1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程乌贼墨汁多糖的提取工艺研究一、选题的背景与意义乌贼具有高营养、生活史较短（通常一年）、生长快和分布广等特点，是一类很有发展前景的海水养殖种类，也是海洋中最大、最具潜在价值的蛋白质资源。随着国内水产加工业的发展，生产过程产生的下脚料逐年增多，造成环境污染、资源浪费。乌贼墨常作为下脚料被丢弃，造成环境污染和资源浪费。乌贼墨的主要成分为蛋白质、脂肪、糖、黑色素和多种微量元素。乌贼墨由于其独特的生物活性，成为研究较热的一项内容。多糖又称为多聚糖,是构成生命的四大基本物质之一，它存在于生物体一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动，有多种多样的生物学功能。多糖
2、是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖。多糖类物质包括糖原，甲壳素，肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。其中肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖海洋动物作为动物多糖的重要来源之一，具有多种特殊的生物学功能。目前，研究乌贼墨汁多糖的相对较少。我国乌贼产量丰富，但是在乌贼的加工过程中,乌贼墨常被丢弃,造成相当大的经济损失和环境污染。文献报道中对乌贼墨汁多糖的研究较少，为提高乌贼的利用价值,本实验对乌贼墨汁多糖进行部分研究。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1料水比对墨汁多糖的提取工艺的影响2加酶量对墨汁多糖的提取工艺的影响3提取时间对墨汁多糖的
3、提取工艺的影响4PH对墨汁多糖的提取工艺的影响5温度墨汁多糖的提取工艺的影响拟解决的主要问题1确定料水比、加酶量、提取时间、PH、温度对乌贼墨汁多糖提取的影响2最佳提取工艺的确定三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201010201012查阅相关文献和资料，熟悉实验基本操作20111220111实验探索，前期准备工作2011220105加酶、加水、调PH值墨囊解冻取墨汁水浴正交法确定料水比、加酶量、PH最佳条件灭酶正交法确定时间、温度最佳条件三氯乙酸除杂蛋白离心取上清液离心取上清液干燥得粗多糖乙醇沉淀旋转蒸发浓缩进行试验，撰写论文五、主要参考文献1骆传环,黄荣清,刘曙晨海星多糖的分
4、子量测定J军事医学科学院院刊,2002,2622殷涌光,韩玉珠,丁宏伟动物多糖的研究进展J食品科学,2006,2732562623刘天龙,许剑琴多糖现代研究及应用进展J中国兽医杂志,2004,40324264马宝瑕,陈新,邓军娥中药多糖研究进展J中国医院药学杂志,2003,2363603625万淑莹,何光星,徐嘉红蚕蛹多糖的分离和分析J中成药,1992,143356刘兴杰,刘传琳,任虹等海葵等四种动物粘多糖碱提取的比较研究J烟台大学学报,2001,1442642687陈菊嫡,樊绘曾,邢蕊凝等花刺参酸性粘多糖的分离研究J中国海洋药物,1994,1248张红岩,吕琳鹿茸酸性多糖的含量测定研究J中成
5、药,1988,10349唐孝礼,邱鹏新,黎明涛等黑海参酸性粘多糖的分离纯化J中药材,1999,22522310邓永智,李文权,袁东星海水小球藻中多糖的提取及其单糖组成的气相色谱质谱分析J分析化学,2006,34121697170111钟丹,张建新,张世恒超声波提取牛蒡菊糖J西北农业学报,2008,17229730012佘志刚,胡谷平,吴耀文等鲍鱼多糖HALA的甲醇解研究J有机化学,2002,22536713吴梧桐,高向东猪胎盘脂多糖的分离纯化及其对脾淋巴细胞的诱导作用J生物化学杂志,1990,6211114吴红棉,雷晓凌,洪鹏志等珠母贝糖胺聚糖的纯化及其化学性质J水产学报,2000,24657
6、015张彦民,李宝才,朱利平等多糖化学及其生物活性研究进展J昆明理工大学学报理工版,2003,28314014916柴向华,佘纲哲,吴克刚等鲨鱼软骨多糖的提取工艺研究J中国生化药物杂志,1999,2013817LIGNOTB,LABHOGUEV,BOURSEAUPENZYMATICEXTRACTIONOFCHONDROITINSULFATEFROMSKATEEARTILAGEANDCONCENTRATIONDESALTINGBYULTRAFILTRATIONJJBIOTECHNOL,2003,103328128418钮明洋,姚文兵,姚金凤等超滤法在海洋真菌多糖分离纯化工艺中的应用J中国生化药物
7、杂志,2004,253616219陈浩凡,潘仕荣,胡喻等动物多糖的分离纯化方法J现代食品与药品杂志,2007,171391220范秀萍,吴红棉,雷晓凌等珠母贝氨基多糖的分离纯化及其抗肿瘤活性的初步研究J中国海洋药物2005,242323621钦传光,黄开勋,徐辉碧泥鳅中的生物活性分子及其药理作用中国生化药物杂志,2002,231474822聂凌鸿,宁正祥广东淮山水溶性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性的研究J食品科学,2003,241112913323刘荣,孙芳,陈秀丽等松仁多糖化学结构的初步分析J林产化学与工业,2008,28411511724念保义,陈铭,王铮敏超滤膜分离香菇多糖的研究J化学工
8、业与工程技术,2003,244273025来鲁华,杨显婷寡糖的构象分析J生物化学与生物物理进展,1995,22429029426REINHOLDVN,REINHOLDBB,COSTELLOCECARBOHYDRATEMOLECULARWEIGHPROFILINGSEQUENCE,LINKAGE,ANDBRANCHINGDATAESCIDJANALCHEM,1995,67117721784毕业论文文献综述食品科学与工程乌贼墨汁多糖的提取工艺研究摘要本文对动物多糖的提取，分离纯化进行了简单的描述以及简单介绍了多糖分级纯化方法超滤法和柱层析法，同时对多糖的分析鉴定方面做了一定描述。关键词多糖；提取；
9、分离纯化；分析鉴定多糖又称为多聚糖，是一大类天然产物，由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，是构成生命的四大基本物质之一，广泛存在于植物、微生物、动物1等有机体中。多糖类物质包括糖原GLYCOGEN，甲壳素CHITIN，肝素HEPARIN，硫酸软骨素CHONDROITINSULFATE，透明质酸HYALURONICACID，硫酸角质素KERATANSULFATE，酸性粘多糖ACIDMUCOPOLYSACCHARIDE或糖胺聚糖GLYCOSAMINOGLYCAN。其中肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖2。由于多糖在临床上、食品工业、发酵工业及石油工业有着广泛的应用3，使多糖生
10、物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、生物化学、生命科学的研究热点，到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来4。本文对多糖的提取、分离和纯化、分析量和纯度等和方面的研究进展进行概括和综述。1多糖的提取根据多糖的存在形式及提取部位的不同，在提取之前确定是否需要进行预处理。动物多糖的提液，通常首先要去除表面脂肪，一般将原料经粉碎后加入丙酮等脱脂，脱脂后过滤得到的残渣再用水作溶剂进行提取。如万淑莹等5将蚕蛹干粉经丙酮脱脂，沸水提取，乙醇沉淀分离制备多糖。多糖的提取目前常用碱解法、热水浸提法、酶解法或碱解与酶解相结合的方法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法。如刘兴杰等6碱提
11、取法从绿疣海葵等4种海洋无脊椎动物中提取酸性粘多糖。陈菊嫡等7用碱解法提取分离花刺参酸性粘多糖；张红岩等8用木瓜酶消化方法提取分离鹿茸中酸性多糖CMAES等9用碱性过氧化氢提取小麦麸皮中的非淀粉多糖。唐孝礼等10用碱解与酶解相结合的方法提取分离黑海参酸性粘多糖。邓永智11等利用微波辅助提取法从海水小球藻中提取多糖。钟丹等12采用超声波提取牛蒡菊糖。MYSORE13用热水浸提法提取高粱中的多糖。得到的多糖提取液大多较粘稠，可进行吸滤，也可用离心法将不溶性杂质除去，将滤液或上层清液合并若为碱溶性多糖则需中和。合并的多糖提取液经浓缩后，醇沉，也可加入费林氏溶液或硫酸铵或溴化十六烷基三甲基铵等，使与多
12、糖物质结合生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后依次用乙醇、丙酮、乙醚等洗涤，将吸干后疏松的多糖迅速转入装有五氧化二磷或氢氧化钠的真空干燥器中或于真空干燥箱中减压干燥。若沉淀的多糖为胶状或具粘着性时可直接冷冻干燥。2多糖的分离纯化提取的粗多糖中常含有色素、多肽、蛋白质等杂质及无机盐类成分，因此需将其进行分离纯化。21去除蛋白几乎所有动物多糖都与蛋白质相连，因此动物多糖的提取首要问题是在多糖不被显著降解的条件下去除结合的蛋白质。多糖与蛋白质的结合不是物理或离子结合，而是共价结合。经碱提取及蛋白酶水解的组织消化液，是组分及性质相近的多糖混合物，它们的多羟基及强电解性使其处于可溶状态，除去残留蛋白质和各种
13、小分子将为多糖的进一步分级分离创造条件。除蛋白常用的有SEVAGE法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等电点沉淀法等。如佘志刚等14用SEVAGE法除蛋白制备鲍鱼多糖，吴梧桐等15用三氯乙酸法除蛋白制备猪胎盘脂多糖，吴红棉等16用等电点沉淀法除蛋白制备珠母贝糖胺聚糖。利用各种多糖的溶解度不同及电荷密度的差异进行分离，由于各种多糖结构和活性的不均一性和分子量的高分散性，分离得到单一多糖后，还可按其理化性质及生物活性进一步分离17。22脱色多糖中常含有一些色素，可以根据其不同性质采取不同的方法进行脱色。常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、吸附法纤维素、硅藻土、活性炭等等。如柴向华等18在制备鲨鱼软骨多糖
14、时用活性炭、白陶土进行脱色。另外，DEAE纤维素是目前最常用的脱色剂，通过离子交换柱不仅可以达到脱色的目的，而且还可以分离多糖。23分级纯化方法231超滤法超滤现是一种种重要的分离纯化实验技术，广泛用于含有小分子溶质的各种生物大分子如蛋白质、多糖、酶、核酸等的浓缩、分离和纯化。溶质或悬浮物料按大小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。在操作过程中不会改变产品的性能和活性，对不稳定产品是安全的，因而对于动物多糖这样的高分子生物活性物质来说是最适合的。LIGNOT等经比较证实超滤技术用于浓缩纯化硫酸软骨素的可行性，并证明孔径为01M时超滤膜分离效果最佳。钮明洋19用超滤
15、法代替透析法去除海洋真菌多糖提取液中的单糖等小分子杂质，结果表明超滤法所得产品的得率和多糖含量都高于透析法，更加适合于中试生产使用。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易勃附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。但总的来说，超滤技术的应用有很好的前景，将会引起更多的重视。232柱层析法层析技术是常用的分离纯化方法。它是利用混合物中各组分的理化性质吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等的差异，在物质经过两相中，不断地进行交换、分配等过程，而这过程
16、会产生不断的吸附一解吸一吸附一解吸作用，造成混合物中各组分距离不等的迁移，从而达到分离的目的。柱层析又称柱色谱，是通过色谱柱的分离作用，而达到纯化。动物多糖不能渗人到交联的结构中，因此不能在一般的树脂上被分离。而纤维素之所以具有分离、纯化高分子量化合物的能力，是因为它具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过，因此对动物多糖来说，纤维素的交换能力比离子交换树脂要大，同时纤维素来源于生物材料，洗脱条件温和，回收率高20。范秀萍21用纤维素柱纯化珠母贝氨基多糖，得到高质量分数的氨基己糖。凝胶柱层析是另一类应用广泛的方法，它有交联葡聚糖凝胶系列柱、琼脂糖凝胶系列柱、系列柱等。凝胶起
17、分子筛作用，分离的依据是分子的形状和分子的大小不同。钦传光22从泥鳅赫液中分离提取到中性的粗多糖，粗多糖经凝胶柱过滤，分离得到纯化的高聚糖和寡糖。3多糖的分析鉴定31纯度鉴定多糖是高分子化合物，其纯品微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。多糖纯度鉴定的常用方法超离心、高压电泳、凝胶层析、HLPC法等。现在应用较多的是HLPC法，旋光度测定23也是纯度测定的一种方法。32分子量的测定多糖分子量的测定是研究多糖性质的一项重要工作。常用方法渗透压法、蒸气压渗透剂法、端基法、粘度法、光散射法、凝胶色谱法、超过率法、沉淀法、凝胶电泳法、HPLC法、超离心分析法、分子筛色谱
18、法、GPC法24、MALDITOFMS法。33多糖结构分析多糖的结构分析手段很多，对多糖结构的分析是揭示其生物活性、构效关系的基础。多糖的一级结构含义比蛋白质丰富得多。要解决一种多糖的一级结构就必须解决多糖基的组成、糖基的排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头异构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。如成分复杂，也可折断成几种片段各自分析，然后凑成一个整个化合物。多糖的一级结构分析常用化学法和仪器分析法。如用核磁共振25分析羟基被取代情况。多糖序列分析即一级结构测定常用到红外光谱核磁共振、工具酶应用免疫学方法等2。目前研究多糖的二级结构常用的手段是NMR技术，如2DNMR，13C谱，通用的方法是
19、将现代NMR技术与理论计算相结合通过一定的理论计算筛选构象，主要的理论计算方法有从头计算、丰度经验计算及经验力场计算26。圆二色谱法（CD）也可用于糖的构象分析，张丽萍等应用CD谱测定了金顶侧耳多锗的水溶液构象。近年来，以精确三维结构知识为基础揭示重要生命活动的规律已达到前所未有的深度和广度，多糖作为一类重要的生物活性大分子其结构的研究势必推动对多糖的认识向深层次发展。3前景随着分子生物学和分析新技术的高速发展，特别是许多技术的联用，分析手段变得更加快速、灵敏和高效，从而使得多糖的分离和结构测定方法也取得了快速的发展。近年来的工作取得了较大的进展，愈来愈多的多糖被发现。并证实它们具有复杂、广泛
20、的生物活性和功能。随着对多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性机理，功效因子会更加明确，它的应用领域也将会更加拓宽。参考文献1骆传环,黄荣清,刘曙晨海星多糖的分子量测定J军事医学科学院院刊,2002,262572殷涌光,韩玉珠,丁宏伟动物多糖的研究进展J食品科学,2006,2732562623刘天龙,许剑琴多糖现代研究及应用进展J中国兽医杂志,2004,40324264马宝瑕,陈新,邓军娥中药多糖研究进展J中国医院药学杂志,2003,2363603625万淑莹,何光星,徐嘉红蚕蛹多糖的分离和分析J中成药,1992,143356刘兴杰,刘传琳,任虹等海葵等四种动物粘多糖碱提取的比较研究J烟台大学
21、学报,2001,1442642687陈菊嫡,樊绘曾,邢蕊凝等花刺参酸性粘多糖的分离研究J中国海洋药物,1994,1248张红岩,吕琳鹿茸酸性多糖的含量测定研究J中成药,1988,10349CMAES,JADELCOURALKALINEHYDROGENPEROXIDEEXTRACTIONOFWHEATBRANNONSTARCHPOLYSACCHARIDESJJOURNALOFCEREALSCIENCE,2001,34293510唐孝礼,邱鹏新,黎明涛等黑海参酸性粘多糖的分离纯化J中药材,1999,22522311邓永智,李文权,袁东星海水小球藻中多糖的提取及其单糖组成的气相色谱质谱分析J分析化学
22、,2006,34121697170112钟丹,张建新,张世恒超声波提取牛蒡菊糖J西北农业学报,2008,17229730013MYSOREWATEREXTRACTEDPOLYSACCHARIDESOFSELECTEDCEREALSANDINFUENCEOFTEMPERATUREONTHEEXTRACTABILITYOFPOLYSACCHARIDESINSORGHUMJFOODCHEMISTRY,1999,6434535014佘志刚,胡谷平,吴耀文等鲍鱼多糖HALA的甲醇解研究J有机化学,2002,22536715吴梧桐,高向东猪胎盘脂多糖的分离纯化及其对脾淋巴细胞的诱导作用J生物化学杂志,19
23、90,6211116吴红棉,雷晓凌,洪鹏志等珠母贝糖胺聚糖的纯化及其化学性质J水产学报,2000,24657017张彦民,李宝才,朱利平等多糖化学及其生物活性研究进展J昆明理工大学学报理工版,2003,28314014918柴向华,佘纲哲,吴克刚等鲨鱼软骨多糖的提取工艺研究J中国生化药物杂志,1999,2013819钮明洋,姚文兵,姚金凤等超滤法在海洋真菌多糖分离纯化工艺中的应用J中国生化药物杂志,2004,253616220陈浩凡,潘仕荣,胡喻等动物多糖的分离纯化方法J现代食品与药品杂志,2007,171391221范秀萍,吴红棉,雷晓凌等珠母贝氨基多糖的分离纯化及其抗肿瘤活性的初步研究J中
24、国海洋药物2005,242323622钦传光,黄开勋,徐辉碧泥鳅中的生物活性分子及其药理作用中国生化药物杂志,2002,231474823聂凌鸿,宁正祥广东淮山水溶性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性的研究J食品科学,2003,241112913324刘荣,孙芳,陈秀丽等松仁多糖化学结构的初步分析J林产化学与工业,2008,28411511725念保义,陈铭,王铮敏超滤膜分离香菇多糖的研究J化学工业与工程技术,2003,244273026来鲁华,杨显婷寡糖的构象分析J生物化学与生物物理进展,1995,224290294本科毕业设计（20_届）乌贼墨汁多糖的提取工艺研究目录1引言132材料和方法14
25、21实验材料14211原料14212试剂14213主要仪器和设备14214其他器材1422实验方法15221乌贼墨汁多糖的提取15222苯酚硫酸法测多糖含量15223标准曲线的制备15224多糖含量的测定16225墨汁多糖提取条件优化163结果和讨论1631加酶量对墨汁多糖提取的影响1632料水比对墨汁多糖提取的影响1733PH对墨汁多糖提取的影响1834提取温度对墨汁多糖提取的影响1935提取时间对墨汁多糖提取的影响1936多糖提取正交实验分析2037验证实验214结论225展望22致谢错误未定义书签。参考文献23附录错误未定义书签。摘要本文以乌贼墨作为实验研究对象，从中提取墨汁多糖。研究了
26、加酶量、料水比、PH、提取温度、提取时间五个因素，通过对加酶量、料水比、PH、提取温度、提取时间进行单因素分析确定各个因素对多糖提取的影响，根据单因素实验结果，对加酶量、料水比、提取温度、提取时间四个因素进行L934正交实验。通过对实验结果的分析，确定了墨汁多糖的最佳提取方案为料水比为125、加酶量为原料量的45、提取温度为50、提取时间为4H。在此提取条件下，乌贼墨汁多糖的提取率为363。关键词墨汁多糖；提取；正交ABSTRACTTHISESSAYEXTRACTSINKPOLYSACCHARIDEFROMSEPIAWHICHISCONSIDEREDASEXPERIMENTALRESEARCH
27、OBJECTINTHISESSAY,MAINLYSTUDIESFOLLOWINGFIVEFACTORSINCLUDINGENZYMECONCENTRATION、THERATIOBETWEENMATERIALANDWATER、PH、EXTRACTIONTEMPERATUREANDEXTRACTIONTIMEANDTHENANALYZETHEIRINFLUENCEONTHEEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDEACCORDINGTOTHESINGLEFACTOREXPERIMENTRESULTS,CARRYOUTAORTHOGONALEXPERIMENTL934BASEDONENZY
28、MECONCENTRATION、THERATIOBETWEENMATERIALANDWATER、EXTRACTIONTEMPERATUREANDEXTRACTIONTIMEBYANALYZINGTHERESULTSWEOBTAINTHEOPTIMIZEDEXPERIMENTALPARAMETERSOFEXTRACTIONTHERATIOBETWEENMATERIALANDWATERIS125、THEQUANTITYOFADDINGENZYMEIS45OFRAWMATERIAL、EXTRACTIONTEMPERATUREIS50、EXTRACTIONTIMEIS4HUNDERTHISCONDIT
29、IONTHEEXTRACTIONRATIOOFSEPIAINKPOLYSACCHARIDEIS363KEYWORDSSEPIAINKPOLYSACCHARIDEEXTRACTIONORTHOGONAL1引言乌贼本名乌鲗，又称花枝、墨斗鱼或墨鱼，属于软体动物门头足纲乌贼目乌贼科乌贼属的一种海洋动物，具有较高营养和多种药用功能。常见种类有金乌贼、虎斑乌贼、白斑乌贼、拟目乌贼、罗氏乌贼、曼氏无针乌贼等1。乌贼肉质细嫩，除了含有高蛋白、低脂肪外，还是含有大量牛磺酸的低热量食品。因可抑制血中的胆固醇含量，预防成人病、缓解疲劳、恢复视力、改善肝脏功能而倍受人们的青睐。乌贼具有高营养、生活史较短（通常一年）
30、、生长快和分布广等特点，是一类很有发展前景的海水养殖种类，也是海洋中最大、最具潜在价值的蛋白质资源。乌贼墨存在于墨囊中，是乌贼遇到天敌时喷出来染黑周围水域的黑色物质，以混乱天敌视野和麻痹天敌嗅觉，乌贼籍此方式逃生。现代医学研究表明，乌贼墨具有多种生理活性，乌贼墨在“本草纲目”中记有“肤中墨主治血刺心痛”之功效。现代临床应用证明它是一种良好的全身性止血药，对妇科、外科、内科等多种出血，止血效果显著，无毒副作用。乌贼墨不仅可以止血，而且有可能通过有效地控制出血使全身机能状况改善，调动机体自身调节功能，使功能恢复正常。同时对支气管扩张咯血、鼻出血、尿血、肺癌咯血、宫颈癌出血等也有一定的疗效2。乌贼墨
31、经提取、分离和纯化，得到了一种全新结构的粘多糖，这种粘多糖与蛋白分子相连，构成一种比较复杂的蛋白质多糖复合体，是一种高效抗癌活性成分，说明乌贼墨具有抗肿瘤作用35。乌贼墨有抗辐射作用。乌贼墨可保护造血干细胞，有显著促使环磷酞胺所致白细胞降低的回升作用，可预防大白鼠急性放射病6。有日本学者指出在鱿鱼的腌制发酵产品中加入乌贼墨能显著改善其保存性能，添加乌贼墨后使得鱿鱼在储藏期间化学变化变慢7。国内有学者研究表明，乌贼墨中的肽聚糖是发挥抗菌作用的主要物质8。乌贼墨的化学成分除了黑色素还有蛋白多糖复合体。多糖又称为多聚糖，是构成生命的四大基本物质之一，它存在于生物体一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞
32、的各种活动，有多种多样的生物学功能。多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖。多糖类物质包括糖原，甲壳素，肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。其中肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖海洋动物作为动物多糖的重要来源之一，由于在体内常以蛋白质结合状态存在，故也统称为蛋白聚糖9，具有多种特殊的生物学功能。多糖的提取目前常用碱解法、热水浸提法、酶解法或碱解与酶解相结合的方法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法。如刘兴杰等10碱提取法从绿疣海葵等四种海洋无脊椎动物中提取酸性粘多糖。陈菊嫡等11用碱解法提取分离花刺参酸性粘多糖；MYSORE12用热水浸提法提取高
33、粱中的多糖。张红岩等13用木瓜酶消化方法提取分离鹿茸中酸性多糖CMAES等14用碱性过氧化氢提取小麦麸皮中的非淀粉多糖。唐孝礼等15用碱解与酶解相结合的方法提取分离黑海参酸性粘多糖。邓永智16等利用微波辅助提取法从海水小球藻中提取多糖。钟丹等17采用超声波提取牛蒡菊糖。由于乌贼墨汁多糖是一种动物多糖，在体内常以蛋白质结合状态存在，是一种蛋白聚糖，利用酶解法可以有效去除蛋白，并且具有条件温和、得率高等优点。因此本实验采用酶解法。在我国，人们在吃乌贼时通常将墨囊弃去或把墨汁洗尽，同时随着国内水产加工业的发展，生产过程产生的下脚料逐年增多，乌贼墨也常作为下脚料被丢弃，造成环境污染和资源浪费。开发利用
34、乌贼墨不仅可变废为宝，获得经济效益，还可以改善环境，取得良好的社会效益。目前，研究乌贼墨汁多糖的相对较少。对乌贼墨汁多糖的提取工艺进行研究，具有重要的实践意义。2材料和方法21实验材料211原料金乌贼普通宁波市江北区庄市菜市场212试剂蒸馏水二级水宁波大学浓硫酸分析纯兰溪市六洞山化工试剂厂氢氧化钠分析纯杭州市瓶窑和顺化工试剂厂苯酚分析纯国药集团化学试剂有限公司三氯乙酸分析纯如皋市金陵试剂厂碱性蛋白酶20万U/G南京庞博生物工程有限公司乙醇96奥博生物有限公司三氯乙酸溶液（15）称取15G三氯乙酸于烧杯中，溶于水，移到100ML容量瓶中，用水稀释到刻度。6苯酚取6ML苯酚与烧杯中，转移至100M
35、L容量瓶中，用水稀释至刻度。现配先用。213主要仪器和设备电热恒温水浴锅DKS22型上海精宏实验设备有限公司PH测量仪DELTA320梅特勒托利多仪器（上海）有限公司分光光度计T6新锐北京普析通用仪器有限责任公司分析天平JD型余姚市金诺天平仪器有限公司高速冷冻离心机H2500R2型长沙湘仪离心机仪器有限公司旋转蒸发器RE522上海沪西分析仪器厂冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司214其他器材试管若干、锥形瓶若干、比色杯若干、比色管若干、试管架、滴定管、剪刀、移液管、镊子、塞子若干、量筒、洗耳球、洗瓶等。22实验方法221乌贼墨汁多糖的提取本实验的基本路线为墨囊解冻挤出墨汁加水，调PH值，加酶
36、水浴灭酶离心取上清液三氯乙酸除杂蛋白离心取上清液旋转蒸发浓缩乙醇沉淀干燥得粗多糖墨汁多糖提取工艺优化墨汁多糖提取单因素分析墨汁多糖提取多因素正交试验分析进行验证实验具体操作将乌贼墨囊于4条件下解冻，从墨囊中挤出墨汁备用，称取2G墨汁于锥形瓶中，加入蒸馏水，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液将溶液的PH调至8，然后加入一定量的碱性蛋白酶进行酶解，在特定温度下水浴一段时间，结束后置于电磁炉上100条件下灭酶10MIN，将灭完酶的溶液用高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，在上清液中加入四分之一体积的15的三氯乙酸溶液过夜，加三氯乙酸的目的是，使多糖提取液中的蛋白质与有机酸作用
37、而变性沉淀18，从而提高多糖的纯度。将加三氯乙酸过夜的溶液用高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，将得到的上清液用苯酚硫酸法测定多糖含量，最后将上清液置于旋转蒸发器中浓缩，浓缩后的容易PH调至7，再加入浓缩液四倍体积的乙醇让多糖沉淀，将沉淀进行冷冻干燥后得到微黄色样品，即为墨汁粗多糖。222苯酚硫酸法测多糖含量多糖的含量测定的方法可分为两大类19一类是直接测定法，如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法等。本实验采用苯酚硫酸法测定多糖含量。苯酚硫酸法的原理为糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯
38、酚缩合成一种橙红色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490NM波长下有最大吸收峰，在此波长下测定吸光度，进而得到糖含量。223标准曲线的制备准确称取标准葡萄糖100MG于100ML容量瓶中，加水至刻度，取10ML定容至100ML分别吸取02、04、06、08、10ML，各以蒸馏水补至20ML，然后加入6苯酚10ML及浓硫酸50ML，摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490NM测吸光度，以20ML水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖。单位为G/ML。纵坐标为吸光度，得标准曲线。本实验测得标准曲线，其回归方程为Y00076X00037，相关系数R209991，如图1所示。糖含量标准曲线Y000
39、76X00037R2099910100102030405060708020406080100120浓度（G/ML）吸光度（490NM）图1多糖含量标准曲线FIGURE1THESTANDARDCURVEOFPOLYSACCHARIDECONTENT224多糖含量的测定每次取1G样品进行实验，按221中的实验步骤得到加了三氯乙酸过夜的溶液，置于高速冷冻离心机下在9000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，将上清液定容至100毫升的容量瓶中。再吸取10ML于50ML容量瓶中，从中吸取1ML的样品液，以蒸馏水补至20ML，然后在通风橱中操作，向各个管中用移液枪加入6苯酚10ML，用移液管向各个
40、管中加入浓硫酸50ML，摇匀冷却后，在室温下放置20分钟以后，用分光光度计于490NM波长下测定吸光度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。多糖提取率（）100M50/（01M106）M/20M式中M经标准曲线算出的多糖含量，单位为微克（G/ML）M样品质量，单位为克（G）225墨汁多糖提取条件优化针对加酶量、料水比、提取温度、提取时间、PH值这五个条件对墨汁多糖提取的影响，分别对这五个因素进行单因素实验，在保持其他提取条件不变的情况下，分析在各自单一变量条件下的最佳提取值。根据这五个条件的单因素分析结果，再确定其中四个因素及其水平条件进行正交试验，分析确定最佳的提取条件及各提取条件对
41、乌贼墨汁多糖的提取的影响程度，最后根据分析所得的最佳提取条件进行验证实验。3结果和讨论31加酶量对墨汁多糖提取的影响采用碱性蛋白酶作为提取多糖的添加酶（其最适反应PH为8，比活为20万U/G）。在料水比为110，提取温度为40，提取时间为2H的条件下，碱性蛋白酶的加入量分别为原料质量的25，30，35，4，45，5六个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图2所示。0051152253354225335445555加酶量（）多糖提取率（）图2加酶量对墨汁多糖提取的影响FIGURE2THEEFFECTSOFENZYMECONCENTR
42、ATIONONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图2可以看出，在料水比为110，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着酶用量的增加，多糖的提取率呈现出不断上升的趋势至添加量为4时曲线增幅变缓，这表明添加量至4时，对多糖的提取影响变弱，综合经济方面的考虑，选用加酶量为原料量的4为此因素的条件。32料水比对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，提取温度为40，提取时间为2H的条件下，料水比分别为15，110，115，120，125五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果
43、如图3所示。由图3可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着料水比的增加，多糖提取率先增大后减小，并在料水比为20时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用料水比20时为此因素的条件。32533335343453535536051015202530料水比多糖提取率（）图3料水比对墨汁多糖提取的影响FIGURE3THEEFFECTSOFTHERATIOOFRAWMATERIALSANDWATERONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES33PH对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，料水比110，
44、提取温度为40，提取时间为2H的条件下，PH分别为7，8，9，10，11五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图4所示。275282852929533056789101112PH多糖提取率（）图4PH对墨汁多糖提取的影响FIGURE4THEEFFECTSOFPHONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图4可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，料水比110，提取温度为40，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着PH的增加，多糖提取率在PH810之间变化不大，PH大于10时迅速减小，并在PH为8时达到
45、最大，这是因为碱性蛋白酶的最适PH为8左右，当PH大于10时，碱性蛋白酶发生变性，导致多糖提取率下降。因此实验时保持溶液的PH为810时对结果影响不大。34提取温度对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取时间为2H的条件下，提取温度分别为30，40，50，60，70五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图5所示。292953305313153232520304050607080提取温度（）多糖提取率（）图5提取温度对墨汁多糖提取的影响FIGURE5THEEFFECTSOFTEMPER
46、ATUREONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图5可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取时间为2H的条件保持不变的情况下，随着温度的增加，多糖提取率先增大后减小，并在提取温度为50时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用提取温度为50时为此因素的条件。35提取时间对墨汁多糖提取的影响在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取温度为40的条件下，提取时间分别为1H，2H，3H，4H，5H五个水平进行实验。根据实验步骤，加三氯乙酸过夜后再离心取得的上清液在490NM条件下测吸光度。实验结果如图6所示。3232232
47、4326328333323343363380123456提取时间（H）多糖提取率（）图6提取时间对墨汁多糖提取的影响FIGURE6THEEFFECTSOFTIMEONEXTRACTIONOFPOLYSACCHARIDES由图6可以看出，在碱性蛋白酶的加入量为原料重的45，PH为8，料水比为110，提取温度为40的条件保持不变的情况下，随着提取时间的增加，多糖提取率先增大后减小，并在提取时间为3H时达到最大，多糖提取效果最好，因此选用提取时间为3H时为此因素的条件。36多糖提取正交实验分析根据之前所做的单因素实验及其结果分析。选择料水比、加酶量、提取温度、提取时间四个因素进行正交实验。确定四因素
48、三水平L934的正交试验中四个因素的水平分别为，料水比115，120，125；加酶量35，40，45；提取温度40，50，60；提取时间2H，3H，4H。具体因素水平见表1表1正交因素水平表TABLE1THELEVELOFORTHOGONALFACTORS因素水平A料水比B加酶量（）C提取温度（）D提取时间（H）111535402212040503312545604按照四因素三水平L934正交表的实验设置进行9次实验，实验中为避免误差过大，每次实验都做了3组平行取平均值，实验结果的直观分析见表2，方差分析见表3表2正交实验结果和直观分析TABLE2THERESULTSOFORTHOGONALE
49、XPERIMENTSANDVISUALANALYSIS实验编号ABCD多糖提取率（）111112572122234631333325421232905223130162312344731322478321335093321354K1928794951912K2935997990937K39511023873965K13093264731703040K23117332333003123K33170341029103217极差R0077076303900177因素主次BCDA优方案A3B3C2D3表3正交实验方差分析表TABLE3VARIANCEANALYSISOFORTHOGONALEXPERIMENT差异源偏差平方和自由度F比F临界值（010）显著性A0009200273110B1048231263110C0237207073110D0047201403110误差1348从表2的直观分析中的极差数据可知，本次实验中针对的料水比、加酶量、提取温度、提取时间四个实验条件中，影响墨汁多糖提取的因素主次关系为B（加酶量）C（提取温度）D（提取时间）A（料水比）。由于吸光度越大，溶液中被提取出来的多糖含量越高。因此从表2中确定实验的墨汁多糖的最佳提取方案为A3B
