1、本科毕业论文系列开题报告生物工程香鱼APOAI原核表达及鉴定一、选题的背景与意义香鱼属胡瓜鱼目香鱼科。地方又名香油鱼、瓜鱼、细鳞鱼、海胎鱼、秋生子，日本人称为鲇鱼。是一种中小型名贵鱼类，曾被列入“雁荡五珍”，在亚洲被誉为“鱼中珍品”。因其脊背上有一条满是香脂的腔道能散发出浓郁的芳香味而得名。香鱼肉质细嫩多脂，清香可口，无鱼腥味，比一般鱼类口感好，尤其是凫溪香鱼干，早在清代已远近闻名。香鱼营养丰富，其肌肉粗蛋白中含人体必需氨基酸含量高达6885，要比其他淡水鱼高出许多。香鱼为滤食性鱼类，在自然条件下，鱼苗主要摄食浮游动物和贝类幼体；长大后以石砾上附生的硅藻、蓝藻及绿藻类为食。人工养殖香鱼，蚕蛹、
2、螺肉、剁碎的鲜杂鱼虾及小麦粉、马铃薯、黄豆、米糠、青菜等均可作为饵料，也可使用香鱼专用饵料或鳗饵料。香鱼的分布范围很广，除我国外，日本、朝鲜也有分布。香鱼的人工养殖始于日本，中国的浙江省已有试验，河北省已养殖成功，台湾省则较为盛行。APOAI是高密度脂蛋白HDL的主要组成蛋白，它能与磷脂、多种血浆因子及细胞受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢的作用。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能。一般认为载脂蛋白至少有下列五方面功能与脂质的亲和作用，使脂质溶于水性介质中；运输胆固醇和甘油三酯；作为脂蛋白外壳的结构成分，它能将各种脂质成分（
3、胆固醇、甘油三酯和磷脂）结合在一起形成一个整体，与脂蛋白外生物信息相联系；以配体的形式作为脂蛋白与特异性受体的连接物；激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类。APOAI的临床意义在于它的测定可以直接反映高密度脂蛋白胆固醇的水平，从而了解冠心病、糖尿病等疾病的严重程度。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本课题通过构建香鱼APOAI原核表达载体，并转入大肠杆菌BL21PLYSE进行诱导表达目的蛋白，为进一步基因功能研究奠定基础。拟解决的问题香鱼APOAI原核表达及鉴定。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1引物设计根据已获得香鱼APOAI基因序列设计原核表达引物PAPOAI1（）5C
4、CATATGCGTACCTTGCAGGCTGATGA3；PAPOAI1（）5GGAATTCTTATGCCTTAATGGACTCGCT3（下划线为添加的限制性内切酶NDE和BAMH的识别序列）。2原核表达载体构建21PCR产物切胶纯化以121中原核表达引物配对进行PCR扩增，PCR产物与10LAODINGBUFFER混合，并在1（W/V）琼脂糖凝胶中电泳（120V），EB染色后漂洗，紫外灯下观察，切下预期大小的目的片段，用EZNATMGELEXTRACTIONKIT（OMEGA）纯化，具体方法如下1手术刀切下含有目的片段的凝胶并置于EPPENDORF管中，加300LBINDINGBUFFER后置
5、5560水浴10MIN，每隔23MIN颠倒混匀一次，至凝胶完全溶解；2将混合液混匀后转入蓝管，10000G离心1MIN；3加300LBINDINGBUFFER，10000G离心1MIN；4弃滤液，加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；5弃滤液，另加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；6弃滤液，13000G离心2MIN，彻底去除蓝管中的WASHBUFFER残留；7加入30LELUTIONBUFFER于蓝管，室温静置1MIN，13000G离心1MIN，收集产物30保存。22感受态制备采用CACL2法制备感受态细胞，具体方法如下1接种80长期保
6、存的大肠杆菌菌株到5MLLB（每升含10GTRYPTONE，5GYEASTEXTRACT，10GNACL，PH70）液体培养基中，37摇床，200RPM，培养过夜（12H左右）；2按1100比例取50L母液稀释到新鲜的5MLLB液体培养基中，继续37摇床培养，200RPM，培养2H；3取出菌液置冰上冷却10MIN，将冰冷的菌液1ML每管分装到15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，弃上清；4沉淀用200L预冷的01MOL/LCACL2悬浮，冰浴30MIN后，8000G离心1MIN，弃上清；5沉淀再用100L01MOL/LCACL2重悬浮，冰浴放置524H备用。23转化和筛选克隆
7、1将10LPCR产物加到100L感受态细胞中，移液枪轻轻吹打混匀冰浴放置30MIN；2在42水浴条件下热激90S，立即转移到冰上冷却2MIN；3加入冰预冷的LB培养液总体积至1ML，37摇床低速（170180RPM）培养1H；4在预先均匀涂布XGAL和IPTG的LB平板上（液体LB培养基中添加15琼脂粉），取100L转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素（50G/ML），37培养箱培养过夜（1014H）；5筛选白色菌落置5ML含氨卞青霉素（50G/ML）的LB培养液，在37摇床，200RPM，培养812H。24质粒提取根据质粒在下游实验中用途不同，我们用不同的方法抽提质粒，其中用于检测和筛选阳性
8、克隆采用采用碱裂法小量抽提质粒。用于双酶切的质粒采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）精抽纯化。裂解法（粗提质粒）1取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管中，8000G离心1MIN，弃去上清；2加入溶液I（50MMOL/L葡萄糖，10MMOL/LEDTA，25MMOL/LTRISCLPH80）100L，剧烈震荡使细胞悬浮；3加新配制的新鲜溶液II（02MOL/LNAOH，1SDS）200L，轻柔颠倒数次，待菌悬浮液澄清；4加入150L溶液III（3MOL/LKAC，2MOL/LHAC），混匀后13000G离心10MIN；5将380L上清转移至新的EPPENDORF
9、管中，加入异丙醇720L，颠倒数次13000G离心10MIN；6弃上清，沉淀经自然干燥后加50L无菌水溶解。25重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10甘油混匀后置于80保存。26原核表达载体的克隆1按（12）步骤获得含有目的基因的克隆。2采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA）分别纯化质粒PET22B（）和PCR产物。3对纯化的质粒进行双酶切，反应体系如下纯化的质粒16L10K缓冲液2LBAMHI1LN
10、DEI1L反应总体积20L37水浴2H4切胶纯化酶切后产物经1琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用切胶纯化试剂盒EZNATMGELEXTRACTIONKIT（OMEGA）纯化，步骤如前所述。5连接采用TAKARA公司的DNALIGATIONKITVER2，PET22B（）载体反应体系如下双酶切基因产物4LPET22B1LSOLUTIONI5L反应总体积10L16连接30MIN后，4过夜6将连接产物转化至TG1菌株，涂于含氨苄青霉素（50G/ML）的LB培养基上，筛选所需的克隆，经PCR进一步确定。27APOAI1基因的原核表达和检测1采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒（OMEGA
11、）纯化目的质粒。2转化至BL21PLYSE菌株，涂于含氨苄青霉素（50G/ML）的LB培养基上，过夜培养（1014H）。3诱导挑选单个菌落接种于5MLLB培养液（含50G/ML氨苄青霉素），37摇床培养过夜。取50L按1100比例稀释接种LB培养液（含50G/ML氨苄青霉素）5ML中，2H后，取1ML作为对照，其余培养液中加入IPTG（终浓度为04MMOL/L），继续培养2H。4检测取1ML菌液于15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，菌体加100L2SDSPAGE上样缓冲液（50MMOL/LTRISHCLPH68，100MMOL/LDTT，2SDS，001溴酚蓝，20甘油），
12、煮沸5MIN，10000G离10MIN后，取上清20L进行SDSPAGE电泳，用未诱导的菌体和BL21PLYSE菌体蛋白作对照，进行电泳。样品在进入分离胶前用80V，进入分离胶后加至95V。5染色与脱色电泳完成后，取出聚丙烯酰胺凝胶，切去浓缩胶，同时切一角作为方向标记，蒸馏水冲洗。用考马斯亮蓝R250（025COOMASSIESBRIGHTBLUER250）染色，室温下，染色30MIN后转至脱色液，漂洗至凝胶背景无颜色，蛋白条带清晰，观察是否表达。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度目的基因的引物设计总RNA提取及反转录香鱼肝目的基因的扩增双酶切PET22（）片段回收连接及转化重组质粒的鉴定
13、诱导表达及鉴定双酶切片段回收20109201010毕业论文选题201010201012进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。201012201012试验相关试剂的准备。20101220111构建香鱼APOAI原核表达载体和香鱼APOAI的原核表达及鉴定。2011120112数据和材料整理、分析。2011220113完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。2011420114开题答辩与综述。五、主要参考文献1MACIEJKOJJ,HOLMESDR,KOTTKEBA,ETALAPOLIPOPROTEINAIASAMARKEROFANGIOGRAPHICALLYA
14、SSESSEDCORONARYARTERYDISEASEJNENGLJMED,1983,30973853892KOTTKEBA,ZINSMEISTERAR,HOLMESDRJR,ETALAPOLIPOPROTEINSANDCORONARYARTERYDISEASEJMAYOCLINPROC,1986,6153133203BREWERHB,BRONZERTTJ,HOUSERA,ETALTHEAMINOACIDSEQUENCEOFHUMANAPOAI,ANAPOLIPOPROTEINISOLATEDFROMHIGHDENSITYLIPOPROTEINSJBIOCHEMICALANDBIOPHYSI
15、CALRESEARCHCOMMUNICATIONS,1978,8036236304徐勇霞，付明德载脂蛋白AI结构与功能研究进展J国外医学分子生物学分册，2002,24162645DAVIDSONWS,WILLIAMWM,HAZIETTT,ETALTHEROLEOFAPOLIPOPROTEINAIDOMAINSINLIPIDBINDINGJPNAS,1996,932413605136106DAVIDSONWS,ARNVIGMCGUIREK,KENNEDYA,ETALSTRUCTURALORGANIZATIONOFTHENTERMINALDOMAINOFAPOLIPOPROTEINAISTUDIE
16、SOFTRYPTOPHANMUTANTSJBIOCHEMISTRY，1999,384314387143957DAVIDSONWS,JOHNSONWJ,ANANTHARAMAIAHGM,ETALTHEINFLUENCEOFAPOLIPOPROTEINSTRUCTUREONTHEEFFLUXOFCELLULARFREECHOLESTEROLTOHIGHDENSITYLIPOPROTEINJJBIOLCHEM,2010,2854231965319738GILLOTTEKL,PHILLIPSMC,DAVIDSONWS,ETALREMOVALOFCELLULARCHOLESTEROLBYPREHDLIN
17、VOLVESPLASMAMEMBRANEMICROSOLUBILIZATIONJJLIPIDRES,1998,3910191819289SPARKSDL,MARCELYL,FRANKPG,ETALIMPORTANCEOFCENTRALHELICESOFHUMANAPOLIPOPROTEINAIINTHEMATURATIONOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINSJBIOCHEMISTRY,1998,3739139021390910PUSSINENPJ,JAUHIAINENM,METSOJ,ETALBINDINGOFPHOSPHOLIPIDTRANSFERPROTEINPLTPTOAP
18、OLIPOPROTEINSAIANDAIILOCATIONOFAPLTPBINDINGDOMAININTHEAMINOTERMINALREGIONOFAPOAIJJLIPIDRES,1998,39115216111WILLIAMSDL,THUAHNAIST,CONNELLYMA,ETALBINDINGANDCROSSLINKINGSTUDIESSHOWTHATSCAVENGERRECEPTORBIINTERACTSWITHMULTIPLESITESINAPOLIPOPROTEINAIANDIDENTIFYTHECLASSAAMPHIPATHICALPHAHELIXASARECOGNITIONM
19、OTIFJJBIOLCHEM,2000,27525188971890412NAVABM,VANLENTENBJ,REDDYST,ETA1HIGHDENSITYLIPOPROTEINANDTHEDYNAMICSOFATHEROSCIEROTICLESIONSJCIRCULATION,2001,104202386238713RONGJX,LIJ,REISED,ETA1ELEVATINGHIGHDENSITYLIPOPROTEINCHOLESTEROLINAPOLIPOPROTEINEDEFICIENTMICEREMODELSADVANCEDATHEROSCLEROTICLESIONSBYDECRE
20、ASINGMACROPHAGEANDINCREASINGSMOOTHMUSCLECELLCONTENTJCIRCULATION,2001,104202447245214LINGINSIGHTSOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINAPOLIPOPROTEINMEDIATEDLIPIDEFFLUXFROMCELLSJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2002,291472773115SHAULPWENDOTHELIALNITRICOXIDESYNTHASE,CAVEOLAEANDTHEDEVELOPMENTOFATHEROSC1EMSISJJPHYSIOL,2003,54
21、7PT1213316PATSCHJRTRIGLYCERIDERICHLIPOPROTEINSANDATHEROSCLEROSISJATHEROSCLEROSIS,1994,11023一2617谭虹,金鑫载脂蛋白A1与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系J实用临床医学,2010,115273118莫蔚林糖尿病血脂异常与调脂治疗J安徽医学，200425（2），15515719赵水平糖尿病血脂异常及其治疗J中华内科杂志,2002,41535635820袁美玲,倪红兵2型糖尿病载脂蛋白APOAI、APOB100检测的临床研究J，南通医学院学报,2009,29（6）43243321成车,朱传琳丙型肝炎病毒感染
22、慢性化的分子生物学机制J国外医学病毒学分册,2000,71293222邓子德,庚惠鸿,何达秋丙型肝炎病毒感染与脂肪肝的关系J新医学,1996,27947147223张健,成军,李莉丙型肝炎病毒感染者血清载脂蛋白AI及AII水平的研究J世界华人消化杂志,2002,1091015101724SOARDOG,PIRISIM,FONDAM,ETALCHANGESINBLOODLIPIDCOMPOSITIONANDRESPONSETOINTERFERONTREATMENTINCHRONICHEPATITISCJJINTERFERONCYTOKINERES,1995,15870571225NAEEMM,B
23、ACONBR,MISTRYB,ETALCHANGESINSERUMLIPOPMTEINPROFILEDURINGINTERFERONTHERAPYINCHRONICHEPATITISCJAMJGASTROENTEROL,2001,9682468247226邹阳春,胡大一,杨新春,等国人载脂蛋白A1基因多态性与血脂水平及冠心病的关系J中国动脉硬化杂志,2003,114345348毕业论文文献综述生物工程APOAI基因的研究进展摘要APOAI是细胞胆固醇逆向转运的特殊重要因素，它能与磷脂、细胞受体及多种血浆因子结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，对细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢
24、有促进作用。因此，本文对APOAI基因的结构和功能的研究进展进行概述。关键词载脂蛋白载脂蛋白基因冠心病糖尿病胆固醇APOAI是高密度脂蛋白HDL的主要组成蛋白，APOAI主要由肝脏合成，小肠也可合成，占高密度脂蛋白胆固醇（HDLCHOL）总蛋白的6070，APOAI的测定可直接反映HDLCHOL的水平。大量的研究已证明，APOAI在血清中的浓度与冠心病及动脉粥样硬化等疾病都存在某种关系MACIEJKOJJ，HOLMESDR，KOTTKEBA，等，1983；KOTTKEBA，ZINSMEISTERAR，HOLMESDRJR，等，1986。因此关于APOAI的研究巳逐渐成为冠心病等医学研究领域的重
25、要课题。1、APOAI的结构11APOAI的一级结构APOAI是一条由243个氨基酸残基构成的多肽链。BREWER等人（BREWERHB，1978）早在1978年就测定了APOAI的一级结构。APOAI分子中含有较多的极性氨基酸，不含有半胱氨酸和异亮氨酸，并且在APOAI分子中有许多由22个氨基酸残基形成的重复序列，这些序列都多以脯氨酸作为第一个氨基酸（徐勇霞，付明德，2002）。每一个重复均可形成双性螺旋（AMPHIPATHICHELIX，AH）结构。被称为脂质结合区。12APOAI的空间结构APOA1分子中的重复序列可以形成双性螺旋的结构。由于一级结构中极性氨基酸残基多以相反离子对的形式排
26、列，非极性氨基酸残基分布在极性氨基酸残基的周围。APOAI在水溶液中呈扁长的椭球形。肽链的N端由4个A螺旋形成一个螺旋束。螺旋束是未与脂质结合的APOAI结构稳定性及水溶性的主要因素。肽链的C端只有少量的螺旋，主要是无序的结构（DAVIDSONWS，WILLIAMWM，HAZIETTT，等，1996）。APOAI与磷脂结合后，C端的螺旋含量显著增加，并成为稳定APOAI分子的主要区域，N端的螺旋也相应发生重排，但总的含量不会改变DAVIDSONWS，1999。MARCEL及其同事（BREWERHB，BRONZERTTJ，HOUSERA，1995）利用抗原决定簇图谱发现，APOAI分子的N端和中
27、心区域存在许多不连续的抗原决定簇，说明肽链的中心区域和N端在二级结构上非常接近。APOAI三级结构的研究主要是是两分子APOAI与脂质结合后形成的新生盘状HDL，目前认为主要有两种模型（1）栅栏模型，APOAI环绕盘状脂质分子，其分子内8个螺旋反向平行排列；（2）带状模型。APOAI环绕盘状分子边缘，螺旋旋垂直于磷脂酰基链。2、APOAI的生物学功能21APOAI与细胞胆固醇的移出细胞胆固醇的移出可以通过扩散、特异性位点结合、非特异性位点结合3种方式。扩散途径是以胆固醇浓度差作为动力、胆固醇从细胞膜上脱离，通过扩散作用与球形HDL结合。特异性结合是指在前HDL中，APOAI分子中的双性A螺旋并
28、未完全与磷脂结合，而可以与细胞膜上特殊的脂表面或者特异性的蛋白受体作用，从而使细胞膜上胆固醇和磷脂同时溶解移出GILLOTTEKL，PHILLIPSMC，DAVIDSONWS，等，1998。DAVIDSONWS等DAVIDSONWS，JOHNSONWJ，ANANTHARAMAIAHGM，等，1994利用人工合成APOAI肽段研究发现，APOAI能与细胞膜上双层磷脂发生短暂作用，破坏细胞膜上磷脂与胆固醇的结合，使胆固醇从细胞膜上解离的更容易。这种结合不需要特异性位点的参与，称之为非特异性的结合。22APOAI与LCAT的激活LCAT介导盘状HDL即PREHDL中胆固醇的酯化形成球状HDL。研究表
29、明PREHDL是胆固醇良好的接受体（VONECKARDSTEINETAL，2000）。LCAT可催化新生HDL表层的胆固醇酯化，而APOAI是LCAT的激活剂，新生HDL在LCAT、APOAI及其它转运蛋白的参与下变为成熟的HDL。23APOAI与其它血浆园子的结合与CETP相互作用将CE呈递给VLDL或LDL。成熟的球状HDL胆固醇的酯化能力降低，CETP通过其C端的螺旋将HDL中的CE呈递给CM残粒、VLDL及LDL，CM及VLDL表面的PL则向HDL转移。PUSSIEN等PUSSINENPJ，JAUHIAINENM，METSOJ，等，1998发现，APOAI的N一端能与PLTP结合，结合
30、的区域限定在APOAI分子的残基27141之间。另外，APOAI能与肝细胞膜表面的清道夫受体BISRBI，介导HDL中的胆固酵酯的转移。WILLIAMS等（WILLIAMSDL，THUAHNAIST，CONNELLYMA，等，2000）研究发现APOAI分子C端及N端的A类螺旋是SRBI识别的位点。最近提出，当HDL与SRBI结合后，HDL中的胆固醇酯通过非水相的通道转移到肝细胞膜上。另一方面，APOAI可与VLDL结合，从而减少HL与VLDL的结合，APOAI又可抑制HI对极低密度脂蛋白VLDL的水解作用。3、APOAI的医学功能31APOAI与冠状动脉粥样硬化性心脏病疾病的关系APOAI在
31、脂蛋白代谢中具有重要的生理功能，能激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类，构成并稳定脂蛋白的结构。载脂蛋白A1是高密度脂蛋白HDL与细胞膜上的HDL受体结合的载体，同时具有维持HDL的结构，并参与胆固醇逆转的抗动脉粥样硬化因子。许多研究表明，HDL对动脉血管壁有直接的保护作用（ENAVABM，VANLENTENBJ，REDDYST，等，2000），并能使动脉粥样硬化病变消退（RONGJX，LIJ，REISED，等，2001）。目前认为HDL抗动脉粥样硬化作用的一个重要机制就是它介导了胆固醇的逆转运（LING，2002）。HDL还能够调节内皮NO的生成和活性，改善血管内皮功能（SHAULPW，200
32、3）。因此，HDL胆固醇下降时动脉粥样硬化的危险性增加。载脂蛋白AI为HDL的主要蛋白质，载脂蛋白AI的含量反映了HDL的水平，后者有转运周围组织的胆固醇及肝脏进行代谢处理的抗动脉粥样硬化的功能。HDL胆固醇浓度增高可使血管壁减少与有致粥样硬化潜力颗粒的接触（PATSCHJR，1994），与冠心病的发病率呈逆相关。32APOAI与糖尿病的关系糖尿病是21世纪的常见病、多发病，严重威胁人类健康我国糖尿病的患病率迅速增长，其中90以上属II型糖尿病。糖尿病除糖代谢紊乱外，还有明显脂类代谢异常，大量国内外研究已证实，血脂代谢异常是糖尿病患者出现血管并发症的重要危险因素（莫蔚林，2004；赵水平，20
33、02）。袁美玲，倪红兵（袁美玲，倪红兵，2009将II型糖尿病组和正常对照组利用氧化酶法、直接一步法与比浊法，证明APOAI/APOB100比值的降低与合并血管并发症的发生呈负相关。他还认为定期对糖尿病患者检查血脂尤其是APOB100和APOAI/APOB100，作为糖尿病患者是否有心血管并发症的发生以及并发症严重程度的预测。33APOAI与丙型肝炎的关系丙型肝炎病毒HCV的感染，不仅能够引起急慢性病毒性肝炎，而且能够引起肝纤维化和肝细胞癌，严重危害人民的生命健康。HCV感染具有较高的慢性化比例，有时高达80以上。我国目前一般人群的感染率达32，因而具有更大的危害性（成车，朱传琳，2000）。
34、不同的研究证明，感染HCV后患者发生脂肪变的几率在6080（邓子德，庚惠鸿，何达秋，1996），肝脏脂肪变的主要原因是脂肪代谢障碍。张健，成军等（张健，成军，李莉，2002）对HCV阳性患者和健康者进行免疫比浊法、双试剂，得出HCV与APOAI及APOAII存在着密切联系，且影响其在血清中的代谢。GIORGIOETAL曾报道，应用仅一干扰素IFN一仅治疗丙型肝炎SOARDOG，PIRISIM，FONDAM，等，1995；NAEEMM，BACONBR，MISTRYB，等，2001，发现HCV受体可结合APOAI及APOAII，从而影响其功能。4、APOAI基因多态性的研究多态性是指在一个生物群体
35、中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性或基因多态性。APOAI基因突变可导致异常的APOAI蛋白质的合成。有些异常的APOAI影响HDL的代谢。已报道的阻碍APOAI合成的基因突变有重排、缺失、无义突变等方式。目前已发现至少有20种不同的APOAI结构基因的点突变导致氨基酸转换。邹阳春，胡大一等（邹阳春，胡大一，杨新春，等，2003）认为载脂蛋白A1基因M1及M2位点MSPI酶切长度多态性改变通过影响高密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋白A1血浆水平而与冠心病的发生发展存在着某种意义上的内在联系。参考文献1MACIEJKOJJ,HOLMESDR,KOTTKEBA,E
36、TALAPOLIPOPROTEINAIASAMARKEROFANGIOGRAPHICALLYASSESSEDCORONARYARTERYDISEASEJNENGLJMED,1983,30973853892KOTTKEBA,ZINSMEISTERAR,HOLMESDRJR,ETALAPOLIPOPROTEINSANDCORONARYARTERYDISEASEJMAYOCLINPROC,1986,6153133203BREWERHB,BRONZERTTJ,HOUSERA,ETALTHEAMINOACIDSEQUENCEOFHUMANAPOAI,ANAPOLIPOPROTEINISOLATEDFRO
37、MHIGHDENSITYLIPOPROTEINSJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,1978,8036236304徐勇霞,付明德,载脂蛋白AI结构与功能研究进展J国外医学分子生物学分册,2002,24162645DAVIDSONWS,WILLIAMWM,HAZIETTT,ETALTHEROLEOFAPOLIPOPROTEINAIDOMAINSINLIPIDBINDINGJPNAS,1996,932413605136106DAVIDSONWS,ARNVIGMCGUIREK,KENNEDYA,ETALSTRUCTURALORGANIZA
38、TIONOFTHENTERMINALDOMAINOFAPOLIPOPROTEINAISTUDIESOFTRYPTOPHANMUTANTSJBIOCHEMISTRY,1999,384314387143957DAVIDSONWS,JOHNSONWJ,ANANTHARAMAIAHGM,ETALTHEINFLUENCEOFAPOLIPOPROTEINSTRUCTUREONTHEEFFLUXOFCELLULARFREECHOLESTEROLTOHIGHDENSITYLIPOPROTEINJJBIOLCHEM,2010,2854231965319738GILLOTTEKL,PHILLIPSMC,DAVID
39、SONWS,ETALREMOVALOFCELLULARCHOLESTEROLBYPREHDLINVOLVESPLASMAMEMBRANEMICROSOLUBILIZATIONJJLIPIDRES,1998,3910191819289VONECKARDSTEINA,ASSMANNGPREVENTIONOFCORONARYHEARTDISEASEBYRAISINGOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINCHOLESTEROLJCURROPINLIPIDOL2000,11662763710PUSSINENPJ,JAUHIAINENM,METSOJ,ETALBINDINGOFPHOSPHOLI
40、PIDTRANSFERPROTEINPLTPTOAPOLIPOPROTEINSAIANDAIILOCATIONOFAPLTPBINDINGDOMAININTHEAMINOTERMINALREGIONOFAPOAIJJLIPIDRES,1998,39115216111WILLIAMSDL,THUAHNAIST,CONNELLYMA,ETALBINDINGANDCROSSLINKINGSTUDIESSHOWTHATSCAVENGERRECEPTORBIINTERACTSWITHMULTIPLESITESINAPOLIPOPROTEINAIANDIDENTIFYTHECLASSAAMPHIPATHI
41、CALPHAHELIXASARECOGNITIONMOTIFJJBIOLCHEM,2000,27525188971890412NAVABM,VANLENTENBJ,REDDYST,ETA1HIGHDENSITYLIPOPROTEINANDTHEDYNAMICSOFATHEROSCIEROTICLESIONSJCIRCULATION,2001,104202386238713RONGJX,LIJ,REISED,ETA1ELEVATINGHIGHDENSITYLIPOPROTEINCHOLESTEROLINAPOLIPOPROTEINEDEFICIENTMICEREMODELSADVANCEDATH
42、EROSCLEROTICLESIONSBYDECREASINGMACROPHAGEANDINCREASINGSMOOTHMUSCLECELLCONTENTJCIRCULATION,2001,104202447245214LINGINSIGHTSOFHIGHDENSITYLIPOPROTEINAPOLIPOPROTEINMEDIATEDLIPIDEFFLUXFROMCELLSJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2002,291472773115SHAULPWENDOTHELIALNITRICOXIDESYNTHASE,CAVEOLAEANDTHEDEVELOPMENTOFATHER
43、OSC1EMSISJJPHYSIOL,2003,547PT1213316PATSCHJRTRIGLYCERIDERICHLIPOPROTEINSANDATHEROSCLEROSISJATHEROSCLEROSIS,1994,110232617谭虹,金鑫载脂蛋白A1与冠状动脉粥样硬化性心脏病的关系J实用临床医学,2010,115273118莫蔚林糖尿病血脂异常与调脂治疗J安徽医学,2004252,15515719赵水平糖尿病血脂异常及其治疗J中华内科杂志,2002,41535635820袁美玲,倪红兵2型糖尿病载脂蛋白APOAI、APOB100检测的临床研究J,南通医学院学报,2009,2964
44、3243321成车,朱传琳丙型肝炎病毒感染慢性化的分子生物学机制J国外医学病毒学分册,2000,71293222邓子德,庚惠鸿,何达秋丙型肝炎病毒感染与脂肪肝的关系J新医学,1996,27947147223张健,成军,李莉丙型肝炎病毒感染者血清载脂蛋白AI及AII水平的研究J世界华人消化杂志,2002,1091015101724SOARDOG,PIRISIM,FONDAM,ETALCHANGESINBLOODLIPIDCOMPOSITIONANDRESPONSETOINTERFERONTREATMENTINCHRONICHEPATITISCJJINTERFERONCYTOKINERES,199
45、5,15870571225NAEEMM,BACONBR,MISTRYB,ETALCHANGESINSERUMLIPOPMTEINPROFILEDURINGINTERFERONTHERAPYINCHRONICHEPATITISCJAMJGASTROENTEROL,2001,9682468247226邹阳春,胡大一,杨新春,等国人载脂蛋白A1基因多态性与血脂水平及冠心病的关系J中国动脉硬化杂志,2003,114345348本科毕业设计（20届）香鱼APOAI原核表达及鉴定目录摘要（ABSTRACT）1引言12实验材料与方法221原料、仪器和试剂2211原料与试剂2212主要仪器4213主要试剂及其
46、配制422实验方法4221引物设计4222PCR产物切胶纯化4223原核表达载体的克隆4224感受态的制备5225转化与筛选克隆5226质粒提取5227重组质粒的鉴定6228APOAI基因的原核表达和检测63结果631APOAI的PCR扩增632目的片段的酶切结果733PET22B（）质粒的双酶切734重组质粒的检测835APOAI的原核表达检测与纯化94讨论95小结10参考文献11附录13摘要APOAI是高密度脂蛋白HDL的主要组成蛋白，它能与磷脂、多种血浆因子及细胞受体结合，可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移以及调节HDL代谢的作用。与哺乳类相比，多数鱼
47、类利用脂类作为能量来源，因此，血浆脂蛋白及其载脂蛋白在鱼类生命活动中具有重要功能。鱼类血浆脂蛋白以HDL含量最为丰富，APOAI是鱼类的先天免疫的效应因子。目的原核表达重组APOAI，为其基因功能研究奠定基础。方法以香鱼为模型，获得目的基因，经纯化、酶切后克隆到原核表达载体PET22B中，转化到大肠杆菌BL21PLYSE菌株，并对表达条件进行优化，利用SDSPAGE分析鉴定目的蛋白。结果构建了香鱼重组APOAI的原核表达载体，目的蛋白在大肠杆菌BL21PLYSE菌株中获得高表达。关键词APOAI；香鱼；原核表达ABSTRACTAPOAIISTHEMAJORCOMPONENTPROTEINOFH
48、IGHDENSITYLIPOPROTEINHDL,ITNOTONLYCANCOMBINEWITHPHOSPHOLIPIDS,AVARIETYOFPLASMAFACTORANDCELLRECEPTOR,BUTALSOCANACTIVATELECITHINCHOLESTEROLACYLTRANSFERASEITPLAYSANIMPORTANTROLEINTHEPROMOTIONOFCELLULARCHOLESTEROLPLAYSOUT,ESTERIFICATION,TRANSFER,ANDTHEROLEOFREGULATINGHDLMETABOLISMCOMPAREDWITHMAMMALS,MOS
49、TFISHUSELIPIDSASANENERGYSOURCE,THEREFORE,PLASMALIPOPROTEINANDAPOLIPOPROTEININFISHHASIMPORTANTFUNCTIONSINLIFEACTIVITIESAPOLIPOPROTEININHDLARETHEMOSTABUNDANTFISHPLASMALIPOPROTEINSAPOAIISTHEFISHINNATEIMMUNEEFFECTOROBJECTIVEPROKARYOTICEXPRESSIONOFRECOMBINANTAPOAILAYSTHEFOUNDATIONFORGENEFUNCTIONSTUDIESMETHODSUSEAYUASAMODELTOOBTAINTHETARGETGENE,THEPURIFIEDPCRPRODUCTWASCLONEDINTOTHEPROKARYOTICEXPRESSIONVECTORPET22BANDTRANSFORMEDINTOECOLIBL21PLYSESTRAINSANDTHENEXPRESSIONCONDITIONSWEREOPTIMIZEDUSINGSDSPAGEANALYSIS,THETARG
