1、本科毕业论文系列开题报告水产养殖诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性的影响一、选题的背景与意义乌鳢（OPHICEPHALUSARGUS），亦称黑鱼，属鲈形目，攀鲈亚目，鳢科，鳢属，体呈乌黑色，细长，前部圆筒状，后部侧扁，由背至腹颜色逐渐变浅，圆鳞。乌鳢分布极广，除西部高原地区外，从黑龙江至海南的河川、湖泊、水库、池塘等各种类型的水体皆产此鱼，国外产于朝鲜西、南部。乌鳢肉富含蛋白质、脂肪、18种氨基酸等，还含有人体必需的钙、磷、铁及多种维生素，营养丰富、肉味甘性温且骨刺少，有补脾、利水的药用功能，深受群众的欢迎。乌鳢是一种适应性强、对不良水温、水质及缺氧条件有较强耐受力的鱼类，在江河湖塘等自
2、然环境中很少发病。但随着乌鳢人工高密度养殖的发展，乌鳢各种疾病频频发生，特别是水霉病、腐皮病、腹水病、烂鳃病危害严重，诺卡氏菌病也在近几年流行起来，造成了很严重的经济损失。诺卡氏菌（NOCARDIA）为革兰氏阳性菌，好氧，分类上属细菌域，厚壁菌门，放线菌纲，放线菌目，诺卡氏菌科。菌体呈长或短杆状,或细长分枝状，常断裂成杆状至球状体，基丝发达，呈分枝状，气丝较少。鱼类诺卡氏菌病于1963年在全球首次报告，确认于阿根廷热带养殖的虹彩脂鱼（HYPHESSOBRYCONINNESI）（杜佳根2007）。随后此病又陆续发生在虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）、黄尾鰤（SERIOLALALAND
3、I）、乌鳢、大西洋牡蛎（CRASSOSTREAGIGAS）、大口鲈（MICROPTERUSSALMOIDES）和海鲈（LATEOLABRAXJAPONICUS）等水产养殖动物中，曾影响日本、美国、澳大利亚、加拿大等地的水产养殖业，造成很大经济损失（袁思平2006）。该病曾是日本水产养殖中最主要的水产动物疾病之一,也是大西洋牡蛎养殖的主要疾病。而该病近年来对我国台湾水产养殖业也产生了较大影响，先后在乌鳢、大口鲈和海鲈等养殖鱼类中发生此病。我国大陆是2006年首次在养殖大黄鱼中发现诺卡氏菌病（王国良2006）。肽聚糖PEPTIDOGLYCAN又称粘肽、胞壁质或粘质复合物，由双糖单位，四肽尾还有肽桥
4、聚合而成，是N乙酰葡萄糖胺（NAG）和N乙酰胞壁酸（NAMA）交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的多层网状大分子结构。其是一种多糖与氨基酸相连的多糖复合物，由于此复合物中氨基酸链不像蛋白质中的那样长，故称肽聚糖。肽聚糖是许多细菌细胞壁的主要成分，不同的肽聚糖中出现的氨基酸数是有限的，亚肽单位及间肽桥上氨基酸的组成及排列上的不同，决定了肽聚糖种类的多样性和致中1992。近年来的大量的研究结果表明，肽聚糖具有包括佐剂活性在内的多种生物活性。肽聚糖能对免疫系统产生不同的免疫调节作用，能够增强机体免疫能力，是一种免疫系统的免疫增强剂。肽聚糖能够刺激B、T淋巴细胞，增强体液免疫和细胞免疫，激活单
5、核细胞及多核白细胞的吞噬活性，活化补体闻玉梅等1992，其分子中的多糖成分还具有抗肿瘤，抗感染能力（TAKASHI1994）。在水产养殖中投喂肽聚糖后发现，其能显著提高水产动物如五条鰤（TTAMI1996）、斑节对虾（SITDHIBOONYARATPALIN1995）、日本对虾（ITAMI1998）等抗病力和成活率。因此，使用肽聚糖有利于解决水产养殖中大量使用抗生素药物防治病害所表现出的生物抗药性问题及食品的药物残留问题。本实验通过对乌鳢人工注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物，研究其对乌鳢免疫活性指标的影响，为乌鳢诺卡氏菌病的防治提供理论参考。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容1诺卡
6、氏菌细胞壁肽聚糖的分离提取。2通过腹腔注射的方式，对乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物，研究其对乌鳢免疫活性指标的影响。拟解决的主要问题1诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的提取方法。2乌鳢免疫活性指标的筛选及测定方法的建立。三、研究的方法与技术路线研究的方法1试验用鱼乌鳢2试验用菌鰤鱼诺卡氏菌NACARDIASERIOLEA3试剂与药品三氯乙酸（TCA）、胰蛋白酶磷酸缓冲液3MG/ML胰蛋白酶、01MOL/L磷酸缓冲液、PH80、肝素钠、生理盐水、白细胞稀释液（冰醋酸15ML、1龙胆紫1ML、蒸馏水975ML）、溶壁微球菌MICROCROCOCCUSLYSODEIKTICUS、红细胞稀释液（NACL05G
7、、硫酸钠25G、氯化汞025G、蒸馏水加至100ML）、溶壁微球菌营养琼脂培养基（牛肉浸膏15G、蛋白胨25G、NACL40G、琼脂75G、蒸馏水500ML、PH74）、丙酮、乙醚等。4主要器材玻璃缸、注射器、生化自动分析仪、离心机、显微镜等5实验方法51诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物的制备参考宋晓玲等（2005）改进的PARK法。取离心洗涤得到的诺卡氏菌湿菌20G，悬浮于200ML10三氯乙酸TCA溶液中，沸水浴20MIN以裂解菌体；冷却后，12万R/MIN离心15MIN，收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，蒸馏水洗涤沉淀3次；沉淀溶于胰蛋白酶磷酸缓冲液3MG/ML胰蛋白酶；01MOL/L磷酸缓冲液；P
8、H80中，37水浴振荡3H，以3000R/MIN转速离心5MIN，弃去未溶解的胰蛋白酶沉淀。上清液12万R/MIN离心15MIN，沉淀用蒸馏水洗2次，加入乙醚除脂类物质12万R/MIN离心15MIN，70干燥脱水后，即得淡褐色胶质肽聚糖提取物。最后，将制备的肽聚糖干燥物用生理盐水配成1浓度的溶液，高温高压灭菌20MIN后备用。52腹腔注射与血样采集试验分对照组和试验组，每组50尾鱼。试验组腹腔注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物每尾03ML，对照组以同量无菌生理盐水注射。注射后分别于24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H时尾静脉取血液样本，每时间点每组取5尾鱼，实验重复2次。用
9、肝素钠作为血液抗凝剂，臀鳍尾端基部无鳞处穿刺抽血,取得全血，测定红细胞数量、脆性及白细胞数量等生理指标，当天完成测定；用5ML针筒尾静脉取血（不抗凝），全血制备血清，4静置过夜，吸出血清后3000R/MIN离心，用于溶菌酶等生化指标的测定。53溶壁微球菌粉末的制备将溶壁微球菌涂布于营养琼脂上，28下培养过夜，用无菌重蒸水将溶壁微球菌菌落从营养琼脂平板上洗下来，2500R/MIN离心15MIN，去上清，用4ML丙酮洗涤后，2500R/MIN离心3MIN，去上清，重复2次，再用4ML乙醚洗涤，2500R/MIN离心3MIN，重复1次，把溶壁微球菌从离心管中取出，放到研钵中，于28下干燥3H，把结块
10、的细菌磨成粉末分装到小离心管中,4下保存备用。54免疫活性指标的测定541红细胞计数（RBC）用红细胞稀释液将血液稀释200倍，用NEUBARNER计数板在显微镜下计数。542白细胞计数（WBC）用TRK稀释液将血液稀释200倍，用NEUBARNER计数板在显微镜下计数。543红细胞脆性EOB将血液滴入浓度为020048梯度为002的NACL溶液，以完全溶血的NACL浓度作为红细胞最大抵抗值。544溶菌酶活力测定主要根据简纪常的方法进行。用0067MOL/LPBSPH64将溶壁微球菌配成02MG/ML的菌悬液，每个样品取3ML菌悬液，吸取40L血清加入到3ML菌悬液中，混匀后立刻在540NM下
11、测定A0值。然后在28水浴中温浴30MIN，取出后置于4冰浴中以终止反应，再测定A值，按公式计算溶菌酶的活力UA0A/A。545血清酶类的测定碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶ACP、乳酸脱氢酶LDH等在生化自动分析仪上完成，具体方法根据说明书进行。5数据处理与分析利用统计软件SPSS130对试验结果进行分析。每个样品进行3次平行测试取平均值，所有数据分析均采用单因素方差分析ONEFACTORANALYSISOFVARIANCE和DUNCAN检验法。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年1月2010年4月1实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2仪器、药品的准备和各种实验材料的准备
12、。2010年5月2010年12月1诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的分离提取。2研究诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性指标的影响。3、翻译外文文献。查阅资料，完成开题报告和综述仪器、药品和各种实验材料的准备购得健康乌鳢（成体），暂养注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物分别于24H,48H,72H,96H,120H,144H,168H时间点采样红细胞计数红细胞脆性测定白细胞计数血清酶类的测定数据处理与分析撰写论文溶菌酶活力测定诺卡氏菌的培养诺卡氏菌细胞壁肽聚糖的提取论文答辩2011年1月2011年4月1、补充相关数据，整理试验结果；2、撰写论文初稿。3、论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献1陈晓耘鱼类的血液
13、J重庆师专学报,2000,19370732陈寅儿,金珊,王国良鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究J台湾海峡,2005,011041083陈国胜,谷欣,张想竹细菌肽聚糖及其应用安阳工学院学报200736384杜佳根鱼类诺卡氏菌病危害状况与研究进展辽宁省大连市大连水产学院,2007527315和致中1992细菌细胞壁肽聚糖的分类微生物学通报,1931741796金珊,蔡完其,王国良,等养殖大黄鱼细菌性疾病的病原研究J浙江海洋学院学报,2002,2132252317金珊,王国良,赵青松,等鲈细菌性类结节病的病原及血液病理研究J水产学报,2004,067037088金珊,王国良,赵青松,等加州鲈白云
14、病的病原及血液病理的初步研究J水生生物学报,2005,021841889李懋,黄二春,魏于生,等淡水鲳六项血液指标的测定及血细胞结构的显微观察J淡水渔业,1992,3202310林光华鲤鱼血液的研究J动物学报,1979,0921021911米瑞芙,陶烦春,王晓梅,等鲢败血症血液生理指标的变化J淡水渔业,1993,234161912米瑞芙草鱼、鲤和鲢血液学指标的测定J淡水渔业,19824101613梅广海,朱永生,曹格,等越冬罗非鱼细菌性类结节病的初步研究J水产科学,2002,21491114庞启华,黄文芳,谢凤丰产鲫细菌性败血症的血液病理变化J应用与环境生物学报,200410331531715
15、宋晓玲,杨旭彤,偲翰文,等双歧杆菌细胞壁肽聚糖的分离及其对两种海产动物免疫活性的影响J水产学报2005,29335035316闻玉梅,陆德源现代微生物学第2版,上海上海医科大学出版社,19921217邢维贤,安利国,傅荣恕鲤鱼竖鳞病的血液病理学研究山东师大学报自然科学版199612848618余毅,吴宝华白鲢疯狂病血液的研究A中国水产学会第四次全国会员代表大会暨学术年会论文集C1988,20020319袁思平,王国良,金珊养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展J微生物学通报,2006,0213714120周玉,郭文场,杨振国,等鱼类血液指标研究的进展J上海水产大学学报,2001,10216316521周
16、玉,郭文场,杨振国,等欧洲鳗鲡”狂游病”血液生化指标研究J水生生物学报,2002,26331431622TAKASHIS,FUKAMIS,SHIGEONAMIOKAEHANCEDRESISTANCEOFMICETOESCHERIEHIACOLIINFECTIONINDUCEDBYADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIDOAOTERIUNTHERMOPHYLUMJVETMEDICALSCI,19945643323ITAMIT,KONDOMUOZUMETALENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEAGAINSTENTEROCOCCU
17、SSERIOLICIDAINFECTIONINYELLOWTAILSERIOLAQUINQUERADIATATEMMINCKANDSCHLEGELBYORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJJFISHDIS19961918518724ITAMIT,MASAYAAENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEOFKURUMASHRIMP,PENAEUSJAPONICUSAFTERORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLICANDERIVEDFROMBIFIDOB
18、ACTERIUMTHERMOPHILUMJAQUACUTURE。199816427728825SITDHIB,MALIBEFFECTSOFPEPTIDOGLYCANPGONGROWTH,SURVIVAL,IMMUNERESPONSEANDTOLERANCETOSTRESSINBLACKTIGERSHRIMP,PENAEUSMONODONJDISEASESINASIANAQUACULTUREII1995469477毕业论文文献综述水产养殖鱼类血液指标的主要功能及研究概况摘要血液是具有活体组织所固有特性的一种结缔组织，承担着体内运输、防御、免疫、体液调节及维持内环境相对稳定的功能。当鱼体受到病菌感
19、染而引起疾病并发生生理或病理变化时,必定会引起其血液生理生化指标的变化。本文综述了鱼类的主要血液指标、功能及疾病、免疫增强剂等因素对鱼类血液指标的影响，以期为鱼类疾病致病机理及免疫防病的研究提供理论参考。关键词鱼类；血液指标；疾病；免疫增强剂血液是具有活体组织所固有特性的一种结缔组织，承担着体内运输、防御、免疫、体液调节及维持内环境相对稳定的功能。其主要的成分为血浆、血细胞。血液中含有各种营养成分，如无机盐、氧、以及细胞代谢产物、激素、酶和抗体等，有营养组织、调节器官活动和防御有害物质的作用1。一般情况下，血液的调节能力是不强的，有时它的组成和结构也会发生相应的变化，而这种变化通常是病理性的。
20、当鱼体受到病菌感染而引起疾病并发生生理或病理变化时，必定与其血液生理生化指标变化有密切的关系2。因此，动物血液的各项生理生化指标被广泛应用于评价鱼类的健康与否、营养状况及对环境的适应程度。1鱼类血液的主要生理生化指标及其功能11鱼类血液的主要生理指标及其功能鱼类血液生理指标主要有红细胞数RBC、白细胞数WBC、血红蛋白HB、红细胞比容HCT、红细胞沉降率ESR、红细胞脆性EOB等。红细胞也称红血球，是血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介。血红蛋白是脊椎动物红血细胞的一种含铁的复合变构蛋白，由血红素和珠蛋白结合而成，其功能是运输氧和二氧化碳，维持血液酸碱
21、平衡。红细胞数量、血红蛋白含量是与机体呼吸和供氧状况紧密有关的指标3，当鱼体受到病菌感染后，其正常生理活动发生紊乱，其红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞比容等都会发生明显的变化。鱼类白细胞数量及形态变化，也在一定程度上反映其造血机能及疾病的情况。当病原人侵机体时，刺激造血机能和体液防御机能相对增强，白细胞数相对增加，其中的颗粒细胞和单核细胞增加明显。而当疾病进人后期，鱼体造血机能和体液防御机能就会相应减弱，此时的白细胞数量也随之减少，并呈老化现象。红细胞沉降率是指红细胞在一定条件下的沉降速度。一般情况下，健康机体的血沉数值波动于一个较狭窄范围内，但在许多病理情况下，血沉就会明显下降。红细胞脆性是
22、指引起红细胞全部溶血的NACL浓度，一般而言，新生红细胞脆性较衰老红细胞脆性小，血红蛋白含量越高，红细胞脆性越小4。12鱼类血液的主要生化指标及其功能鱼类血液生化指标主要有谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、乳酸脱氢酶LDH、总蛋白TP、尿素BUN、肌酐CR、总胆固醇CHO、血糖GLU，溶菌酶活性以及K、NA、CL等。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶等血清酶类主要分布于机体的肝、肾、肌肉等组织细胞中，在正常情况下血清中这些酶活性低且相对恒定，并参与和控制机体内糖、蛋白质和脂肪等物质的代谢。当鱼感染疾病后，血清中这些酶类的活性就会大大增强，预示机体的肝、肾、肌肉等主要器官组织细胞发生病变，细胞
23、内酶释出。总蛋白即血清总蛋白，是血清固体成分中含量最多的物质，主要是由肝脏合成的；总胆固醇是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，包括游离胆固醇和胆固醇酯，肝脏也是其合成和贮存的主要器官；而血糖在血清中的含量也与肝脏密切相关。因此，总蛋白、总胆固醇和血糖都是反映肝脏功能的重要指标。MARJA等5研究表明，在一定程度上，血浆中溶菌酶活性变化与循环系统中白细胞数目变化相一致，白细胞数目多，溶菌酶活性就增加，两者正相关。尿素、肌酐、K、NA、CL等的含量则是肾功能的参考指标3,6,7。肾功能的衰竭，肾单位滤过与重吸收功能的失调会引起它们的显著变化。2疾病对鱼类血液指标的影响国内外学者对鱼类血液学的研究
24、做了很多工作。众多的研究资料表明，鱼类的血液学指标值与鱼的种类、生活环境、营养、性别、健康状况、疾病种类等有关2,3,8。如一些学者观察到饥饿时鱼类血液中红细胞数量会减少911，林光华9曾报道饥饿时红细胞大小的变化，许多学者都发现鱼类红细胞数随季节变化明显等1214。余毅15及米瑞芙16等的研究表明，患疯狂病的鲢其TP和UGLU明显降低，而患败血症鲢其TP、ALB明显降低，BUN、肌酸酐CREA、P、谷草转氨酶GOT等显著升高，球蛋白GLB、GPT、甘油三酯TG、ACHE的差异不显著；患败血症和狂游症的鲢白细胞数目都明显增多，血浆中K、CL离子也均明显增高。陈福华等17关于赤点石斑鱼增生性肾脏
25、病的研究认为，当病原人侵鱼体时，刺激造血机能和体液防御机能相对增强，白细胞数会相对增加；而当疾病进入后期，造血机能和体液防御机能也相应减弱，此时的白细胞数量会随之减少。朱心玲等18研究患出血病的草鱼表明，白蛋白和胆固醇的变化在潜伏期和发展期并不相同，白蛋白在潜伏期为显著的增加，而在发展期为明显的降低；胆固醇在潜伏期无变化，而到发展期则急剧地下降。张永嘉等19认为肝脏是鱼体合成蛋白质的重要场所，肝细胞受损意味着蛋白质含量的下降尤其是白蛋白降低更为显著，但周玉等6的欧洲鳗鲡”狂游病”研究以及陈寅儿等20鲈鱼溶藻弧菌病研究结果截然不同，其TP、ALB、A/G值都有升高的趋势，他们认为这与肝脏组织受损
26、有关，导致血清中酶含量的迅速上升。此外，邢维贤21、金珊4以及庞启华22等也分别进行了鲤鱼竖鳞病、鲈细菌性结节病、丰产鲫细菌性败血病等的血液病理研究，结果均表明疾病会引起血液指标的显著变化。3免疫增强剂对鱼类血液指标的影响免疫增强剂，是一类通过不同方式达到增强机体免疫力的免疫治疗药物，如增强吞噬细胞的功能、提高细胞免疫或促进体液免疫功能等。免疫增强剂按其作用分为免疫佐剂、免疫恢复剂和免疫替代剂23。国内外关于鱼类免疫增强剂的研究报道很多，目前研究报道过的免疫增强剂主要有左旋咪唑、FK565、MDP、葡聚糖、肽聚糖，脂多糖、寡糖、甲壳质、甲壳胺、VC以及VE等24。研究表明，免疫增强剂能引起鱼类
27、血液指标的变化，通过作用于鱼体非特异性免疫因子来提高鱼类的抗病力。如刘云等25报道了免疫增强剂（甲壳胺）能提高血液中白细胞数量和吞噬能力，增强鲫鱼血清中酚氧化酶的活性，且对鲫鱼的生长无明显影响。邓时铭等26证实了蛭弧菌微生态制剂在鲫鱼体内主要对头肾产生显著作用，能提高鲫鱼的非特异性免疫。刘勇等27研究发现免疫增强剂可使河鲫鱼血液中白细胞吞噬活性、血清和体液粘液的溶菌酶活性显著提高。陈昌福等28研究表明,在饲料中添加适量的免疫多糖酵母细胞壁能够增强异育银鲫非特异性免疫功能，试验组异育银鲫白细胞吞噬活性均显著高于对照组。4展望随着集约化养殖技术的应用，养殖规模突飞猛进，然而制约养殖生产的问题也日益
28、突出。水环境污染、高密度养殖等不可避免地影响养殖鱼类的健康，使其感染疾病的机率大大提高，导致养殖病害频繁发生，造成了巨大的经济损失。目前，通过提高水产动物免疫力来抵抗疾病的发生已成为研究热点。抗生素及化学药品的使用会使鱼类疾病的病原生物抗药性增强，并对生态环境造成污染，因此，深入研究水产动物免疫机理以及通过使用合适的免疫增强剂来增强养殖鱼类免疫防御力，将会是鱼类病害防治研究的趋势。参考文献1陈晓耘鱼类的血液J重庆师专学报,2000,19370732卓孝磊,梁日深,梁桂洪,等月鳢、乌鳢和斑鳢血液指标、血细胞比较分析J科技导报2008,261385873周玉,郭文场,杨振国,等鱼类血液学指标研究的
29、进展J上海水产大学学报,2001,1021631654金珊,王国良,赵青松,等鲈细菌性类结节病的病原及血液病理研究J水产学报,2004,2867037085MARJAM,ANTTISCHANGESINPLASMALYSOZYMEANDBLOODLEUCOCYTELEVELSOFHATCHERYREAREDATLANTICSALMONANDSEATROUTDURINGPARRSMOLTTRANSFORMATIONJAQUACULTURE,1992,10675876周玉,郭文场,杨振国,等欧洲鳗鲡”狂游病”血液生化指标研究J水生生物学报,2002,2633143167尾崎久雄鱼类血液与循环生理M上
30、海上海科学技术出版社,198259,7492,898袁仕取,张永安,姚卫建,等鳜鱼外周血细胞显微和亚显微结构的观察J水生生物学报,1998,22139459林光华鲤鱼血液的研究J动物学报,1979,25921021910米瑞芙草鱼、鲤和鲢血液学指标的测定J淡水渔业,19824101611罗贯一黄鳝血液的实验鱼类学论文集第三辑M科学出版社1983697512沈晓民,华苒团头鲂九项血液学指标的正常值J动物学杂志,1990,2513613朱心玲,贾丽珠,张明瑛草鱼血液学的研究I九项血液常数的周年变化J水生生物学报,1991,9324825614林光华,张丰旺,翁世聪草鱼血液的研究J动物学报,1985
31、,31433634315余毅,吴宝华白鲢疯狂病血液的研究A中国水产学会第四次全国会员代表大会暨学术年会论文集C1988,20020316米瑞芙,陶烦春,王晓梅,等鲢败血症血液生理指标的变化J淡水渔业,1993,234161917陈福华,陈毕生,杨莺莺,等赤点石斑鱼增生性肾脏病的血液病理观察J热带海洋,1997,163495318朱心玲,贾丽珠,张明瑛草鱼出血病潜伏期和发展期的血液病理研究J水生生物学报,1987,111596619张永嘉,吴泽阳,许其爵,等网箱养殖罗非鱼综合症的血清分析J水利渔业,1994,28,9,4720陈寅儿,金珊,王国良鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究J台湾海峡,2
32、005,24110410821邢维贤,安利国,傅荣恕鲤鱼竖鳞病的血液病理学研究J山东师大学报自然科学版,1996,114848622庞启华,黄文芳,谢凤丰产鲫细菌性败血症的血液病理变化J应用与环境生物学报,2004,10331531723谢少文中国医学百科全书免疫学M上海科学技术出版社1983373824MASAHIROSCURRENTRESEARCHSTATUSOFFISHIIMMUNOSTIMULANTSJAQUACULTURE,1999,172639225刘云,孙峰,王丹免疫增强剂对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J海洋科学,2004,289424526邓时铭,谬伏初,黄华伟,等蛭弧菌微生态制
33、剂对鲫非特异性免疫的影响J科学养鱼,2009,7545527刘勇,贾永红免疫增强剂对河鲫鱼白细胞吞噬和溶菌酶活性的影响J安徽农业科学2007,35111111328陈昌福,吴凡,熊传喜,等免疫多糖酵母细胞壁对受免异育银鲫免疫应答的调节作用J淡水渔业,2004,645557本科毕业设计（20_届）诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性的影响目录1引言162材料与方法1621材料17211实验菌种17212实验用鱼17213实验用水17214药品和试剂1722试验方法17221溶壁微球菌悬液的制备17222肽聚糖注射液的制备17223注射实验17224血清、血细胞样本的采集17225血细胞脆性（
34、EOB）的测定17226血细胞计数（RBS）17227溶菌酶活力的测定18228血液生化指标的测定1823数据分析183结果1831诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血液生理指标的影响18311诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞数量的影响18312诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响18313诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响1932诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血液生化指标的影响19321血清总蛋白TP20322血清白蛋白ALB20323碱性磷酸酶ALP21324尿素氮BUN21325乳酸脱氢酶LDH22326乳酸脱氢酶同工酶LDH1224讨论2341免疫多糖对水产动物血细胞数量和血细胞脆性
35、的影响2342免疫多糖对水产动物溶菌酶活力的影响2343免疫多糖对水产动物血清总蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影响2344免疫多糖对水产动物碱性磷酸酶（ALP）的影响2445免疫多糖对水产动物尿素氮（BUN）的影响2446免疫多糖对水产动物乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）的影响24致谢错误未定义书签。参考文献25摘要采用浓度为167MG/ML的鰤鱼诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢进行腹腔注射，于实验24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H时取其血液测定血细胞数目、血细胞脆性（EOB）、溶菌酶活力（LSZ）、血清总蛋白（TP）含量、血清白蛋白ALB含量
36、、碱性磷酸酶（ALP）活性、尿素氮（BUN）含量、乳酸脱氢酶（LDH）活性以及乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）等与乌鳢免疫力相关的血液生理指标和生化指标，结果表明鰤鱼诺卡氏菌细胞壁肽聚糖使乌鳢血细胞数目和血细胞脆性均有增加，但影响不显著（P005）；溶菌酶活力、血清总蛋白和血清白蛋白在48H时显著上升（P005LYSOZYMEACTIVITY,SERUMTOTALPROTEINANDSERUMALBUMINWASINCREASEDSIGNIFICANTLYINTHE48HP005）。图1肽聚糖对乌鳢血细胞数量的影响FIG1EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHEREDBLOODCEL
37、LCOUNTOFOPHICEPHALUSARGUS312诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后血细胞脆性的测定结果见图2。由图2可知，在实验48H后实验组乌鳢血细胞脆性比对照组均略有增大，但差异不显著（P005）。图2注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响FIG2EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHEBLOODCELLFRAGILITYOFOPHICEPHALUSARGUS313诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后，乌鳢血液溶菌酶活力的变化情况见图3。由图3可知，实验48H时实验组溶菌酶活力与对照组相比有
38、显著增强（P005）。图3注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响FIG3EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELYSOZYMEACTIVITYOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图4注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血清总蛋白TP的影响FIG4EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHESERUMTOTALPROTEINOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图5注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血清白蛋白ALB的影响FIG5EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTH
39、ESERUMALBUMINOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）323碱性磷酸酶ALP注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢碱性磷酸酶ALP活性的影响见图6。由图6可知，在实验时间内各实验组碱性磷酸酶ALP活性与对照组相比，均呈现上升趋势。在实验24H时，实验组碱性磷酸酶活性最大，实验24H、48H、96H、144H、168H时实验组与对照组差异显著（P005）。图8注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢乳酸脱氢酶LDH的影响FIG8EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELACTATEDEHYDROGENASEOFOPHICEPHALUSARGUS表
40、示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图9注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢乳酸脱氢酶同工酶LDH1的影响FIG9EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELACTATEDEHYDROGENASEISOENZYMEOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005），表明诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响不显著。42免疫多糖对水产动物溶菌酶活力的影响溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础,是一种碱性蛋白,可通过水解革兰氏阳性细菌细胞壁中的乙酰氨基多糖,破坏和消除侵入体内的异物,从而担负起机体防御的功能16。鱼类的特异性免疫系统并不完善,非特异性免疫在
41、鱼类免疫防御中具有重要作用,因此,溶菌酶是鱼类极为重要的非特异性免疫指标之一。郭玉娟等人的研究结果表明A_3肽聚糖显著提高了受免彭泽鲫血清及体表溶菌活力18；张春晓等人19发现在饲料中添加肽聚糖后，实验组大黄鱼血液白细胞吞噬活力和血清溶菌酶活力显著高于对照组；张璐等人的研究结果也证明了鲈鱼血清溶菌酶活力会随着饲料中肽聚糖添加量的升高而升高20。本实验通过对乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后的溶菌酶活力测定结果显示，实验组的溶菌酶活力在48H明显高于对照组，并存在显著性差异（P005），表明诺卡氏菌细胞壁肽聚糖能显著提高乌鳢血清溶菌酶活性，增强乌鳢的非特异性免疫力，但效果具有明显时效性，这与宋晓玲1
42、7等关于双歧杆菌细胞壁肽聚糖对牙鲆免疫活性影响的研究结果及许国焕21，22，23，24等关于酵母多糖、2葡聚糖、黄芪多糖的研究结果十分相似。43免疫多糖对水产动物血清总蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影响血清蛋白含量是衡量免疫力的一个重要指标。研究表明，血清总蛋白水平与血清溶菌酶水平密切相关，溶菌酶活性升高时，其血清蛋白含量也随之升高，机体对病原菌的抵抗力显著增强25,26,27。本实验的研究结果表明，乌鳢在注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后血清总蛋白（TP）的含量迅速增加，并均在第48H达到最大值，存在显著性差异（P005），但具有明显时效性，72H后便降至原来水平。这与赵红霞等人的研究结果相似
43、28，其研究表明在饲料中长期添加1,3葡聚糖使凡纳滨对虾体内血清总蛋白含量显著升高。另外，王红权等人也报道了草鱼在口服05的免疫增强剂壳聚糖40D后其体内血清总蛋白含量得到显著增加（P005）。鱼体血清白蛋白在各种生理活动中有重要作用，对维持鱼体足够血量及胶体渗透压有重要意义，是鱼体重要的免疫蛋白，与鱼体的抗病及环境适应能力有密切的关系，可以用来诊断鱼类健康、营养和疾病等状况，血清白蛋白含量的高低直接体现了鱼类免疫力的高低29。本实验的结果表明，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖同样对乌鳢血清白蛋白含量的增加有促进效果，且与血清总蛋白的变化趋势大致相同。肖明松等人对中华鳖的研究所描述的结果大致相同，即果寡糖
44、和糖萜素可以显著提高血清白蛋白的含量（P005）30。44免疫多糖对水产动物碱性磷酸酶（ALP）的影响碱性磷酸酶为磷酸单酯酶,广泛存在于各种动物体内,其作为一种重要的水解酶，不仅能催化磷酸单酯水解,还直接参与磷酸基团的转移,是动物体内重要的解毒体系,并且在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用同时碱性磷酸酶作为动物溶酶体酶的重要组成部分,在免疫反应中发挥作用31。碱性磷酸酶活性的提高，可以加速鱼类相应组织的物质代谢，为ADP磷酸化形成ATP提供所需的无机磷，积累更多的能量，从而促进生长，也间接增强了其非特异性免疫能力32。本实验的研究结果表明，诺卡
45、氏菌细胞壁肽聚糖能够显著提高乌鳢碱性磷酸酶活性（P005）。这与宋晓玲等人17在研究双歧杆菌细胞壁肽聚糖对日本对虾免疫活性影响时得出的结论相似经研究表明，肽聚糖可影响日本对虾血清的ALP活性和ACP活性,且两种作用趋势相近，96H内呈逐渐平缓上升的趋势，提高了日本对虾的非特异性免疫水平。另外，陈国福等33和王秀华等34分别给凡纳滨对虾和南美白对虾投喂肽聚糖后碱性磷酸酶活性均得到了提高。45免疫多糖对水产动物尿素氮（BUN）的影响血浆尿素氮可以较准确反映动物体内蛋白质的代谢情况和日粮氨基酸的平衡情况。蛋白质代谢良好时，血浆尿素浓度降低35。有报道认为血清尿素氮水平是衡量动物氨基酸需要的一个很灵敏
46、的参考指标，它是反映机体的营养状况及蛋白质代谢水平的指标，直接反映动物机体内蛋白质分解代谢水平36。因此，血清中尿素氮含量越低，说明机体蛋白质代谢越好。本研究结果显示，乌鳢经注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖，其体内尿素氮含量得到显著性降低（P005），说明乌鳢的代谢旺盛，暗示了其非特异性免疫水平的提高。类似结果也出现在肖明松等30用果寡糖与糖萜素投喂中华鳖的试验中，该研究表明，果寡糖和糖萜素作为免疫增强剂可以显著降低中华鳖血清中尿素氮的含量。46免疫多糖对水产动物乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）的影响乳酸脱氢酶及其同工酶是与能量代谢过程密切相关的酶。在无氧条件下，LDH催化丙酮酸还原
47、成乳酸,从而完成葡萄糖的无氧酵解过程；同时释放少量ATP分子，为缺氧状态下的机体生命活力提供一定的能量。本研究的结果显示，乳酸脱氢酶和乳酸脱氢酶同工酶1的活性在注射试验后未出现明显变化，但72H后均出现显著的升高（P005），但随后又降至正常水平。有关免疫增强剂对鱼类血清中乳酸脱氢酶及其同工酶的研究笔者尚未见相关报道。笔者认为，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖本身作为一种抗原，能刺激机体产生相应的抗体，并激活机体免疫调节作用，显著提高血液内各种酶的活性，增强代谢并消除抗原，进而增强了乌鳢的免疫水平。综上所述，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖能够显著提高乌鳢血清溶菌酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶及其同工酶1的活性，增加血清
48、总蛋白和白蛋白的含量，增强乌鳢的非特异性和特异性免疫应答水平，因此，肽聚糖作为一种新型的免疫增强剂，用来提高水产养殖动物免疫活性和抗细菌、病毒病感染，具有十分良好的应用前景。参考文献1杜佳根鱼类诺卡氏菌病危害状况与研究进展J辽宁省大连市大连水产学院,2007527312袁思平,王国良,金珊养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展J微生物学通报,2006,3321371413王国良,袁思平,金珊网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病的初步研究J水产学报,2006,3011031074和致中细菌细胞壁肽聚糖的分类J微生物学通报,19921931741795闻玉梅,陆德源现代微生物学M第2版上海上海医科大学出版社,19921
49、26TAKASHIS,FUKAMIS,SHIGEONAMIOKAEHANCEDRESISTANCEOFMICETOESCHERIEHIACOLIINFECTIONINDUCEDBYADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIDOAOTERIUNTHERMOPHYLUMJVETMEDICALSCI,1994,564337ITAMIT,KONDOM,UOZUMETALENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEAGAINSTENTEROCOCCUSSERIOLICIDAINFECTIONINYELLOWTAILSERIOLAQUINQUERADIATATEMMINCKANDSCHLEGELBYORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJJFISHDIS1996191851878SITDHIB,MALIBEFFECTSOFPEPTIDOGLYCANPGONGROWTH,SURVIVAL,IMMUNERESPONSEANDTOLERANCETOSTRESSINBLACKTIGERSHRIMP,PENAEUSMONODONJDISEASESINASIANAQUACULTUREII1995,4694779IT
