1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全海蜇酶溶胶原蛋白的提取工艺研究一、选题的背景与意义胶原蛋白（COLLAGEN存在所有多细胞动物体内，是一种细胞外蛋白质，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和器官中，也是结缔组织中主要的结构蛋白，起着支撑器官、保护肌体的功能，胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质重要的2530。在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病（BSE）等传染性疾病的爆发使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。胶原蛋白需求量日益增加，因此寻找可替代的新的来源地胶原蛋白就
2、显得非常迫切。水产胶原蛋白与陆生动物的胶原蛋白相比，其特性、组成及溶液的性质都存在显著的差异，因此开发水产胶原蛋白不仅扩大了胶原蛋白的原料来源，还拓宽了胶原蛋白的应用范围。海蜇作为食品，营养价值很高。中医认为海蜇性味甘、咸、平，入肝、肾脏，具有化痰软坚、平肝解毒、降压、祛风、除湿、消积、润肠等的功效，具有很好的药用价值。我国食用海蜇资源丰富，每年在海蜇的加工过程中都将出现大量的资源浪费，更严重的是直接导致环境的污染。而且海蜇含水量高，收获期短，易自溶。蛋白质是海蜇的主要成分，且以胶原蛋白为主。已有研究表明，从海蜇中提取的胶原蛋白可用于治疗风湿性关节炎。而且海蜇胶原蛋白在低抗原性、低过敏性、分子
3、结构脆弱导致酶解较容易等方面具有一定的优势。如今，人们崇尚绿色、环保、回归自然意识的加强，开发利用海蜇及其废弃物提取胶原蛋白，生产具有各种生理功能的活性肽将越来越受到市场和广大对水产业的发展提供广阔的前景。胶原蛋白的提取方法主要有热水浸提、酸法浸提、碱法浸提与酶法浸提，其基本的原理都是根据胶原蛋白的特性，改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。虽然酸法和碱法水解都迅速彻底，但是这两种方法都具有很大的局限性，酸水解法会使色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且产品得率低，设备腐蚀严重，并产生二次污染，而碱水解法则使含羟基和巯基的氨基酸，全部被破坏且产生消旋。酶法水解反应
4、温度低，反应时间短，无环境污染等优点逐渐被人们所发现。酶可以选择性的切除非螺旋的端肽而使胶原溶解出来，并对螺旋区无作用，这样溶解出来的胶原蛋白仍具有完整的三股螺旋结构，降低了胶原的抗原性，适用于生物医药材料。而且其水解产物产品营养价值高，以多肽和L型游离氨基酸为主，速溶性好，易于人体消化吸收。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）基本内容1、酶法提取单因素实验分析，包括酶解时间、酶用量、料液比；2、根据单因素结果进行响应面实验分析，确定最适工艺条件；3、对海蜇原蛋白的理化特性进行了初步的研究，主要包括海蜇胶原蛋白的紫外光谱分析、红外光谱分析等。（二）拟解决的主要问题1、实验单因素的确定2、
5、胶原蛋白的纯化条件的确定三、研究的方法与技术路线（一）研究方法采样前处理单因素及响应面实验分析结果确定最适酶解条件理化分析1、单因素实验酶法提取胶原蛋白的单因素分析酶浓度、提取时间、料液比。2、响应面实验在单因素的基础上，做3因素3水平的响应面实验。3、胶原蛋白的测定方法羟脯氨酸是胶原蛋白的特征成分。胶原蛋白得率（）111A稀释倍数/M100M海蜇质量（MG）A羟脯氨酸的量（MG）4、氨基酸组成分析称取一定量海蜇于四氟乙烯消解罐中，加入6MOL/LHCL，进行消解，消解结束后滤膜过滤，然后再适当的条件下进行液相分析。5、紫外光谱分析将制备的海蜇胶原蛋白溶解，在190NM400NM的紫外光区进行
6、全波长扫描。6、红外光谱分析取少量样品加入适量的干燥的KBR，混合均匀并研成粉末状。取少许压片，全反射光谱测定法（ATR）进行测定。（二）技术路线四、总体安排与进度201010201011查阅资料，确定实验方案。20101120112通过单因素试验及响应面试验，确定海蜇酶溶胶原蛋白提取工艺的最适条件。2011220113整理数据，撰写论文。五、主要参考文献1王荣春，徐德昌，秦兰霞胶原蛋白与VI型胶原蛋白结构概述J生物信息学，2004，0430332张达江，王亮I型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景J生物技术通讯，2006，1702265269海蜇预处理胶原蛋白提取单因素实验胃蛋白酶浓
7、度提取时间料液比响应面试验提纯、冷冻干燥氨基酸分析胶原蛋白含量测定红外分析紫外分析最佳工艺的确定3王彦宏，朱平，冷南等II型胶原蛋白的提取纯化和鉴定J第四军医大学学报，2002，2319182018214AKKASITJONGJAREONRAK,SOOTTAWATBENJAKUL,WONNOPVISESSANGUAN,ETALISOLATIONANDCHARACTERISATIONOFACIDANDPEPSINSOLUBILISEDCOLLAGENSFROMTHESKINOFBROWNSTRIPEREDSNAPPERLUTJANUSVITTAJFOODCHEMISTRY,2005,934754
8、845JUNJIEZHAN,RUIDUAN,YUANYONGTIAN,ETA1CHARACTERISATIONOFACIDSOLUBLECOLLAGENFROMSKINOFSILVERCARPHYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXJFOODCHEMISTRY,2009,1163183226陈胜军，曾名勇，董士远水产胶原蛋白及其活性肽的研究进展J水产科学，2004，23644467郭恒斌，曾庆祝水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用J农产食品科技，2007，1346508胡建平鲢鱼鳞胶原蛋白及其多肽的制备和性质研究D雅安四川农业大学，20099宋晓燕，高彦祥，袁芳水解胶原蛋白的研究进
9、展J中国食物与营养，2008，2323410郭文宇，边清泉，刘家琴等木瓜蛋白酶提取草鱼皮胶原蛋白的工艺研究J皮革与化工，2009，261343611唐文婷木瓜蛋白酶提取鱿鱼皮胶原蛋白的工艺研究J四川食品与发酵，2008，445323412程波，吴洁，张玉蓉等酶法提取人工养殖鲟鱼皮重胶原蛋白的工艺研究J食品研究与开发，2009，3031413陈小娥，方旭波，钟秋琴安康鱼皮重胶原蛋白的提取工艺研究J食品工业科技，2007，28313113314菅景颖，张志胜酶解胶原蛋白研究进展J浙江化工，2007,，381182015王丽娜，黄素珍胶原蛋白的研究进展J肉类研究，2010，1162216理闻欣，杨明
10、来，王润辰等鱼鳞水法制胶的研究J食品科学，2006，271134634817王信苏，汪之和草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取J现代食品科技，2008，22414815018金桂芬，裘俊红海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究J浙江化工，2008，397050919张虹，卓素珍，戴志远鮟鱇鱼皮重胶原蛋白的提取及性质研究J中学食品学报，2009，96344020肖世维，但年华，曾睿从动物皮重提取胶原蛋白的方法J西部皮革，2009，3115172121潘杨，许学勤酸碱法提取鱼鳞胶的工艺研究J食品科技，2008，318318622曾嵘，杨忠华，王玉等水产废弃物胶原蛋白的提取J生物加工过程，2008，65273023庄永亮
11、，李八方，赵雪等高压辅助提取海蜇胶原蛋白的工艺J食品与发酵工业，2009，355798124张联英，曾名勇微波技术在水产胶原蛋白提取中的应用J北京水产，2005，6404225廖艳阳胶原蛋白的研究进展J长沙大学学报，2009，235363826周倩，罗志刚，何小维胶原蛋白的应用研究J现代食品科技，2008，24328528927陈国梁，贺翠莲胶原蛋白的研究进展J延安大学学报，2000，192788128郭瑶，曾名勇，崔文萱水产胶原蛋白及胶原多肽的研究进展J水产科学，2006，25210110429金桂芬海蜇胶原蛋白提取及超滤在胶原蛋白纯化中的应用D杭州，浙江工业大学，200830EUNSONG
12、,SOYEONKIM,TAEHOONCHUNC,ETALCOLLAGENSCAFFOLDSDERIVEDFROMAMARINESOURCEANDTHEIRBIOCOMPATIBILITYJBIOMATERIALS,2006,272951296131FENGJINHUA,YUHUAHUA,LICUIPIN,ETALISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFVENOMFROMNEMATOCYSTSOFJELLYFISHRHOPILEMAESCULENTUMKISHINOUYECHINESEJOURNALOFOCEANOLOGYANDLIMNOLOGYJ,2009,27048698
13、7432杨春，苏秀榕，李太武海蜇的综合利用J河北渔业，2003，02121433庄永亮，赵雪，张朝辉等海蜇伞部胶原蛋白的提取及其理化性质J食品科学，2009，3013899234刘希光海蜇的化学组成及其生物活性研究D青岛，中国科学院海洋研究所，200435MINGYANYAN,BAFANGLI,XUEZHAO,ETA1CHARATERIATIONOFACIDSOLUBLECOLLAGENFROMTHESKINOFWALLEYEPOLLOCKTHERAGRACHALCOGRAMMAJFOODCHEMISTRY,2008,10715811586毕业论文文献综述食品质量与安全水产品胶原蛋白及其提取工
14、艺的研究进展摘要胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质，也是结缔组织的主要蛋白成分。水产胶原蛋白由于其优良的理化性质，已引起人们的广泛关注，本文简要综述了水产胶原蛋白的提取方法以及胶原蛋白在食品、生物医学等领域中的应用，并对今后的研究前景进行展望。关键词水产动物，胶原蛋白，提取工艺0前言胶原蛋白（COLLAGEN存在所有多细胞动物体内，是一种细胞外蛋白质，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和器官中，也是结缔组织中主要的结构蛋白，起着支撑器官、保护肌体的功能，胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质重要的25301。在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛
15、。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病（BSE）等传染性疾病的爆发使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大2。胶原蛋白需求量日益增加，因此寻找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。水产胶原蛋白与陆生动物的胶原蛋白相比，其特性、组成及溶液的性质都存在显著的差异3，因此开发水产胶原蛋白不仅扩大了胶原蛋白的原料来源，还拓宽了胶原蛋白的应用范围。1胶原蛋白的概述胶原蛋白是一个庞大的家族，种类繁多，结构高度复杂，从分子结构、超分子结构，再到组织分布和功能等，具有较多的多样性。尽管如此，它们都有一个共同的特点由三条肽链以右手螺旋方法形成的蛋白质，每一个肽链在分子结构上都是
16、左手螺旋，三条链在氨基酸残基的相互作用下，以同一轴为中心，以右手螺旋方式形成三股螺旋。形成三股螺旋的先决条件是有很大的甘氨酸的存在，在胶原蛋白的肽链上每三个氨基酸就有一个甘氨酸，形成了三肽GLYXY的重复区域，超螺旋体中各链借助甘氨酸残基的肽链之间形成氢键交联在一起。所有的甘氨酸残基聚在三股螺旋的中心轴上，而其他的氨基酸占据螺旋的外围位置。X，Y经常是脯氨酸或者羟脯氨酸。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原蛋白分子。绝大多数蛋白质中脯氨酸含量很少，而胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸的含量是各种蛋白质中最高,可视为胶原蛋白的特征氨基酸16。胶原蛋白的类型目前已增加至27种7，已从鱼类中分离鉴定出的
17、胶原类型为广泛分布在真皮、骨、鳞、鳔、肌肉等处的I型、软骨和脊索的型和型以及肌肉的V型。而且，I型胶原蛋白是水产品加工废弃物皮、骨、鳞和鳍中含量最多的蛋白质。2水产胶原蛋白的提取方法胶原蛋白的提取方法主要有酸法浸提、热水浸提、碱法浸提与酶法浸提，其基本的原理都是根据胶原蛋白的特性，改变蛋白质所在的外界环境，把胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。因为各种方法本身缺点的限制8，实际提取过程中经常将不同方法相互结合。高压技术的应用也引起了越来越多研究者的兴趣。221酶法浸提酶法提取时得到酶溶性胶原蛋白PEPSINSOLUBLECOLLAGEN,简称PSC，是用对胶原作用较弱的酶处理样品，只作用于胶原的非
18、螺旋端肽，而不会改变胶原的三螺旋结构。目前应用于实际生产中的酶主要有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等912。酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法13。影响酶法浸提的因素有温度、时间、酶量、PH、料液比等。胡建平14采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶三种不同蛋白酶提取鲢鱼磷胶原蛋白，选取效果最好的酶用正交试验优化胶原蛋白制备工艺。结果表明，胃蛋白酶提取鲢鱼磷胶原蛋白效果最好，其最佳工艺条件为40、48H、酶量4和PH2，提取率为568。陈小娥等15以安康鱼皮为原料，采用酶法提取胶原蛋白，用正交实验堆安康鱼皮胶原蛋白提取工艺进行优化，结果表明，当胃蛋白酶质量分数
19、L，料液比110，酶解时间6H，酶解温度5，平均提取率为1101，纯度为965。222碱法浸提碱法提取胶原蛋白，常用的处理剂有石灰、氢氧化钠等。一般的是把样品匀浆后，用碱溶液多次溶胀后，再离心提取。碱法提取胶原蛋白的报道相对较少，大多是和其他方法结合使用。223热水浸提热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，直接在热水中提取已经变性了的胶原蛋白或胶原蛋白水解物的方法16。李闻欣，杨明来等17研究了淡水鱼鳞水法制胶原蛋白。结果表明制胶条件为温度6070、时间23H。并通过研究发现温度高些有助于提胶，但温度过高抽提率还有所下降。224酸法浸提酸法浸提，所用的酸多数为乙酸，还有的用柠檬酸、磷酸等
20、18，柠檬酸因不产生颜色和异味得以广泛使用于食品工业的胶原蛋白的提取中。酸法提取的工艺流程水产品预处理酸萃取离心（上清液）盐析（NACL）透析ASC浓缩液冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白（ACIDSOLUBLECOLLAGEN，ASC）19。张虹、桌素珍等20采用05MOL/L醋酸提取，结合NACL沉淀法从鮟鱇鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白（ASC），冻干鱼皮与01MOL/LNAOH以110（W/V）的料液比混合，磁力搅拌器搅拌24H，用蒸馏水洗至样液呈弱碱性。加入10丁醇搅拌浸泡，用蒸馏水冲洗除尽丁醇后，加入05MOL/L醋酸溶液浸泡提取24H，离心，沉淀用醋酸溶液继续提取24H，提取物也按上述方
21、法处理。两次提取、离心得到的上清液混合后用09MOL/LNACL盐析，沉淀物以05MOL/L醋酸溶液复溶、盐析来达到提纯胶原蛋白的目的。由于不同的季节，不同水产品的羟脯氨酸与脯氨酸的含量都不同18。而这2种氨基酸的含量则直接影响胶原的稳定性，含量越高，胶原越稳定，则越难以提出。所以可以考虑酸酶联用来提取胶原蛋白。225结合法提取结合法是指将酸法、碱法、酶法及热水法等互相结合运用在提取胶原蛋白上8。酸、酶结合法相对于酸法溶解量提高。曾嵘等21新鲜草鱼鱼鳞、鱼鳍为原料将酸、碱法提取与酸、酶结合提取作了比较，结果发现用传统的酸、碱提取法产率较低，然而酸酶结合提取法有较高的产率，且反应条件温和，蛋白结
22、构不易被破坏。此外还有酸碱结合法，酸碱与热水结合法等。结合法是现在很多研究者正在做的工作，以期通过此法克服分钟单一方法的不足，得到高提取率的胶原蛋白21、22。226其他方法在胶原蛋白的提取中的应用另一些技术也逐渐应用到胶原蛋白的提取当中，例如高压、微波23。庄永亮、李八方24等研究了高压辅助热水提取海蜇胶原蛋白的工艺条件。以胶原蛋白得率（用羟脯氨酸含量计算）为指标，分别研究了高压功率、高压处理的时间、热水温度以及热水提取时间对胶原蛋白得率的影响，得到优化的工艺条件料液比L4（W/V），高压功率250MPA，高压处理时间10MIN，热水处理温度70，热水提取时间15H。此条件下，海蜇胶原蛋白的
23、得率为682。与传统的胶原蛋白提取方法比较，高压辅助提取方法具有操作工艺简单易控制，产品无小分子盐掺入，生产周期短，生产环保无污染等优点。3水产胶原蛋白的应用胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度。同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血，生物相容性和生物降解性。因其具有这些性质，胶原蛋白在烧伤。创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域有着广泛的应用。胶原蛋白可以作为功能食品和保健食品，也可以生产可食性包装材料。水产胶原蛋白中应用较多的是鱼皮胶原蛋白，利用鱼皮胶原蛋白可生产新型的胶原多肽、氨基酸口服液、胶
24、原蛋白饮料等保健食品25。由于胶原及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性好，可以扩散到皮肤的深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业2628。4水产胶原蛋白的研究展望就我国而言，我们虽然拥有广阔的水域，但是我国的水产品加工滞后，尤其是水产品加工废弃物利用较少，来源于水产动物的胶原蛋白在许多方面明显优于牛、猪皮胶原蛋白。因此，我们在积极开发海洋新产品的同时，应集中研究从水产废弃物中提取具有各种生理功能的低分子肽，开发各种功能的胶原
25、多条等，使胶原蛋白及其制品的研究和生产工艺不断改进，越来越多的满足人们不同需要，尤其是在生物医学及功能食品领域的胶原蛋白开发利用，相信随着科学技术的不断发展，这个产业将带来更好的经济、社会和生态效应。胶原蛋白自身的缺点也制约了其应用范围，人们通过化学和物理的方法对胶原蛋白进行交联或修饰，不仅能增强纯化后天然胶原的性能，并且能提高和改善其它性能；也可以将胶原蛋白与其它生物材料复合，如其它蛋白质，多糖类以及无机盐或有机高分子生物材料等，不仅能改善胶原蛋白的各项性能，而且能拓宽胶原蛋白在生物材料的临床应用。制备胶原高分子复合材料，使其同时具有两种材料的共同优点，取长补短，这将为医用生物材料的变革性发
26、展提供广阔的前景26。参考文献1王荣春,徐德昌,秦兰霞胶原蛋白与VI型胶原蛋白结构概述J生物信息学,2004,430332JUNJIEZHANG,RUIDUAN,YUANYONGTIAN,ETA1CHARACTERISATIONOFACIDSOLUBLECOLLAGENFROMSKINOFSILVERCARPHYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXJFOODCHEMISTRY,2009,1163183223陈胜军,曾名勇,董士远水产胶原蛋白及其活性肽的研究进展J水产科学,2004,23644464张达江,王亮I型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景J生物技术通讯,2006,
27、1722652695王彦宏,朱平,冷南等II型胶原蛋白的提取纯化和鉴定J第四军医大学学报,2002,2319182018216MINGYANYAN,BAFANGLI,XUEZHAO,ETA1CHARATERIATIONOFACIDSOLUBLECOLLAGENFROMTHESKINOFWALLEYEPOLLOCKTHERAGRACHALCOGRAMMAJFOODCHEMISTRY,2008,107158115867郭恒斌,曾庆祝水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用J农产食品科技,2007,1346508肖世维,但年华,曾睿从动物皮中提取胶原蛋白的方法J西部皮革,2009,311517219宋晓
28、燕,高彦祥,袁芳水解胶原蛋白的研究进展J中国食物与营养,2008,2323410郭文宇,边清泉,刘家琴等木瓜蛋白酶提取草鱼皮胶原蛋白的工艺研究J皮革与化工,2009,261343611唐文婷木瓜蛋白酶提取鱿鱼皮胶原蛋白的工艺研究J四川食品与发酵,2008,445323412程波,吴洁,张玉蓉等酶法提取人工养殖鲟鱼皮重胶原蛋白的工艺研究J食品研究与开发,2009,3031413菅景颖,张志胜酶解胶原蛋白研究进展J浙江化工,2007,381182014胡建平鲢鱼鳞胶原蛋白及其多肽的制备和性质研究D雅安四川农业大学,200915陈小娥,方旭波,钟秋琴安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺研究J食品工业科技,2
29、007,28113113316王丽娜,黄素珍胶原蛋白的研究进展J肉类研究,2010,1162217理闻欣,杨明来,王润辰等鱼鳞水法制胶的研究J食品科学,2006,271134634818王信苏,汪之和草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取J现代食品科技,2008,22414815019金桂芬,裘俊红海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究J浙江化工,2008,397050920张虹,卓素珍,戴志远鮟鱇鱼皮重胶原蛋白的提取及性质研究J中学食品学报,2009,96344021曾嵘,杨忠华,王玉等水产废弃物胶原蛋白的提取J生物加工过程,2008,65273022潘杨,许学勤酸碱法提取鱼鳞胶的工艺研究J食品科技,2008,31
30、8318623张联英,曾名勇微波技术在水产胶原蛋白提取中的应用J北京水产,2005,6404224庄永亮,李八方,赵雪等高压辅助提取海蜇胶原蛋白的工艺J食品与发酵工业,2009,355798125郭瑶,曾名勇,崔文萱水产胶原蛋白及胶原多肽的研究进展J水产科学,2006,25210110426廖艳阳胶原蛋白的研究进展J长沙大学学报,2009,235363827周倩,罗志刚,何小维胶原蛋白的应用研究J现代食品科技,2008,24328528928陈国梁,贺翠莲胶原蛋白的研究进展J延安大学学报,2000,1927881本科毕业设计（20_届）海蜇酶溶性胶原蛋白的提取工艺研究目录1引言1411胶原蛋白
31、概述14111胶原蛋白的结构14112胶原蛋白的提取方法的研究进展14113胶原蛋白的应用1512海蜇胶原蛋白的概述16121海蜇的生物学特性16122海蜇胶原蛋白的研究进展1613研究的目的和意义162材料与方法1721材料与试剂1722仪器与设备1723方法17231工艺流程17232样品的前处理18233酶溶性胶原蛋白的提取18234胶原蛋白提取率的测定18235单因素的确定18236提取工艺参数优化19237胶原蛋白的理化分析193结果与分析1931羟脯氨酸标准曲线的绘制1932提取时间对酶溶性胶原蛋白提取率的影响2033液料比对胶原蛋白提取率的影响2034胃蛋白酶浓度对胶原蛋白提取率
32、的影响2135响应面优化实验设计及结果2136氨基酸组成2437紫外光谱分析2538红外光谱分析264小结28致谢错误未定义书签。参考文献29摘要我国海蜇资源丰富，分布广泛，并具有很高的营养及经济价值，本文以东海海域新鲜海蜇为原料，通过响应面实验对海蜇胶原蛋白酶法提取进行优化，并研究了PSC的部分理化性质。以胶原蛋白得率为指标，酶法提取的最佳工艺为4条件下提取时间为41H，液料比191，酶浓度为4，在此条件下海蜇胶原蛋白的预测提取率为0411，与预测值的误差为442，由此可见，响应面法优化的最佳提取工艺可靠。在胶原蛋白特性研究结果中显示该胶原蛋白氨基酸含量丰富，其中GLY含量最高，约占总氨基酸
33、的22；紫外光谱扫描显示酶促溶性胶原蛋白（PSC）的最大吸收峰在208NM；红外光谱扫描显示胶原蛋白基本保留了三股螺旋结构。关键词海蜇；酶溶性胶原蛋白；提取工艺ABSTRACTJELLYFISHISONEOFTHEMOSTIMPORTANTFISHERYRESOURCESINCHINA,WHICHHASHIGHNUTRITIONALANDECONOMICVALUEINTHISPAPER,THEEXTRACTINGCONDITIONSOFPEPSINSOLUBLECOLLAGENPSCFROMJELLYFISHWEREOPTIMIZEDBASEDONRESPONSESURFACEMETHODTH
34、ERESULTSHOWSTHATTHEOPTIMALCONDITIONOFPSCEXTRACTIONWASOBTAINEDASFOLLOWINGEXTRACTIONTIME41H,THESOLID/WATERRATIOOF191,ENZYMECONCENTRATIONOF4AT4,UNDERTHESECONDITIONTHEPREDICTIONEXTRACTIONRATEOFJELLYFISHCOLLAGENWAS0411,THEDEVIATIONWITHTHEPREDICTIONIS442,THEREFORE,THERESPONSESURFACEMETHODISRELIABLESOMEPRO
35、PERTIESOFCOLLAGENWERESTUDIED,TOOTHECOMPOSITIONALFEATURESOFTHEAMINOACIDSOFCOLLAGENWERERICHWITHTHEHIGHESTCONTENTSOFGLY22OFTOTALAMINOACIDSUVSPECTRALSCANSSHOWEDTHATTHEMAXIMUMABSORPTIONPEAKOFPSCWAS208NM,RESPECTIVELYTHEFTIRANALYSISSPECTRUMINDICATEDTHEEXISTENCEOFHELICALARRANGEMENTSOFCOLLAGENKEYWORDSJELLYFI
36、SHPEPSINSOLUBLECOLLAGENEXTRACTION1引言11胶原蛋白概述胶原蛋白是动物体内含量最丰富，分布最广泛的蛋白质，占人体内总蛋白质的25301，存在于动物的骨、皮、腱、韧带和软骨中，是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白2。胶原蛋白的作用是支撑器官和保护肌体，同时也是组成细胞间质的最重要的功能蛋白质。111胶原蛋白的结构胶原蛋白种类繁多，结构复杂。但是胶原蛋白的基本组成却是大同小异三条左手螺旋的肽链在氨基酸残基的作用下以右手螺旋方式形成的蛋白质3。在胶原蛋白的肽链甘氨酸占总氨基酸的1/3，与另外两个氨基酸形成三肽GLYXY（X，Y经常是脯氨酸或者羟脯氨酸）的重复区域，各肽链
37、以肽链之间GLY残基形成的氢键连接到一起。其中GLY残基位于螺旋的中心轴线上，其他氨基酸则占据三股螺旋的外围位置。另外，胶原蛋白也可通过羟脯氨酸残基分子内氢键来稳定自身。另外胶原蛋白还具有非三螺旋结构域。绝大部分蛋白质几乎不含羟脯氨酸，所以将羟脯氨酸可以作为胶原蛋白的特征氨基酸4。112胶原蛋白的提取方法的研究进展胶原蛋白的提取方法主要有酸法浸提、热水浸提、碱法浸提与酶法浸提，其基本的原理都是根据胶原蛋白本身的特性，改变蛋白质所处的外界环境，将胶原蛋白从其他蛋白质中分离出来。因为各种方法本身缺点的限制5，实际提取过程中经常将不同方法相互结合。另外高压技术在胶原蛋白提取中的应用也引起了越来越多研
38、究者的兴趣。1121酶法浸提酶法提取时得到的是酶溶性胶原蛋白PEPSINSOLUBLECOLLAGEN,简称PSC，是采用对胶原作用较弱的酶处理样品，这种酶只作用于胶原蛋白的非螺旋端肽，而不会改变胶原蛋白的三螺旋结构。目前应用于实际生产中的酶主要有胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等68。酶解胶原蛋白的工艺可以分为单酶水解法和多酶水解法9。影响酶法浸提的因素有温度、时间、酶量、PH、料液比等。胡建平10采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶三种不同蛋白酶提取鲢鱼磷胶原蛋白，选取效果最好的酶用正交试验优化胶原蛋白制备工艺。结果表明，胃蛋白酶提取鲢鱼磷胶原蛋白效果最好，其最佳提取工
39、艺条件为40、48H、酶量4和PH2，提取率为568。陈小娥等11以安康鱼皮为原料，采用酶法提取胶原蛋白，用正交实验堆安康鱼皮胶原蛋白提取工艺进行优化，结果表明，当胃蛋白酶质量分数L，料液比110，酶解时间6H，酶解温度5，平均提取率为1101，纯度为965。1122酸法浸提酸法浸提，所用酸大多数是醋酸，有的还用柠檬酸、磷酸等12，其中柠檬酸因不产生颜色和异味得以在视屏工业的胶原蛋白提取中广泛的应用。酸法提取胶原蛋白的工艺流程为水产品预处理酸萃取离心（上清液）盐析（NACL）透析ASC浓缩液冷冻干燥，即可得到酸溶性胶原蛋白（ACIDSOLUBLECOLLAGEN，ASC13。张虹、桌素珍等14
40、采用05MOL/L醋酸提取，结合NACL沉淀法从鮟鱇鱼皮中提取酸溶性胶原蛋白（ASC），冻干鱼皮与01MOL/LNAOH以110（W/V）的料液比混合，磁力搅拌器搅拌24H，用蒸馏水洗至样液呈弱碱性。加入10丁醇搅拌浸泡，用蒸馏水冲洗除尽丁醇后，加入05MOL/L醋酸溶液浸泡提取24H，离心，沉淀用醋酸溶液继续提取24H，提取物也按上述方法处理。两次提取、离心得到的上清液混合后用09MOL/LNACL盐析，沉淀物以05MOL/L醋酸溶液复溶、盐析来达到提纯胶原蛋白的目的。1123碱法浸提碱法提取胶原蛋白，常采用石灰、氢氧化钠等处理剂。一般都是把样品匀浆后，用碱溶液多次溶胀，然后再离心提取。关于
41、碱法提取胶原蛋白的报道相对较少，大多都是和其他提取方法结合使用。1124热水浸提热水提取法是先将原料经除杂蛋白等前处理，然后在热水中直接提取已经变性的胶原蛋白或者胶原蛋白水解物15。李闻欣，杨明来等16研究了淡水鱼鳞水法制胶原蛋白。结果表明制胶条件为温度6070、时间23H。并通过研究发现温度高些有助于提胶，但温度过高抽提率还有所下降。1125结合法提取由于季节的不同，不同水产品中含有羟脯氨酸与脯氨酸的量不同。而这两种氨基酸的含量直接影响胶原蛋白的稳定性，含量越高，胶原蛋白就越稳定，则越难提取出来。所以可以考虑酸酶联用来提取胶原蛋白。曾嵘等新鲜草鱼鱼鳞、鱼鳍为原料将酸、碱法提取与酸、酶结合提取
42、作了比较，结果发现用传统的酸、碱提取法产率较低，然而酸酶结合提取法除了有较高的产率，且反应条件温和，蛋白结构不易被破坏。此外还有酸碱结合法，酸碱与热水结合法等。结合法是现在很多研究者正在研究的工作，希望通过该法克服单一方法的不足，从而得到高提取率的胶原蛋白17、18。1126其他方法在胶原蛋白提取中的应用另一些技术也逐渐应用到胶原蛋白的提取当中，例如高压、微波19。庄永亮、李八方等20研究了高压辅助热水提取海蜇胶原蛋白的工艺条件。以胶原蛋白得率（用羟脯氨酸含量计算）为指标，分别研究了高压功率、高压处理的时间、热水温度以及热水提取时间对胶原蛋白得率的影响，得到优化的工艺条件料液比L4（W/V），
43、高压功率250MPA，高压处理时间10MIN，热水处理温度70，热水提取时间15H。此条件下，海蜇胶原蛋白的得率为682。与传统的胶原蛋白提取方法比较，高压辅助提取方法操作工艺简单易控制，产品无小分子盐掺入，生产周期短，生产环保无污染。113胶原蛋白的应用胶原蛋白具有较强的生物活性和生物功能，能参与细胞的迁移、增殖和分化，使骨、腱、软骨和皮肤具有一定程度的机械强度。同时胶原蛋白还能促进细胞的生长，具有止血，生物相容性和生物降解性。因其具有这些性质，胶原蛋白在创伤、烧伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域有着广泛的应用。由于胶原蛋白及其水解物与人皮肤胶原的结构相似，相容性
44、较好，可以扩散到皮肤深层，对人的皮肤有很好的营养作用，且胶原蛋白分子外侧存在大量的羧基和羟基，同时存在大量的甘氨酸等天然保湿因子，能够提高组织细胞的贮水能力，使皮肤保湿；胶原蛋白溶液还有很强的抗辐射作用，因而胶原蛋白还广泛应用于化妆品行业2123。胶原蛋白也可以作为功能食品和保健食品，也可以生产可食性包装材料24。12海蜇胶原蛋白的概述近年来，由于疯牛病等疾病的暴发以及宗教因素的影响25，人们开始寻求从水产动物中提取胶原蛋白。我国海蜇资源丰富，因此，如能从海蜇废弃物中提取胶原蛋白加以利用，既能促进海蜇加工废弃物的综合利用，又能开发一种新的胶原蛋白源。121海蜇的生物学特性海蜇RHOPILEME
45、SCULENTUM，又称为刺胞动物，属腔肠动物门、钵水母纲、根口水母目、海蜇属26，是暖水沿岸物种，在海洋内分布广泛。海蜇在海洋中营浮游生活，栖息于近岸水域，喜居河口附近，主要分布于中国、日本、朝鲜半岛沿岸及俄罗斯远东海域。海蜇体呈伞盖状，通体半透明，白色、青色或微黄色，伞径超过45CM，最大可达1M，呈半球形，上伞隆起，中胶层发达；下伞较薄，边缘具发达环肌，能收缩运动27。122海蜇胶原蛋白的研究进展海蜇除可食用外，全身都可入药，根据本草纲目所述，海蜇“气味咸温无毒、主治妇人劳损、积血带下，小儿风疾丹毒，烫火伤”，对哮喘、气管炎、胃溃疡、单纯性甲状腺肿大、高血压等症均有疗效26、28。新鲜海
46、蜇含水量约为96，蛋白质含量约292，脂肪含量小于001。除水外，蛋白质是海蜇的主要成分，而且主要是胶原蛋白26。因此海蜇的药理功能与其蛋白质组成必然有一定的联系，已有研究表明，从海蜇中提取的胶原蛋白可用于治疗风湿性关节炎。因此对海蜇的胶原蛋白及其氨基酸组成进行测定也是很有必要的，这将有助于海蜇的营养评价和保健功能的研究。庄永亮等29研究海蜇伞部胃蛋白酶促溶性胶原蛋白的提取及其部分理化性质，氨基酸组成及SDSPAGE显示，海蜇伞部胶原蛋白PSC为型胶原蛋白；含糖量为28；热变性温度和热收缩温度分别为288和516，均低于牛皮型胶原；红外光谱显示PSC保留了大量的三股螺旋结构；溶解性表明PSC的
47、等电点为PH6，在PH3时有最大溶解度；酸性条件下盐浓度高于4M/V时，PSC的溶解度急剧下降。安桂香对新鲜海蜇的头部和腕部进行了氨基酸成分的分析，海蜇的蛋白占其干重的50，其氨基酸成分种类齐全，必须氨基酸含量丰富。分别用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶以及复合酶对海蜇的蛋白部分进行了酶解，确定出碱性蛋白酶酶解的最适反应条件为酶用量。金桂芬等分别采用酸法和酶法从海蜇提取胶原蛋白，结果表明，酶法提取相对于酸法提取可获得较高含量的胶原蛋白。13研究的目的和意义如今海蜇养殖业得兴起和发展为胶原蛋白的提取丰富了新的原料来源，且海蜇经加工后产生的大量废弃物是制备高蛋白食物的优良原料，
48、开发利用废弃物也有利于提高海蜇的附加值。从海蜇中提取得到的胶原蛋白因其特殊的氨基酸组成及理化性质而具有独特的生理功能，包括抗菌、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、治疗关节炎症和保健等功效30，可用作药品、食品、化妆品等相关制品原料。随着科技进步、经济发展和生活质量的普遍提高，人们崇尚绿色、回归自然意识的增强，高附加值海蜇胶原蛋白将越来越受到人们的广泛青睐。本文采用胃蛋白酶提取海蜇中的酶溶性胶原蛋白，考察了提取时间、酶用量、液料比对酶法提取率的影响，再结合响应面分析得出胶原蛋白提取的工艺优化条件。同时也对提取的胶原蛋白的理化性质进行分析氨基酸分析、红外光谱分析、紫外光谱分析，为海蜇酶溶性胶原蛋白
49、的应用提供理论基础。2材料与方法21材料与试剂海蜇，购于浙江省岱山县水产市场；L羟脯氨酸，购于SIGMA公司；柠檬酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、氯胺T、对二甲基氨基苯甲醛、冰乙酸、乙二醇独甲醚、浓硫酸、高氯酸、盐酸、无水乙醇、溴化钾、醋酸、溴酚蓝、乙醚、戊巴比妥钠，均为AR级，购于宁波奥博科学仪器有限公司；胃蛋白酶，由国药集团化学试剂有限公司提供；十二烷基硫酸钠、过硫酸胺、丙烯酰胺、巯基乙醇、考马斯亮蓝R25，购自上海生物工程有限公司；相关实验试剂的配置柠檬酸缓冲液柠檬酸钠120G、冰醋酸12ML、柠檬酸46G、氢氧化钠34G溶解于蒸馏水中，调整PH值至60，然后定容至1000ML；005MOL/L氯胺T溶液称取氯胺T705G，溶解于100ML蒸馏水中，然后加入乙二醇独甲醚150ML，再加入250ML柠檬酸缓冲液混合均匀；对二甲基氨基苯甲醛试剂A取无水乙醇20ML，慢慢加入浓硫酸274ML；试剂B取对二甲基氨基苯甲醛120G，慢慢加入无水乙醇40ML，水浴加热使其完全溶解并冷却至室温，然后将A液慢慢加入B，混合均匀；35MOL/L高氯酸溶液取27ML高氯酸，以蒸馏水定容到100ML。22仪器与设备台式高速冷冻离心机（HERAEUS，德国科峻仪器公司）真空冷冻干燥机（FREEZINGDRY，美国LABCONCO
