1、本科毕业论文系列开题报告生物工程香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液的筛选一、选题的背景与意义鱼类体液中几种主要抗菌因子在自身非特异性免疫中发挥着巨大作用。鱼体液中几种主要的抗菌因子有补体、抗菌肽、凝集素、溶茵酶、转铁蛋白、金属硫蛋白等。其中补体系统是先天性免疫的一个重要效应系统。它既是天然免疫防御的一部分，又是体液免疫的效应机制，同时对特异性免疫应答具有调节作用。补体是由血浆补体成分、可溶性和膜型补体调节蛋白、补体受体等30余种糖蛋白组成，是一个具有精密调控机制的蛋白质反应系统。补体重要结构之一末端补体分子C6，C7，C8和C9是构成膜攻击复合体（MAC）引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。其
2、中C9分子是形成MAC的最后一个分子，为单链糖蛋白，分子量是79KD。因此本课题拟通过优化香鱼C9重组蛋白包涵体，为进一步抗血清制备奠定基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是通过原核表达获得大量香鱼C9重组蛋白，并优化纯化方法，获得较纯的重组蛋白，为下一步C9抗血清制备奠定基础。拟解决的问题研究香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液的筛选。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法221诱导表达挑取单个PET28AC9/BL21PLYSE菌落，涂于含卡那霉素（50G/ML）的LB培养基上，过夜培养14H。在过夜培养后的LB培养基中挑取单个菌落接种于5MLLB培养液（含5
3、0G/ML卡那霉素），37摇床培养过夜。取1ML过夜培养的LB培养液，按1100比例稀释，接种于100MLLB培养液（含50G/ML卡那霉素）中，2H后，取1ML作为对照，记作样品1。其余培养液中加入IPTG（终浓度为04MMOL/L），继续培养4H。222菌体破碎将含有构建的表达载体的菌株扩大培养至100ML，在6000RPM下离心10MIN，弃上清，所得沉淀分别用20MLPBS洗涤液重悬浮，进行超声破碎（2S，间隔2S，90次）两次，破碎液中取样100L，记作样品2；其余破碎液13，000RPM离心10MIN，取100L的上清液，记作样品3，取100L的沉淀，记作样品4，其余的上清和样品冷
4、藏保存。223电泳检测目的蛋白是否为包涵体将样品14加入2SDSPAGE上样缓冲液（50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油），煮沸5MIN，10000RPM离心10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，用未诱导的菌体蛋白和BL21PLYSE菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80V，进入分离胶后加至95V。224染色与脱色电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，接着用蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R250（025COOMASSIESBRIGHTBLUER250）染色，室温下，染色2H后转至脱色液
5、中脱色，脱色1H后用清水漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，再进行观察、摄像。225包涵体洗涤将含有包涵体超声波破碎液沉淀分成四份，每份10ML，分别用10ML四种不同PBS洗涤液洗涤沉淀。13，000RPM10MIN，去上清后，采用PBS1（含2脱氧胆酸钠）洗涤沉淀，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品51、52、53。沉淀用PBS2（含05TRITONX100）洗涤，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品61、62、63。13，000RPM，离心10MIN，去上清，沉淀用PBS3（含05TRITONX1004M尿素）洗涤，在37
6、在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品71、72、73。13，000RPM，离心10MIN，去上清，沉淀用PBS4（含05TRITONX1004M尿素2脱氧胆酸钠）洗涤，在37在分别振荡温育1H、2H、3H，每次分别取样200L，记作样品81、82、83。226电泳检测样品58，加入2SDSPAGE上样缓冲液，煮沸5MIN，10000G离10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，37OC染色2H后转至脱色液，脱色至蛋白条带清晰，于纯化前样品2和样品4做比较。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度20109201010毕业论文选题；201010201011进行文献
7、查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案；201012开题答辩与综述；201012201012实验试剂准备；20101220112目的蛋白大量表达；2011220113数据和材料整理、分析；2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1李明云,丁天喜,竺俊全等我国香鱼的研究现状及增养殖前景J宁波大学学报理工版,1999,（04）8590SDSPAGE电泳检测比较诱导表达PET28AC9/BL21PLYSE菌株包涵体PBS（含2脱氧胆酸钠）洗涤沉淀包涵体PBS（含05TRITONX100）洗涤沉淀包涵体PBS（含05TRITONX1002M
8、尿素）洗涤沉淀收集菌体PBS重悬浮超声破碎包涵体离心离心，检测2李长红,陈炯,史雨红等宁海地区香鱼弧菌病病原菌鉴定J微生物学报,2009,（07）9319373曹克驹,李明云浙江香鱼的地理分布及其开发利用的初步意见J动物学杂志,1983,0563654刘峰,李家乐草鱼免疫因子研究进展J上海海洋大学学报,2009,（04）5025075于善谦,王洪海,朱乃硕等免疫学导论M北京高等教育出版社,19996FERREIRAAM,IRIGOINF,BREIJOMETALHOWECHINOEOCEGRANULOSUSDEALSWITHCOMPLEMENTJPARASITOLTODAY,2000,16416
9、81727GASQUEP,JONESJ,SINGHRAOSKETALIDENTIFIEATIONOFANASTROCYTECELLPOPULATIONFROMHUMANBRAINTHATEXPRESSESPERFORIN,ACYTOTOXICPROTEINIMPLICATEDINIMMUNEDEFENSEJJEXPMED,1998,18744514608BOHANAKASHTANO,ZIPORENL,DONINNETALCELLSIGNALSTRANSDUEEDBYCOMPLEMENTJMOLIMMUNOL,2004,415835979NGUYENHX,GALVANMD,ANDERSONAJC
10、HARACTERIZATIONOFEARLYANDTERMINALCOMPLEMENTPROTEINSASSOCIATEDWITHPOLYMORPHONUCLEARLEUKOCYTESINVITROANDINVIVOAFTERSPINALCORDINJURYJJOURNALOFNEUROINFLAMMATION2008JUN2552610CHONDROUMP,LONDOUAV,ZARKADISIKEXPRESSIONANDPHYLOGENETICANALYSISOFTHENINTHCOMPLEMENTCOMPONENTC9INRAINBOWTROUTJFISHSHELLFISHIMMUNOL2
11、006NOV215572611HOLLANDMC,LAMBRISJDTHECOMPLEMENTSYTEMINTELEOSTSJFISHSHEFISHIMMUNOL,2002,1239942012SUNYERJO,LAMBRISJDEVOLUTIONANDDIVERSITYOFTHECOMPLEMENTSYSTEMOFPOIKILOTHERMICVERTEBRATESJIMMUNOLREV,1998,166395713LAMMENSM,DECOSTEREA,HAESEBROUEKFEFFECTSOFFLAVOBACTERIUMPSCHROPHILUMSTRAINSANDTHEIRMETABOLI
12、TESONTHEOXIDATIVEACTIVITYOFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSPHAGOCYTESJDISAQUATORG,2000,4117317914李军,刘美杰,李勇等重组蛋白包涵体的研究进展J安徽农业科学,2008,31135521355415HOFFMANNF,VANDENHEUVELJ,ZIDEKNMINIMIZINGINCLUSIONBODYFORMATIONDURINGRECOMBINANTPROTEINPRODUCTIONINESCHERICHIACOLIATBENCHANDPILOTPLANTSCALEJENZYMEMICROBTECHN
13、OL,2004,3423524116CARRIMM,VILLAVERDEACONSTRUCTIONANDDECONSTRUCTIONOFBACTERIALINCLUSIONBODIESJJBIOTECHNOL,2002,9631217邝爱丽,陈圆圆,彭志峰等包涵体的形成原因及其处理方法J上海畜牧兽医通讯,2009,01626318龙建银,王会信外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展生物化学与生物物理进展,1997,24212613119PALMERI,WINGFIELDPTPREPARATIONANDEXTRACTIONOFINSOLUBLEINCLUSIONBODYPROTEINSFROMESC
14、HERICHIACOLIJCURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE,2004,16413114320SELLECKW,TANSRECOMBINANTPROTEINCOMPLEXEXPRESSIONINECOLIJCURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE,2008,21532432121WUPC,CHIENMS,TSENGYYETALEXPRESSIONOFTHEPORCINECIRCOVIRUSTYPE2CAPSIDPROTEINSUBUNITSANDAPPLICATIONTOANINDIRECTELISAJJOURNALOFBIOTECHNOL
15、OGY,2008,13323586422纪剑飞,张成刚包涵体重组蛋白的纯化及复性J沈阳药科大学学报,1998,23430330723王增,马会勤,张文包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展J中国生物工程杂志,2009,0710210724姜炜鹏,左金华,李继奎等以TRITONX100和脱氧胆酸钠为萃取剂制备兔脱细胞神经基质有最佳时间吗J中国组织工程研究与临床康复,2009,（47）9241924425BENNIONBJ,DAGGETTVTHEMOLECULARBASISFORTHECHEMICALDENATURATIONOFPROTEINSBYUREAJPROCEEDINGSOFTHEN
16、ATIONALACADEMYOFSCIENCES,2003,10095142514726艾恒,莫书荣,鲁波包涵体研究进展J中国医学文摘内科学,2006,02109111毕业论文文献综述食品工程与科学鱼类补体和C9基因的研究进展摘要鱼类的补体在杀灭和中和微生物方面起着重要作用，该系统系统可激活溶血途径和调理作用来实现其对机体的防御功能，其中C9是构成补体重要结构之一的末端补体分子的一类分子。本文主要介绍了鱼类补体特征、生物学作用以及鱼类补体的合成发生。同时，也介绍了C9基因的研究进展，以及适用于C9重组蛋白纯化的试验方法。关键词鱼类；补体；C9基因；研究进展1前言地球上的生物都在经历上亿年的时间
17、和不断变化的自然环境的过程中，慢慢的形成了它们自身特有的防御体系免疫系统。动物的免疫系统是由先天性免疫和获得性免疫系统两部分组成于善谦等,1999。其中鱼类是脊椎动物中，种类数量占比重最多的一个类群，在进化过程中，鱼类是处于连接高等脊椎动物和低等无脊椎动物的一个特殊地位，但目前关于非特异性免疫因子以及其与高等脊椎动物的比较研究还很有限，还缺乏更多的分子生物学方面的证据。对鱼类免疫系统的深入研究，在一定程度上有助于进一步的了解到脊椎动物免疫系统的发生、进化以及其多样性。和高等脊椎动物一样，鱼类也是利用免疫系统来初步防御外来病原生物的侵害，其免疫抵御机制包括非特异性免疫和特异性免疫，它们的共同作用
18、是都能够维持机体的正常功能以及鱼类自身内环境的稳定。补体COMPLEMENT，C是在先天免疫防御中具有重要功能的体液分子，其被病原体或者抗原抗体复合物等多种物质激活后，能够诱导炎症反应发生、抗体的形成以及介导病原体的清除。补体被抗原抗体复合体或微生物激活，然后可通过直接裂解或者促进吞噬作用消灭病原微生物。在补体系统两条激活途径中，涉及到14个补体蛋白（C19，及B、D、P因子）的参与，近年来，其在分子遗传学和分子克隆技术的应用日渐广泛。本文对鱼类补体系统的研究概况及与补体成分之一C9基因研究进展进行综述。2鱼类补体系统研究进展补体COMPLEMENT,C是先天免疫防御中重要的体液功能分子，在被
19、病原体或者抗原抗体复合物等多种物质激活后，能诱导炎症反应和抗体的形成、介导病原体的清除FERREIRAETAL,2000GASQUE,2004。补体经典溶血途径能够非特异性的补体系统与特异的获得性免疫联系起来，成为抗体介导的体液免疫的一种重要的效应机制FUJITAETAL,2004BMORGANETAL,2005。自1894年PFEIFFER发现溶菌现象以来，对补体的研究己经有100多年的历史，而鱼类补体的研究起步比较晚，对其系统研究是20世纪80年代以后才开始的DODDSFUJITAETAL,2004B。补体活化途径也称作补体系统。补体的各成分，为抗原抗体复合体以及其他成分，离子等相继会合连
20、锁被活化，结果引起免疫细胞溶解和免疫溶血，也就是细胞和细菌、红血球等的溶解或免疫粘着等许多免疫生物学现象（C1C9为补体的第一到第九成分），这一机制称为补体活化途径，大致可分为两种途径，第一补体途径（CLASSICALPATHWAY）和第二途径，第二途径亦称为代替途径（ALTERNATEPATHWAY）。22补体的合成和发生补体是存在于人和动物血清与组织液中,由近40种可溶性蛋白和膜蛋白组成，可溶补体蛋白的主要功能是结合和破坏入侵的病原，补体系统的膜蛋白又分为补体受体和补体调节蛋白。补体受体启动吞噬细胞结合和吞噬结合了补体调理素的病原。补体调节蛋白保护机体正常组织免受可溶补体蛋白的意外损害BO
21、HANAKASHTANETAL,2004。许多不同的组织细胞能够合成补体蛋白，包括肝细胞、单核巨噬细胞、角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肾小球细胞、滑膜细胞、上皮细胞肾脏，肺和肠道，脂肪细胞VOLANAKIS,1995谢佩蓉,1997，以及脑细胞神经胶质和神经元等FABRYETAL,1994。血浆中大部分补体组分由肝细胞分泌。单核巨噬细胞可产生几乎所有具有活性的补体成分，而其它类型的细胞或组织产生其中个别成分DALMOETAL,1997。鱼类肝脏是合成补体的主要器官ELLINGSENETAL,2005HUTTENHUISETAL,2006，但在其它组织器官如眼视网膜神经细胞、脊索、胃、肠道、胰
22、腺、心脏、脑、脾脏、肾脏和鳃中也检测到NAKAO,1998LANGEETAL,2004BCHONDROUETAL,2006B。23鱼类补体特性231鱼类补体具有较低的反应温度硬骨鱼类补体在较低的温度下激活，鱼类补体活化的最适温度是2025，哺乳动物则是37；温水鱼类在4550补体失活SAKAIETAL,1981，而虹蹲等冷水鱼类补体的灭活温度是4045MAGNADOTTIR,2000CLAIREETAL,2002，哺乳动物的ACP灭活温度是56，CCP的灭活温度是50。许多种鱼类在04也仍然显示溶血活性，两栖类和爬行类的补体也存在同样的特性KOPPENHEFFER,1957SUNYER1327
23、730511谢佩蓉脑内表达补体分子的研究近况J国外医学临床生物化学与检验学分册,1997,180624114312FABRYZ,RAINECS,HARTMNNERVOUSTISSUEASANIMMUNECOMPARTMENTTHEDIALEETOFTHEIMMUNERESPONSEINTHECNSJIMMUNOLTODAY,1994,1521822413DALMORA,INGEBRIGTSENK,BGWALDJNONSPECIFICDEFENCEMECHANISMSINFISH,WITHPARTIEULARREFERENCETOTHERETICULOENDOTHELIALSYSTEMRESJJ
24、FLSHDIS,1997,2024127314ELLINGSENT,STRANDC,MONSENE,ETALTHEONTOGENYOFCOMPLEMENTCOMPONENTC3INTHESPOTTEDWOLFISHANARHICHASMINOROLAFSENJFISHSHEFISHIMMUNOL,2005,1835135815HUTTENHUISHB,GROUCP,TAVERNETHIELEAJETALCARPCYPRINUSCARPIOLINNATEIMMUNEFACTORSAREPRESENTBEFOREHATCHINGJFISHSHEFISHIMMUNOL,2006,2058659616
25、NAKAOM,FUSHITANIY,FUJIKIK,ETALTWODIVERGEDCOMPLEMENTFACTORB/C2LIKECDNASEQUENCEFROMATELEOST,THECOMMONCARPCYPRINUSCARPIOJJIMMUNOL,1998,161481181817CHONDROUMP,MASTELLOSD,ZARKADISLKCDNACLONINGANDPHYLOGENETICANALYSISOFTHESIXTHCOMPLEMENTCOMPONENTINRAINBOWTROURJMOLIMMUNOL,2006B,431080108718SAKAIDKHEATINACTI
26、VATIONOFCOMPLEMENTSANDIMMUNEHEMOLYSISREACTIONSINRAINBOWTROUT,MASUSALMON,COHOSALMON,GOLDFISHANDTILAPIAJBULLJAPANSOCSCIFISH,1981,4756557119MAGNADOTTIRBINNATEIMMUNITYOFFISHOVERVIEWJFISHSHELLFISHIMMUNOL,2006,2013715120CLAIREMH,LAMBRISJDTHECOMPLEMENTSYSTEMINTELEOSTSJFISHSHEFISHIMMUNOL,2002,1239942021KOPP
27、ENHEFFERTLSERUMCOMPLEMENTSYSTEMSOFECTOTHERMICVERTEBRATESJDEVCOMPIMMUNOL,1987,1127928622WILLIANEPAUL,吴玉章等译基础免疫学（第四版）M,北京科学出版社,200323周凤兰,张页人血浆补体C9的纯化J,中国医学科学院学报,北京,1992,14538939324秦卫松,李芳秋人穿孔素氨基端肽段的原核表达与纯化J,医学研究生学报,2001,14191125李培成血浆C9测定方法及其初步临床应用J,上海医学检验杂志,1991,6423526徐钦,刘成国牛初乳免疫球蛋白的提取与纯化方法研究J,农产品加工,2
28、010,17274指导教师签字史雨红2010年12月13日本科毕业设计（20_届）香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液的筛选目录1前言162实验材料与方法1721原料、仪器和试剂17211原料与试剂17212主要仪器18213主要试剂及其配制1922实验方法20221诱导表达20222菌体破碎20223电泳检测目的蛋白是否为包涵体20224染色与脱色20225包涵体洗涤20226电泳检测213结果2131菌株诱导蛋白表达检测结果2132重组蛋白质是否为包涵体的检测结果2233C9重组蛋白质包涵体洗涤效果检测结果234讨论2441包涵体洗涤剂效果分析25致谢错误未定义书签。参考文献26摘要鱼类的
29、补体在机体抵御致病微生物感染中起重要作用，该系统能够激活溶血途径和免疫调理作用来实现其对机体各种病害的防御功能，其中C9是构成补体重要结构之一末端补体分子的一类分子；为了制备香鱼C9抗血清，以在香鱼养殖中提高香鱼免疫力减少病害造成的损失，利用基因重组技术，将重组蛋白纯化变性等处理即得到抗血清。本实验研究目的鉴定目的蛋白为包涵体，并分析筛选纯化包涵体较优的洗涤缓冲液配方。研究方法使用不同配方的洗涤液纯化目的蛋白，通过SDSPAGE电泳分析各配方效果优劣。结果验证了香鱼C9重组蛋白是以包涵体形式存在，在对配方组成及结果分析中，筛选得到的最适香鱼C9重组蛋白包涵体纯化洗涤缓冲液配方为PBSPH800
30、5TRITONX1004M尿素洗涤C9包涵体1H。关键词包涵体；洗涤纯化；补体；C9基因ABSTRACTCOMPLEMENTSYSTEMPLAYSANIMPORTANTROLEINKILLINGMICROORGANISMSANDINTHECENTOROFFISHIMMUNESYSTEMTHESYSTEMFUNCTIONSASADEFENSEAGAINSTDISEASESBYACTIVATINGTHEIMMUNEHEMOLYTICPATHWAYANDIMMUNOREGULATINGC9ISANONEOFTHEIMPORTANTELEMENTSOFATERMINALCOMPLEMENTMOLECU
31、LESAYUISOFGREATECONOMICVALUETHEHISTORYOFAYUFARMINGINCHINAISSHORTTHEDISEASECONTROLTECHNOLOGYANDEXPERIENCEARENOTMATURETHEDISEASESINTHECULTUREPROCESSHASASERIOUSIMPACTONTHEDEVELOPMENTOFBETTERFARMINGOBJECTIONPROKARYOTICEXPRESSEDAYUC9WASOBTAINEDTHISSTUDYWASTOPURIFIEDTHEAIMEDPROTEIN,ALLEVIATETHEIMPACTTHEPR
32、OTEINSFROMECOLIWESCREENEDTHEOPTIMALWASHBUFFERSTOPURIFIEDTHEINCLUSIONBODIESMETHODSWEFIRSTOBTAINEDTHEC9RECOMBINANTPROTEINEXPRESSEDECOLISTRAINBL21PLYSETHENWESETFOURDIFFERENTFORMULATIONSOFWASHINGBUFFERS,THEOPTIMALWASHBUFFERWASSELECTEDBYSDSPAGEELECTROPHORESISANALYSISRESULTSTHERECOMBINANTPROTEINWASVERIFIE
33、DTHENAYUC9ISCOMFIRMEDTOFORMOFINCLUSIONBODIESINTHEEXPRESSIONTHEOPTIMUMINCLUSIONBODIESWASHINGBUFFERFORPURIFYINGAYUC9RECOMBINANTPROTEINWASTHEPBSPH8005TRITONX1004MUREAFOR1HKEYWORDSINCLUSIONBODYWASHINGANDPURIFICATIONCOMPLEMENTC9GENE1前言香鱼PLECOGLOSSUSALTIVELIS，是溯河性一年生的一种小型经济鱼类。因它的脊背上有一条充满香脂的腔道，能够散发出香味，所以被称
34、为香鱼。世界上的香鱼已经很稀少，只有在我国的闽南、台湾局部地区仍存在丰富的资源。香鱼的肉质醇厚、细嫩味美并带有殊香，就像从香水里捞出来一样，并且也无其他鱼腥味，人们对它评价很高很是喜爱，所以香鱼养殖具有很大的经济价值和效益，如现市场鲜鱼价已高达160180元/KG，而“色如黄金，可携千里”的香鱼干，其价格已高达650元/KG1。但是香鱼的养殖历史却比较短，香鱼的疾病防治技术和经验均还不成熟，在香鱼养殖过程中，香鱼疾病问题已严重影响了香鱼养殖业更好的发展。在日本还有我国台湾，常有香鱼养殖病害的报道，尤其弧菌类疾病的发病率较高2。所以随着养殖业和经济的发展，人们意识到必须加强病害防治及香鱼疫苗方面
35、的研究。目前日本已成功地研制出假单孢菌病的疫苗，已使得香鱼的成活率高达823。近年来，随着我国水产养殖业的迅速发展以及分子生物学技术逐步完善的条件下，鱼类免疫学和免疫防病技术引起了人们的极大重视，即通过免疫手段特异性或非特异性作用来增强水产动物自身的防御能力4，以使鱼类免疫学得到了长足的进步和发展，从而达到健康养殖降低养殖风险行提高养殖安全性，并保证该产业的持续发展。地球上的生物都在经历上亿年的时间和不断变化的自然环境的过程中，慢慢的形成了它们自身特有的防御体系免疫系统。动物的免疫系统是由先天性免疫和获得性免疫系统两部分组成5。其中鱼类是脊椎动物中，种类数量占比重最多的一个类群，在进化过程中，
36、鱼类是处于连接高等脊椎动物和低等无脊椎动物的一个特殊地位，但目前关于非特异性免疫因子以及其与高等脊椎动物的比较研究还很有限，还缺乏更多的分子生物学方面的证据。对鱼类免疫系统的深入研究，在一定程度上有助于进一步的了解到脊椎动物免疫系统的发生、进化以及其多样性。和高等脊椎动物一样，鱼类也是利用免疫系统来初步防御外来病原生物的侵害，其免疫抵御机制包括非特异性免疫和特异性免疫，它们的共同作用是都能够维持机体的正常功能以及鱼类自身内环境的稳定。补体COMPLEMENT，C是在先天免疫防御中具有重要功能的体液分子，其被病原体或者抗原抗体复合物等多种物质激活后，能够诱导炎症反应发生、抗体的形成以及介导病原体
37、的清除6,7。补体的组成它是由血浆补体成分、可溶性和膜型补体调节蛋白以及各种补体受体等30余种糖蛋白组成，是一个具备精密调控机制的蛋白质反应系统8。其中补体的重要结构之一末端补体分子膜攻击复合体MACMAC是在细胞膜上形成许多亲水性穿膜孔道，能够使得水和电解质通过，但不让蛋白质类等大分子逸出，最终因为细胞内的渗透压改变，而使得细胞溶解破坏。MAC在细胞免疫中有重要作用，如创伤性中枢神经系统损伤可激活补体，可使膜攻击复合物C5B9/MAC形成并沉积，这对细胞病势渐退和中枢神经系统的亚溶解有重要作用9。C6、C7、C8和C9是构成膜攻击复合物中引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。其中C9分子为形成M
38、AC的最后一个分子，它是一种单链糖蛋白10，分子量是79KD。C9作为MAC重要组成之一，目前主要有应用于一些相关疾病的检测。近年来，补体的应用在分子遗传学领域和分子克隆技术日渐广泛，鱼类补体的生物学作用主要包含以下这几方面1鱼类的补体在杀灭以及中和微生物方面对鱼类免疫系统有着重要作用，其中补体的杀菌活性对硬骨鱼类清除细菌提高免疫细腿杀伤性具有重要作用11，非抗体依赖性的ACP途径，可以通过革兰氏阴性菌的LPS直接激活，从而导致细菌细胞的溶解破裂12；2鱼类补体具有溶血活性鱼类的血清补体能够通过激活ACP来高效溶解多种脊椎动物如兔、绵羊、山羊、狗和人类血液中的红细胞12；3鱼类补体的调理作用补
39、体激活过程中能够产生C3B、C4B和IC3B等非常重要的调理素，它们能够与吞噬细胞表面相应的受体进行结合，促进吞噬细胞吞噬作用，在多种鱼类中己观察到补体介导的调理作用13。在多种重组基因已在原核表达系统中高水平表达的过程中，一部分的重组蛋白多以没有生物活性的形式即包涵体的形式存在，而包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成了一些由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在包涵体中除了包含大量的重组蛋白，也含有一些菌体成分，如一些核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白、环状或缺口的质粒DNA，还有脂体、脂多糖等，大小为051M，它们具有很高的密度约为13MG/ML，无定
40、形，呈非水溶性。当重组蛋白以包涵体的形式存在时，能够获得高表达、高纯度的重组蛋白，去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质14，同时，因形成包涵体避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率15,16，通常其表达量可占菌体总蛋白的1030，甚至高达5017，但包涵体不具有生物活性，需要通过体外重折叠技术使包涵体复性才能恢复其天然构象并表现出生物活性18。包涵体形成的原因主要有以下几种1重组蛋白表达量过高，以往研究发现在重组蛋白低表达时很少形成包涵体，表达量越高就越容易形成包涵体19。其原因可能是由于合成速度太快，以至于没有足够的时间对重组蛋白进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，
41、致使蛋白质没办法达到足够的溶解度等。2所需的目的重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化致使中间体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成20。3重组蛋白分泌序列的存在阻碍其进行折叠，导致有错误折叠的分子产生。4重组蛋白的氨基酸组成中，通常其含硫氨基酸越多就越容易形成包涵体。5从包涵体形成动力学研究发现，包涵体是由部分变性的中间体聚合而成。因此，任何能够影响到中间体稳定性的因素，如PH值PH接近重组蛋白等电点时容易形成包涵体、离子强度和温度都能够引起蛋白聚合反应。6在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。7有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白
42、质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体21。本论文选择香鱼补体C9蛋白作为研究对象，通过利用大肠杆菌对C9重组蛋白的大量表达，在对C9重组蛋白包涵体进行提取纯化过程中，利用SDSPAGE电泳检测分析筛选出最适的洗涤液配方，以便为后续分析其蛋白功能关系及C9抗血清制备奠定基础。2实验材料与方法21原料、仪器和试剂211原料与试剂1菌株大肠杆菌BL21PLYSE由本实验室保存2质粒PET28A载体由本实验室保存3主要化学试剂A胰蛋白胨上海生物工程公司B酵母提取物上海生物工程公司CIPTG上海生物工程公司D马斯亮蓝R25上海生物工程公司E卡那霉素上海生物工程公司F脱氧胆酸钠由本实验室保存G溴酚兰
43、上海生物工程公司HTRIS上海生物工程公司I甘油浙江中星化工试剂有限公司JDTT上海生物工程公司K尿素上海生物工程公司L磷酸二氢钾国药MTTITONX100由本实验室保存NNACL上海生物工程公司OKOH国药PKCL国药Q蛋白缓冲液由本实验室保存R低分子量蛋白质标准上海生化研究所S乙醇上海生物工程公司T乙酸上海生物工程公司212主要仪器1台式离心机MICROCL17，THERMO2细胞超净台苏州净化3电子分析天平上海科达测试仪器厂4812恒温磁力搅拌器上海司乐仪器有限公司5DYY11B电泳仪北京市六一仪器厂6DELTA320PH计上海富众生物科学有限公司7EYELALT1700电热恒温培养箱上
44、海实验仪器厂有限公司8HZ9211K恒温摇荡器太仓市科教器材厂9TS1杰瑞尔脱色摇床金坛市杰瑞尔电器有限公司10JY92II超声波细胞粉碎机上海新芝生物技术研究所13凝胶成像系统UVP，W/VISIONWORKS213主要试剂及其配制1菌体培养及保存所用试剂ALB液体培养基NACL05，酵母抽提物05，胰蛋白胨1，用NAOH调PH至74，在151BFIN1034X105高压蒸汽中灭菌20MIN。BLB固体培养基LB液体培养基中加入琼脂至15，高压灭菌。C20甘油加20ML甘油于适量水中，加水定容至100ML过压灭菌后于4保存，备用。DIPTG保存液100MM500MGIPTG溶于20ML蒸馏水
45、，用滤膜进行无菌过滤，分装保存于20。E卡那霉素注射液硫酸卡那霉素360MG和甲氧苄啶18MG，蒸馏水定容至2ML。22SDSPAGE上样缓冲液50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油，配制20ML。3洗涤液配方APBS洗涤液300MMKCL，称取KCL11185G；50MMKH2PO4，称取KH2PO434G，加入容量瓶中，用蒸馏水定容500ML，搅拌充分溶解，用KOH和HCL调节PH至80；BPBS1PBSPH802脱氧胆酸钠加005G脱氧胆酸钠于50MLPBS洗涤液中；CPBS2PBSPH8005TRITONX100加250LTR
46、ITONX100于50MLPBS洗涤液中；DPBS3PBSPH8005TRITONX1004M尿素加250LTRITONX100和12G尿素于50MLPBS洗涤液中；EPBS4PBSPH8005TRITONX1004M尿素2脱氧胆酸钠加250LTRITONX100、12G尿素和005G脱氧胆酸钠于50MLPBS洗涤液中。4SDSPAGE凝胶电泳所用试剂A30丙烯酰胺丙烯酰胺29G，N，N亚甲丙烯酰胺1G，溶于60ML水中，定容至100ML，滤纸过滤后使用。B5XTRIS甘氨酸电泳缓冲液151GTRIS碱，44G甘氨酸，5GSDS，加水至1000ML。C15MMOLLTRISCLPH88在800
47、ML水中溶解18671GTRIS，调PH88，定容至1000ML。D05MMOLLTRISCLPH68在800ML水中溶解12114GTRIS，调PH68，定容至1000ML。E10SDS900ML水中溶解100G电泳级SDS，加热至68助溶，加入几滴浓盐酸调节PH至72，加水定容至1L，分装备用。F10过硫酸铵称取过硫酸铵2G，适量水溶解后，定容于至20ML，分装成1ML管，20保存备用。GTEMED4避光保存。H脱色液45甲醇，45水，10冰乙酸。I考马斯亮蓝染液脱色液中加考马斯亮蓝R250或G250至025，滤纸过滤后使用。J2SDS凝胶加样缓冲液TRISHCL05M，PH68，25ML
48、，SDS04G，甘油2ML，巯基乙醇或DTT02ML，溴酚蓝122实验方法221诱导表达挑取单个PET28AC9/BL21PLYSE菌落，涂于含卡那霉素50G/ML的LB培养基上，过夜培养14H。在过夜培养后的LB培养基中挑取单个菌落接种于5MLLB培养液含50G/ML卡那霉素，37摇床培养过夜。取1ML过夜培养的LB培养液，按1100比例稀释，接种于100MLLB培养液含50G/ML卡那霉素中，2H后，取1ML作为对照，记作样品1。其余培养液中加入IPTG终浓度为04MMOL/L，继续培养4H。222菌体破碎将含有构建的表达载体的菌株扩大培养至100ML，在6000RPM下离心10MIN，弃
49、上清，所得沉淀分别用20MLPBS洗涤液重悬浮，进行超声破碎2S，间隔2S，90次两次，破碎液中取样100L，记作样品2；其余破碎液13，000RPM离心10MIN，取100L的上清液，记作样品3，取100L的沉淀，记作样品4，其余的上清和样品冷藏保存。223电泳检测目的蛋白是否为包涵体将样品14加入2SDSPAGE上样缓冲液50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油，煮沸5MIN，10000RPM离心10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，用未诱导的菌体蛋白和BL21PLYSE菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80V，进入分离胶后加至95V。224染色与脱色电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，接着用蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R250025COOMASSIESBRIGHTBLUER250染色，室温下，染色2H后转至脱色液中脱色，脱色1H后用清水漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，再进行观察、摄像。225包涵体洗涤将含有包涵体超声波破碎离心液沉淀用PBS重悬浮后，分成四份，每份10ML，分别用10ML四种不同PBS洗涤液洗涤沉淀。13，000RPM10MIN，去上清后
