采用响应面法优化最佳酶解条件，确定最佳酶解方案。三、研究的方法与技术路线研究方法1乌贼眼玻璃体营养成分测定11水分测定直接干燥法GB/T500932003。12灰分测定灰化法GB/T969518200813总蛋白测定凯氏定氮法法GB/T50095200314总糖测定蒽铜硫酸法2透明质酸的提取21乌贼眼前处理洗净，挑破眼珠，取眼液，18冻藏；用时4解冻，匀浆。22盐溶处理用02MOL/L氯化钠溶液振摇4H23酶解231酶活力测定福林（FOLIN）法232葡萄糖醛酸标准曲线采用咪唑法233单因素试
6、验因素选择温度、加酶量、酶反应时间以及PH，以透明质酸得率（或葡萄糖醛酸含量）为指标。234响应面试验在单因素试验的基础上进行，以透明质酸得率（或葡萄糖醛酸含量）为指标，确定提取工艺。技术路线四、论文的总体安排与进度2010年11月11日2011年2月24日查找相关文献，初步设计实验方案2011年2月25日3月1日进行试验设计，采买实验原料2011年3月2日4月20日按照试验设计进行实验，并根据实验进展进行适当修改，记录实验数据2011年4月21日5月4日处理实验数据，撰写毕业论文2011年5月5日5月18日交由指导老师修改2011年5月19日5月26日修改毕业论文，准备毕业答辩五、主要参考文
7、献1杨晓燕贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物,1999,246472刘艺王和鸣海螵蛸接骨动物实验的组织学研究J中国中医骨伤科，199535683窦光宇亦真亦幻话乌贼J百科知识,2007327284刘智禹,江琴乌贼内脏粉的营养价值及其安全性研究J福建农业学报,2005,2042712745罗瑞明透明质酸HA的国内外研究现状J宁夏农学院学报，2001，22（1）62646黄光斗,赵宇,张方樱等透明质酸的制备与应用研究进展J广西轻工业,2002,124267郭风仙,凌沛学,郭学平等透明质酸的生理功能及其在化妆品和美容保健食品中的应用J中国商办工业,2002,945468董学畅,张淑桂透明质酸的制备和
8、应用J云南化工,1994,238409生举正,凌沛学,王凤山透明质酸生物合成的研究进展J中国生化药物杂志,2009,30213513810杜平中透明质酸的皮肤保健功能J中国生化药物杂质,1998,19528328411常育,姚宏,兰英透明质酸的制备方法J延安大学学报医学科学版,2009,73129130乌贼原料乌贼眼液02MOL/L氯化钠溶液振摇4H酶解不同温度、PH、加酶量、酶解时间透明质酸得率测定优化灭酶、离心、稀释12颜延宁鸡冠中透明质酸的提取J广西轻工业,2006,5404213朱广华,方煜平透明质酸制备方法及应用研究的进展J中国医药工业杂志,1996,2838238514杜林繁,卢家
9、炯,马森等粘多糖的生物功能及其分离制备的研究概况J广西轻工业,2008,106715赵玉红,迟玉杰蛋壳膜中透明质酸的提取及部分特性研究J食品工业科技,2008,0617217416秦乾安,周小敏,励建荣鱿鱼眼提取透明质酸去蛋白质酶解工艺研究J食品工业科技,2009,0121421817姚美琴,褚俊杰,陈小娥鱿鱼眼透明质酸的提取工艺研究J食品科技,2009,34524124418王菁，杨佳玉，金淼等鱿鱼眼透明质酸降解工艺条件研究J食品科学,2009,3023824119汪健，汪清，谢镇酶解条件控制对透明质酸工业化提取的影响J2010,411202320凌沛学透明质酸M北京中国轻工业出版社1985
10、21顾其胜,严凯透明质酸与临床医学M上海,第二军医大学出版社,200322马宇翔,王春玲,郭兴凤中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究J粮油加工,2006,8505323刘智勇,李和生几种蛋白酶对文蛤肉的酶解工艺条件研究J天然产物研究与开发,2009,2151752424刘军海，黄宝旭，蒋德超响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究J食品科学,2009,3011411825刁小琴,关海宁,马松艳等微波辅助响应面酶法优化南瓜多糖提取工艺的研究J粮油加工,2010,109295毕业论文文献综述食品质量与安全透明质酸的研究现状摘要本文从乌贼和透明质酸的研究现状出发，着重介绍了透明质酸各方面的性质与功能，提取制
11、备方法，以及其在化妆品、临床医学及保健食品中的应用情况，明确了从乌贼眼中提取透明质酸的重要意义。关键词透明质酸（HA）；提取；应用；乌贼RESEARCHINTHEHYALURONICACIDABSTRACTTHISARTICLEFROMHYALURONICACIDRESEARCHSTATUSQUO,INTRODUCESEMPHATICALLYHYALURONICACIDALLASPECTSOFNATUREANDFUNCTION,EXTRACTIONPREPARATIONMETHODS,ANDITSCLINICALMEDICINEANDCOSMETICS,THEAPPLICATIONOFHEAL
12、THFOOD,MADECLEARTHEEXTRACTEDFROMSQUIDEYESTHEIMPORTANTSIGNIFICANCEOFHYALURONICACIDKEYWORDSHYALURONICACIDHAEXTRACTIONAPPLICATIONSQUID1透明质酸的简介透明质酸HYALURONICACID,简称HA,又名玻璃酸,是一种高分子量的直链多糖,它是由132乙酰氨基2脱氧D葡萄糖14DD葡萄醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖1。HA具有许多天然粘多糖共有的性质，呈白色，无定形固体，无嗅、无味，有吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂2。HA最突出的特点是水溶液有独特的黏弹性，由于透明质
13、酸含多个羟基、羧基,能与水分子形成氢键,有很强的保水作用,是国际上公认的最好的保湿剂3。HA广泛存在于动物的各种组织中,其中以哺乳动物体内的玻璃体、关节滑液和脐带、鸡冠含量最高4。1934年MEYER和PALMER首先从牛眼玻璃体内提取分离得到该物质。此后，人们对HA的分布、化学结构、理化性质、生理作用、制备工艺及其应用方面进行了广泛深入的研究，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用5。2透明质酸研究现状21透明质酸的性质与功能HA分子受直链链轴上单糖间氢键的作用，可以吸收和保持水份约为其本身重量的L000倍；又因螺旋空间外侧具有疏水性，使这些水份在螺旋柱内相对固定，不易流失3。HA其保水性不易受
14、外部环境影响,吸湿量随着相对湿度上升而未明显增加。在低湿度下,能保持皮肤的一定水分,呈水淋淋状态而在高湿度下,不致使皮肤发粘,是一种理想的保湿剂6。HA具有良好的成膜性和润滑性6。在HA分子中,带负电的羧基与粘膜上带正电的基团有较强的亲和力,在粘膜表面形成一层生物膜,起到保护和润滑作用。HA能降低皮肤的摩擦阻力,起到很好的皮肤润滑作用。HA具有抗氧化功能，通过与自由基的反应,HA在体内可成为消除自由基的清道夫7。HA还具有促创伤愈合作用，增强粒细胞的吞噬活性，调节炎症反应，促进血管生成8。HA水溶液是一种非牛顿型流体,有着良好的粘弹性和应变性。当HA处于封闭的问隙，增加了基质的渗透压，使得HA
15、所存在的部位、组织具有较好的抗压性和弹性9。22透明质酸的提取制备221从生物原材料中提取以生物组织为原料，主要是公鸡冠、人脐带、动物眼球中提取透明质酸，主要工艺过程包括提取、除杂、沉淀和分级分离，不同组织HA的提取纯化过程有一定差别10一般采取盐提法或酶解法，酶解法效果更佳。例如用酶解法从鸡冠中提取得到透明质酸，工艺简单，生产环节少，降低了对透明质酸的破坏，生产同一批号的透明质酸性能相近，说明工艺稳定可靠11。乌贼，一般俗称它为墨鱼,是我国四大海产大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼之一，是沿海常见的一种产量很高的软体动物，肉厚味美,营养丰富,具有重要的经济价值与药用价值。目前，人们对乌贼的利用与开发
16、主要为其骨、肉、墨、血、卵及内脏。目前，人们对乌贼的利用与开发主要为其骨、肉、墨、血、卵及内脏。乌贼骨又名海螵蛸，可治多种内外出血,单用有效表现为制酸,可中和过多胃酸,对胃溃疡、十二指肠溃疡沦生溃疡及部分慢性胃炎等12,另外在皮肤、粘膜包括体内表面确有制泌、收敛、降低血管通透性的作用,化学处理过的海螵蛸还可用作接骨材料,相容性好且不引起炎症、毒性及排斥反应13，并且还有抗肿瘤、防辐射的功效。乌贼肉质鲜美,营养丰富,有活血化淤之效,不但补气、补血且可滋阴14。乌贼墨在我国最初用于止血,当今对其的研究包括增强对细胞免疫功能及抗肿瘤功能，以及提取物制毛发强壮剂,用于生发、黑发12。乌贼血可主治耳聋。
17、乌贼卵可用于开胃利水【1】，乌鱼蛋是同雌墨鱼的缠卵腺加工制成的，其营养丰富、味道鲜美，有冬食去寒夏食解热之功效，且富含人体必需的多种微量元素。乌贼内脏粉蛋白质含量高，氨基酸组成较理想，除具备必需氨基酸外，还含有丰富的含硫多功能氨基酸牛磺酸，富含卵磷脂和胆固醇，可作为对于甲壳类动物的生存和生长具有重要的作用的饲料15。然而乌贼头两侧一对发达的眼睛，却没有得到很好的利用。据统计，水产品加工过程中产生大约1540的下脚料，其中鱼眼约占25，通常这些下脚料包括乌贼眼会被人们忽视。乌贼眼较大，如果对其加以利用，从中提取具有广泛应用的透明质酸，不仅能丰富我们对乌贼的开发利用，同时能带动水产品的加工利用，减
18、少渔业资源浪费，而且提取出的透明质酸，能应用于人们的日常生活之中，提高人们的生活质量。222微生物发酵法制备1937年FORRESTETAL首次发现链球菌可以产生HA，随后有大量研究，这些研究证明很多A群和C群链球菌荚膜中的HA和动物组织中的HA在化学本质上是一致16。用链球菌制备的过程一般如下链球菌复苏培养后,用诱变剂诱变,从中挑出不溶血、不含酶的高产率菌株。对该菌株稳定传代后增菌培养,所得菌即可作为生产菌株。把生产菌株放入特定培养液中,在通风搅拌情况下发酵左右,对粘稠的培养液用化学手段处理后即可得到分子量高、粘度大的HA17。23透明质酸的应用现状231透明质酸在化妆品中的应用HA现已广泛
19、地用在基础化妆品乳剂、霜剂、化妆水、美容液、润肤等妇女用化妆品底霜、口红、唇青、眼睑膏、粉饼、描眉脂等头发化妆品香波、发乳、头发调理剂、烫发剂等；其它化妆肥皂、洗面料、浴剂、药用化妆品等6。现已确证,当透明质酸化妆品涂于皮肤后,可以形成一层薄膜而具有很强的保湿性、弹性和表皮平滑性。分子量较小的透明质酸可渗入皮肤真皮层,扩张毛细血管,改善中间代谢,促进皮肤营养的供给和废物的排泄从而使皮肤表面光滑、柔嫩,延长或防止皮肤老化,有效地起到抗皱、去皱和美容的作用。目前含透明质酸的化妆品被国际上公认为“第四代化妆品”、“仿生化妆品”等,许多国家在竞相研究开发【8】。232透明质酸在临床上的应用在眼科手术，
20、HA具有保护角膜上皮，维持角膜透明，维护正常前房，保护眼内组织，协助散瞳，防止玻璃体脱出，帮助止血，支撑囊袋，润滑缝线等作用，故广泛用于穿透性角膜移植术、抗青光眼术、白内障超声乳化吸出术、人工晶体取除术、玻璃体视网膜术、眼外伤等各项眼科复杂手术2。KERIMOLU、KANG等人1819研究表明HA可明显促进骨折愈合。HA对骨性关节炎OA、类风湿性关节炎RA等关节疾病的治疗效果明确、安全，具有很好的应用前景16。黄建艳等20制备成琼脂糖一HA共聚物，再用该共聚物包载胰岛素，释药实验表明包载的胰岛素具有缓释行为；LEE等21研制出一种HA一紫杉醇结合物，它在水溶液中可形成纳米级胶束聚集体，且在酸性
21、条件下紫杉醇可完整地从胶束中解离，具有靶向性和控释作用，作为特异性肿瘤拮抗剂具有潜在的应用前景；KUMAR等22研究发现，FE2O3可以作为将HA与纳米粒连接的“桥梁”，并成功地研制出新型HAFE2O3纳米级脂质体，同时发现这种新型脂质体几乎能够全部将多肽药物输送至靶点。HA还应用于医学美容中，一是对皮肤科的应用，HA能用来治疗皮肤炎症，促进组织的再生、重塑和愈合过程中，对肌肤进行再生性修复，不留疤痕；二是透明质酸作为皮肤填充剂用于注射美容23。此外，作为诊断某些疾病的指标,HA体现出它独特的价值11。233透明质酸在保健食品中的应用20世纪80年代末，口服HA美容保健食品出现于日本。其理论依
22、据是24,25HA经口服消化吸收后，增加了体内HA合成的前体，使体内HA含量提高并集中定位于皮肤组织，进而增强皮肤的保水能力，软化皮肤角质层，达到改善肌肤弹性和减少皱纹的功效目前，HA在美国、日本等国被广泛用于美容保健食品中，均得到消费者认可3。口服HA产品也有了不同的形式,如片剂、胶囊剂和口服液。234其他应用HA还被用于油墨中，ARISAWA研究表明，普通墨水中加入05HA，墨水不易风干失水。自来水笔用普通墨水暴露空气中6小时就会出现水畅，而加HA后，10天内均可正常使用2。3展望HA是一种极有市场开发价值的生物产品,随着人们对HA理化性质、生理功能研究的深入，以及对其各种衍生物的开发，必
23、然会使HA在新型化妆品、临床医学及保健食品等各方面领域的研制中发挥越来越大的作用参考文献1罗瑞明透明质酸HA的国内外研究现状J宁夏农学院学报，2001，22162642黄光斗，赵宇，张方樱等透明质酸的制备与应用研究进展J广西轻工业，2002，124263郭风仙，凌沛学，郭学平等透明质酸的生理功能及其在化妆品和美容保健食品中的应用J中国商办工业，2002，945464董学畅，张淑桂透明质酸的制备和应用J云南化工，1994，238405生举正，凌沛学，王凤山透明质酸生物合成的研究进展J中国生化药物杂志，2009，3021351386杜平中透明质酸的皮肤保健功能J中国生化药物杂质，1998，1952
24、832847苏志达，李瑜透明质酸抗氧化作用的临床应用J南京军医学院学报，2002，2431741768宋永民，郭学平，栾贻宏等新资源食品一透明质酸J食品与药品，2009，110556599刘彤透明质酸及其在化妆品中的应用J广州化工，2009，378717310常育，姚宏，兰英透明质酸的制备方法J延安大学学报医学科学版,2009，7312913011颜延宁鸡冠中透明质酸的提取J广西轻工业，2006，5404212杨晓燕，贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物，1999，2464713刘艺，王和鸣海螵蛸接骨动物实验的组织学研究J中国中医骨伤科，1995，356814窦光宇亦真亦幻话乌贼J百科知识，20
25、07，3272815刘智禹，江琴乌贼内脏粉的营养价值及其安全性研究J福建农业学报，2005，20427127416王超，张明春透明质酸的制备及作为药用材料方面的应用进展J中国医药生物技术，2009，4645245417朱广华，方煜平透明质酸制备方法及应用研究的进展J中国医药工业杂志，1996，2838238518KERIMOLUS，LIVAOLUM，SONMEZB，ETA1EFECTSOFHUMANAMNIOTICFLUIDONFRACTUREHEAIINGINRATTIBIAJJSURGRES，2009，152（2）28L一28719KANGSW,BADALP,KANGCS，ETAIARTI
26、CULARCARTILAGEREGENERATIONWITHMICROFRACTUREANDHYALURONICACIDJBIOTECHNOLLETT，2008，30343543920黄建艳，包磊，毛萱等琼脂糖一透明质酸共聚物作为胰岛素载体J材料科学与工程学报，2009，271434621LEEH，LEEK，PARKTGHYAIURONICACIDPACLITAXELCONJUGATEMICELLESSYNTHESIS，CHARACTERIZATION，ANDANTITUMORACTIVITYJBIOCONJUGCHEM，2008，L961319132522KUMARA，SAHOOB，MONT
27、PETITA，ETAIDEVELOPMENTOFHYALURONICACIDFE203HYBRIDMAGNETICNANOPARTICLESFORTARGETEDDELIVERYOFPEPTIDESJNANOMEDICINE，2007，3213213723吴溯帆透明质酸的基本知识和临床应用J现代实用医学,2010,22436336424蒋秋燕，凌沛学，黄思玲等口服透明质酸在大鼠体内吸收机制的研究J中国药学杂志，2005，402318L1181325凌沛学，贺艳丽，李小平透明质酸口服美肤保健品的制备和应用CN99L123743P20010228本科毕业设计（20_届）酶法提取乌贼眼中透明质酸的研
28、究目录0前言131材料与方法1411实验材料与仪器14111原料14112实验试剂14113仪器与设备1412实验方法14121乌贼眼玻璃体基本成分测定14122酶活力的测定福林（FOLIN）法15123透明质酸含量测定16124工艺流程17125操作要点17126酶解工艺单因素实验18127酶解相应面试验分析182结果与分析1821乌贼眼液中基本成分测定1922酶种类的选择19221酶活力测定19222酶种类的确定1923加酶量对透明质酸提取率的影响2024酶解时间对透明质酸提取率的影响2125酶解温度对透明质酸提取率的影响2126PH对透明质酸提取率的影响2227酶解条件的优化23271优
29、化试验结果方差分析23272响应面直观分析及酶解工艺的优化2528验证试验283小结28致谢错误未定义书签。参考文献30摘要本文以乌贼眼为原料，以透明质酸提取率为指标，采用单酶法研究了从乌贼眼液中提取透明质酸的工艺。研究结果表明，胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三种蛋白酶中，中性蛋白酶的酶解效率最高。选取中性蛋白酶进行了单因素试验，以酶解温度、酶解时间、加酶量、PH值作为试验因素，初步确立了中性蛋白酶酶解的各水平最佳条件。最后，通过响应面试验优化确定了中性蛋白酶酶解提取乌贼眼中透明质酸的最佳工艺条件酶解时间309H，酶解温度6057，加酶量为823995U/G。通过实验验证，在该条件下，中性蛋白
30、酶对提取透明质酸有较好的酶解效果，其透明质酸提取率为1069，与模型预测值相符。说明单酶法可较好地应用于乌贼眼中透明质酸的提取，通过响应面分析法可以得到一个较好预测试验结果的模型方程。关键词乌贼眼睛；透明质酸；酶法；提取；响应面分析法ABSTRACTINTHISPAPER,WITHTHEEXTRACTIONRATEOFHYALURONICACIDASTHEINDEX,SQUIDEYEDROPSOFHYALURONICACIDWASEXTRACTEDFROMSQUIDEYESBYUSINGENZYMATICHYDROLIZATIONSTUDYRESULTSSHOWEDTHAT,NEUTRALPR
31、OTEASESELECTEDFORMAXIMUMEFFICIENCYFROMPEPSIN,NEUTRALPROTEASEANDTRYPSINTHESETHREEPROTEASEHASCHOSENNEUTRALPROTEASECARRYINGONSINGLEFACTORTEST,WITHENZYNOLYSISTEMPERATURE,ENZYNOLYSISTIME,PLUSENZYMEQUANTITYANDPHVALUE,ASTHEEXPERIMENTALFACTOR,HAVEESTABLISHEDEVERYHORIZONTALOPTIMUMCONDITIONOFENZYNOLYSISOFNEUT
32、RALPROTEASETENTATIVELYFINALLY,OPTIMIZEDBYRESPONSESURFACETESTTODETERMINETHEOPTIMUMTECHNOLOGICALCONDITIONSOFNEUTRALPROTEASEZYMOLYSINGEXTRACTIONHYALURONICACIDFROMSQUIDEYESZYMOLYSINGTIME309H,ZYMOLYSINGTEMPERATURE6057,ADDENZYMEQUANTITY823995U/GTHROUGHTHEEXPERIMENT,INTHISCONDITION,NEUTRALPROTEASEFORTHEEXT
33、RACTIONOFHYALURONICACIDHAVEBETTERZYMOLYSINGEFFECT,ITSHYALURONICACIDEXTRACTIONRATEIS1069CORRESPONDWITHMODELPREDICTIONTHATSINGLEENZYMATICQUITEGOODTOAPPLIEDTOEXTRACTHYALURONICACIDFROMSQUIDEYES,THEEXTRACTIONBYRESPONSESURFACEMETHODCANGETABETTERPREDICTTHERESULTSOFTHETRIALMODELEQUATIONSKEYWORDSSQUIDEYESHYA
34、LURONICACIDHAENZYMATICEXTRACTIONRESPONSESURFACEMETHODRSM0前言乌贼，俗称墨鱼,是我国四大海产大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼之一，是沿海常见的一种产量很高的软体动物，肉厚味美,营养丰富,具有重要的经济价值与药用价值。目前，人们对乌贼的利用与开发主要为其骨、肉、墨、血、卵及内脏。乌贼骨又名海螵蛸，是一种常用的中药材，可治多种内外出血,单用有效表现为制酸,可中和过多胃酸1,在皮肤、粘膜包括体内表面还有制泌、收敛、降低血管通透性的作用,化学处理过的海螵蛸还可用作接骨材料,相容性好且不引起炎症、毒性及排斥反应2，并且还有抗肿瘤、防辐射的功效。乌贼肉质鲜
35、美,营养丰富,有活血化淤之效,不但补气、补血且可滋阴3。乌贼墨在我国最初用于止血,当今对其的研究包括增强对细胞免疫功能及抗肿瘤功能，以及提取物制毛发强壮剂,用于生发、黑发1。乌贼血可主治耳聋。乌贼卵可用于开胃利水1，乌鱼蛋是雌墨鱼的缠卵腺加工制成的，有冬食去寒夏食解热之功效。乌贼内脏粉蛋白质含量高，氨基酸组成较理想，除具备必需氨基酸外，还含有丰富的牛磺酸，富含卵磷脂和胆固醇，可作为对于甲壳类动物的的饲料4。然而乌贼头两侧一对发达的眼睛，却没有得到很好的利用。据统计，水产品加工过程中产生大约1540的下脚料，其中鱼眼约占25，通常这些下脚料包括乌贼眼会被人们忽视。乌贼眼较大，如果对其加以利用，从
36、中提取具有广泛应用的透明质酸，不仅能丰富我们对乌贼的开发利用，同时能带动水产品的加工利用，减少渔业资源浪费，而且提取出的透明质酸，能应用于人们的日常生活之中，提高人们的生活质量。透明质酸HYALURONICACID,简称HA,又名玻璃酸,玻尿酸,它是由132乙酰氨基2脱氧D葡萄糖14DD葡萄醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖5。HA具有许多天然粘多糖共有的性质，呈白色，无定形固体，无嗅、无味，有吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂6。HA最突出的特点是水溶液有独特的黏弹性，由于透明质酸含多个羟基、羧基,能与水分子形成氢键,有很强的保水作用,是国际上公认的最好的保湿剂7。HA广泛存在于动物的各种组织中
37、,其中以哺乳动物体内的玻璃体、关节滑液和脐带、鸡冠含量最高8。1934年MEYER和PALMER首先从牛眼玻璃体内提取分离得到该物质。此后，人们对HA的分布、化学结构、理化性质、生理作用、制备工艺及其应用方面进行了广泛深入的研究，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用9。因HA化学结构具有单糖间氢键的作用和螺旋空间外侧具有疏水性，HA具有很强的保水性，成膜性和润滑性10。HA具有抗氧化功能，通过与自由基的反应,HA在体内可成为消除自由基的清道夫11。因而，HA现已广泛地用在基础化妆品品乳剂、霜剂、化妆水、美容液、润肤等妇女用化妆品底霜、口红、唇青、眼睑膏、粉饼、描眉脂等和各类香波、发乳等日化产品中
38、。目前含透明质酸的化妆品被国际上公认为“第四代化妆品”、“仿生化妆品”等,许多国家在竞相研究开发8。HA还应用于医学美容中，一是对皮肤科的应用，HA能用来治疗皮肤炎症，促进组织的再生、重塑和愈合过程中，对肌肤进行再生性修复，不留疤痕；二是透明质酸作为皮肤填充剂用于注射美容12。在眼科手术，HA具有保护角膜上皮，维持角膜透明，维护正常前房，保护眼内组织，协助散瞳，防止玻璃体脱出，帮助止血，支撑囊袋，润滑缝线等作用，故广泛用于穿透性角膜移植术、抗青光眼术、白内障超声乳化吸出术、人工晶体取除术、玻璃体视网膜术、眼外伤等各项眼科复杂手术6。HA对骨性关节炎OA、类风湿性关节炎RA等关节疾病的治疗效果明
39、确、安全，具有很好的应用前景13。黄建艳等14制备成琼脂糖一HA共聚物，再用该共聚物包载胰岛素，释药实验表明包载的胰岛素具有缓释行为；LEE等15研制出一种HA一紫杉醇结合物，它在水溶液中可形成纳米级胶束聚集体，且在酸性条件下紫杉醇可完整地从胶束中解离，具有靶向性和控释作用，作为特异性肿瘤拮抗剂具有潜在的应用前景；KUMAR等16研究发现，FE2O3可以作为将HA与纳米粒连接的“桥梁”，并成功地研制出新型HAFE2O3纳米级脂质体，同时发现这种新型脂质体几乎能够全部将多肽药物输送至靶点。此外，作为诊断某些疾病的指标,MARIA、POLYXENI等人研究发现透明质酸（HA）在肝纤维化的发病机制中
40、发挥了显着的作用，通过比浊法测量201个地中海贫血患者体内的HA含量，如果体内的HA含量增高，则可评估患者的肝纤维化的程度17。因此，本课题以透明质酸得率为指标，确定温度、PH、加酶量以及酶解时间对中性蛋白酶水解提取乌贼眼中透明质酸的影响，采用响应面法优化中性蛋白酶的酶解条件，确定最佳酶解工艺，对透明质酸的研究与乌贼的开发利用具有重要的意义1材料与方法11实验材料与仪器111原料乌贼眼新鲜金乌贼购于宁波庄市新鲜金乌贼洗净，挑破眼珠，取眼液，滤去泥沙、色素等杂质，18冻藏；实验用时4解冻，匀浆。112实验试剂中性蛋白酶（20万U/G）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、D葡萄糖醛酸、葡萄糖、蒽酮硫酸试剂、咔唑
41、、十水合四硼酸钠（四硼酸钠）（分析纯）、氯化钠（分析纯）、双氧水（质量分数30）、浓硫酸、无水酒精（分析纯）、三氯乙酸（15）113仪器与设备电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；DKS24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；冷冻高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司；T6新锐可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ82气浴恒温振荡器金坛市科技仪器有限公司；ZJ1U11型恒温干燥箱浙江诸暨市实验仪器厂。凯氏定氮装置，消化炉，马福炉等。12实验方法121乌贼眼玻璃体基本成分测定1211水分测定直接干燥法（GB/T500932010）1212灰分测定灰化法（GB/T50094
42、2010）1213总蛋白测定凯氏定氮法法（GB/T500952010）1214总糖测定蒽铜硫酸法样品处理称取一定量匀浆后样品，加适量的水于90水浴提取3H，将提取液稀释一定倍数后备用。标准曲线制作分别移取05ML、1ML、2ML、5ML、8ML、10ML浓度1G/L的标准葡萄糖溶液于100ML容量瓶定容，即得浓度为0005G/L、001G/L、002G/L、005G/L、008G/L、010G/L葡萄糖系列标准溶液。取蒸馏水、葡萄糖系列标准液各1G/L，加入4G/L蒽酮硫酸试剂摇匀，迅速将试管放入冰水浴中冷却，避光处存放，各管加完后一起放入沸水浴中加热，自水浴重新沸腾起加热7MIN，流动水冷却
43、，室温放置10MIN，在620NM波长处比色测定。样品测定同标准品的处理，记录吸光值A。122酶活力的测定福林（FOLIN）法试剂配制（1）福林试剂FOLIN试剂于2000ML磨口回流装置内，加入钨酸钠NA2WO42H2O100G，钼酸钠NA2MOO42H2O25G，蒸馏水700ML，85磷酸50ML，浓盐酸100ML，文火回流10H。取去冷凝器，加入硫酸锂LI2SO450G，蒸馏水50ML，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15MIN，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000ML，用细菌漏斗过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用
44、时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。（2）04MOL碳酸钠溶液称取无水碳酸钠NA2CO3424G，定容至1000ML。（3）04MOL三氯乙酸TCA溶液称取三氯乙酸CCL3COOH654G，定容至1000ML。PH72磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠NAH2PO42H2O312G，定容至1000ML，即成02MOL溶液A液。称取磷酸氢二钠NA2HPO412H2O7163G，定容至1000ML，即成02MOL溶液B液。取A液28ML和B液72ML，再用蒸馏水稀释1倍，即成01MOLPH72的磷酸盐缓冲液。（4）2酪蛋白溶液准确称取干酪素2G，称准至0002G，加入01MOL/L氢氧化钠10ML，
45、在水浴中加热使溶解必要时用小火加热煮沸，然后用PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。（5）100G/ML酪氨酸溶液精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸01000G，逐步加入6ML1MOL/L盐酸使溶解，用02MOL/L盐酸定容至100ML，其浓度为1000G/ML，再吸取此液10ML，以02MOL/L盐酸定容至100ML，即配成100G/ML的酪氨酸溶液。酶活力标准曲线制作分别吸取不同浓度酪氨酸1ML，各加入04MOL碳酸钠5ML，再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN在660NM波长测OD值。一般测三次，取平均值，同时
46、做空白试验。样品测定称取酶粉0100G，加入PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML，吸取此液5ML，再用缓冲液稀释至25ML，即成5000倍的酶粉稀释液。取样品稀释液1ML，置于40水浴中预热2MIN，再各加入经同样预热的酪蛋白1ML，精确保温10MIN，时间到后，立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML，以终止反应，继续置于水浴中保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取滤液1ML，再加04MOL碳酸钠5ML，已稀释的福林试剂1ML，摇匀，40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML，使酶失活，再加入酪蛋白。计算在40下
47、每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基10A4NW11式中A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44ML反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；W样品水分百分含量。123透明质酸含量测定关于透明质酸含量的测定，有咔唑法【18】和浊度试验法【19】，前者利用结合或游离的葡萄糖醛酸在浓硫酸中能够与咔唑试剂反应而生成有颜色的物质原理，后者利用透明质酸和十六烷基三甲基溴之间能形成不溶性复合物可以通过酶标仪测定，JUNGMINSONG等人最佳研究发现后者更简便更快速，但是由于目前应用的太少，故本实验使用BITTE
48、R和MUIR建立的改良咔唑法，通过测定葡萄醛酸的方法，选用直接比色法进行测定透明质酸的含量【18】。一般葡萄糖醛酸约占透明质酸质量的4844，根据换算可得出透明质酸的含量。试剂配制（1）0025MOL/L硼砂硫酸液称取四硼酸钠945G，溶于浓硫酸AR1000ML中,加盖,不定时振摇,直至四硼酸钠完全溶解。室温下贮存。（2）01咔唑试液称取咔唑0125G，溶于乙醇AR100ML中,置于棕色瓶中冰箱内保存。（3）葡萄糖醛酸（GA）标液精称20MG葡萄糖醛酸，置于100ML容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，4以下贮存。葡萄糖醛酸标准曲线制作精密称取葡糖醛酸AR20MG，置100ML量瓶中，加水溶解至刻度，
49、摇匀备用。精密量取标准溶液05、10、15、20、25ML，分别加入10ML量瓶中，加水稀释至刻度，得10、20、30、40和50G/ML浓度的对照品溶液。取6只具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸液5ML，置冰浴中冷至4左右。然后分别取空白溶液蒸馏水和不同浓度的对照品溶液各1ML加入试管中，先轻轻振摇，再充分混匀，并不断用冰浴冷却，将试管置沸水中加热10MIN，置常水中冷至室温。加入咔唑试剂02ML，混匀，水浴中再加热15MIN，冷至室温。在530NM处测定吸收度，以吸收度对浓度作图即可绘出标准曲线,或作直线回归数据处理,计算出吸收度和浓度的线性回归方程CBKA，B截距，K斜率。0010203040506070102030405060葡萄糖醛酸浓度G/ML吸光度图1葡萄糖醛酸标准曲线图FIG1STANDARDCURVEOFGLUCURONICACID所得标准曲线回归方程为Y00129X00153,相关系数R209958,其中Y为吸光度X为葡萄糖醛酸浓度UG/ML,标准曲线见图1。样品测定取本品01G/L的溶液1ML，照标准曲线项下的方法测定吸收度。从标准曲线上查出相应的葡糖醛酸浓
