1、本科毕业论文系列开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫HSP90的分子鉴定一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，在日本，又名妃新贝尼登虫隶属于扁形动物门PLATYHELMINTHES，吸虫纲MONOGENEA，单后盘目MONOPISTHOEOTYLEA，分室科CAPSALIDAEBARID，1853，新贝尼登虫属NEOBENEDENIAYAMAGUTI,1963。世界上广为分布（热带和亚热带地区），在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、红甘鰺、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、腮或鼻腔等处，在5个目30多个科100多种鱼体上都有发现，显示出很低的宿主特异性
2、。该寄生虫常寄生在鱼类的体表、鳍和鳃丝等部位，虫体破坏鱼类粘液组织，大量吸取宿主血液，吞食宿主组织细胞，而且经常并发细菌感染，引起宿主鳃呼吸困难，体表大面积肌肉组织脱落，溃疡糜烂，病变部位多呈“火山口”状。虫体严重危害宿主生存，导致病鱼烦躁不安，食欲降低、厌食或拒食，不久即因衰竭而死亡。近年来，此寄生虫的病虫害在我国东南沿海一带频繁出现，影响十分严重，造成很大的经济损失，且危及沿海水产养殖业的发展。热休克蛋白HEATSHOCKPROTEINS，HSPS是机体在应激病毒感染、缺氧、紫外线照射等状态下，合成的一组高度保守的蛋白质分子，故又称为应激蛋白。广泛存在于原核和真核生物中，多以分子伴侣的形式
3、参与相关蛋白的折叠、装配、细胞内运输及蛋白质降解等过程。按照分子质量大小，可被分为六大家族，即HSP110104170KD、HSP908396KD、HSP706678KD、HSP605865KD、HSP403247KD、SHSP1028KD。HSP90是细胞内最活跃的分子伴侣之一，广泛参与细胞的信号转导、激素应答及转录调控过程，对细胞在生理、病理及应激条件下的生存发挥了重要作用。并且和肿瘤发生、微生物耐药性和动物发育等有关，成为当前研究的热点。本课题主要通过对梅氏新贝尼登虫的RNA提取，获取HSP90的基因序列，初步分析其特征和功能，并进行PCR实验以分析其HSP90的表达，为进一步弄清HSP
4、90的功能和寻找防治此类病虫害的方法提供理论基石。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题研究的内容（1）提取梅氏新贝尼登虫总的RNA，获得梅氏新贝尼登虫HSP90蛋白的基因序列；（2）进行HSP90基因序列的分析及进化树构建分析；（3）发育期间梅氏新贝尼登虫虫卵、钩毛蚴、成虫三个发育阶段HSP90的表达。拟解决的问题（1）获取梅氏新贝尼登虫的HSP90基因序列；（2）梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP90表达分析。三、研究方法和技术路线研究方法1）梅氏新贝尼登虫样品的采集本次课题中的实验用虫采集于宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体成虫采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸
5、泡病鱼后，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。虫卵采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，过滤海水浸洗后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。钩毛蚴将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海水的培养皿中，置于25人工智能气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约46天钩毛蚴逸出后收集于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。2）总RNA抽提利用RNAISO试剂提取梅氏新贝尼登虫总RN
6、A1将70保存的样品加入1MLRNAISO以下为加入1MLTRIZOL试剂标准，匀浆机匀浆。2匀浆后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN
7、。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD26
8、0/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3）CDNA文库的构建文库的构建包括逆转录成双链，接头连接，连接到特异性载体上，转化等。试验中所使用的技术和方法都比较成熟，可行性高。4）荧光定量PCR采用实时荧光定量PCR（QUANTITATIVEREALTIMEPCR，QRTPCR）来研究梅氏新贝尼登虫HSP90基因MRNA转录水平的变化。根据LIVAKLGTIAKSGT,AA97105IGQFGVGFYSAYLV
9、AD,AA121136IKLYVRRVFI,AA350359GVVDSEDLPLNISRE,AA176190以及C端为保守的MEEVD结构（图1），这与已知的物种HSP90基因结构一致。图4信号肽序列预测S每一个氨基酸对应一个S值C剪切位点值YYMAX综合考虑C值和S值的一个参数FIG4PREDICTIONOFSIGNATUREPEPTIDE34梅氏新贝尼登虫HSP90二级结构分析使用HTTP/WWWEXPASYORG网站的SECONDARYSTRUCTURETOOLS中SOPMA软件进行HSP90二级结构预测（图5）。HSP90二级结构预测显示，375个氨基酸参与形成螺旋（ALPHAHELI
10、X），占有所有氨基酸的5201，有105个氨基酸参与形成伸展链（EXTENDEDSTRAND），占有氨基酸的1456，有44个氨基酸参与形成转角,占总氨基酸的610，另有197个氨基酸参与形成无规则卷曲（RANDOMCOIL），占总氨基酸的2732。图5HSP90蛋白二级结构H表示螺旋，E表示延伸链，T表示转角，C表示无规则卷曲FIG5SECONDARYSTRUCTUREOFNMHSP9035NMHSP90基因系统进化树分析使用CLUSTALX软件和MEGA31软件，通过NEIGHORJOINING（NJ）的方法构建了HSP90基因的系统进化树（图6）。系统进化树以梅氏新贝尼登虫以及其他不同门
11、类物种的HSP90氨基酸序列作（表3）为分析对象。总共分为哺乳类、两栖类、爬行类、鸟类、甲壳纲动物、昆虫、轮虫、珊瑚虫类、星虫纲、甲壳类动物和扁形虫11个类别。梅氏新贝尼登虫与其他扁形虫（FLATWORM）成一个分支。进化树按种属间亲缘关系的远近分为几个分支。从图中可以看出，梅氏新本尼登虫在与同属类的日本血吸虫、曼氏吸虫的亲缘关系最近。MUSMUSCULUSAK146944SUSSCROFANM_213973MONODELPHISDOMESTICAXM_001367334DANIORERIONM_131328XENOPUSLAEVISNM_001093155ALLIGATORMISSISSIP
12、PIENSISAB306284GALLUSGALLUSNM_206959PORTUNUSTRITUBERCULATUSFJ392028TIGRIOPUSJAPONICUSEU306564APISMELLIFERAXM_395168BOMBYXMORINM_001043411DROSOPHILAMELANOGASTERNM_079175LIRIOMYZASATIVAEAY851368NEMATOSTELLAVECTENSISXM_001640639PHASCOLOSOMAESCULENTAGQ503177HALIOTISASININAEF621884DUGESIAJAPONICAFJ628362
13、NEOBENEDENIAMELLENIFN908508SCHISTOSOMAJAPONICUMAY815927SCHISTOSOMAMANSONIXM_002578372100PHILODINAROSEOLAEU432549ADINETAVAGAEU63701710010098100100100100791007988976489005FISHAMPHIBIAREPTILIAAVASCRUSTACEANINSECTROTATORIAANTHOZOASIPUNCULIDASHELLFISHFLATWORMDHSP90MAMMALIAN注分支节点的数字为表示置信度，重复次数为1000。标尺表示5的
14、核苷酸序列差异。梅氏新贝尼登虫HSP90用加粗字体加以标出。图6HSP90基因系统进化树FIG6PHYLOGENETICTREEOFHSP90表2HSP90系统进化树分析所用氨基酸序列TAB2AMINOACIDSEQUENCESUSEDINPHYLOGENETICTREEOFHSP90登录号物种AK146944小家鼠（MUSMUSCULUS）NM_213973野猪（SUSSCROFA）XM_001367334灰色短尾负鼠（MONODELPHISDOMESTICA）NM_1313128斑马鱼（DANIORERIO）NM_001093155爪蟾（XENOPUSLAEVIS）AB_306284密西西
15、比短吻鳄（ALLIGATORMISSISSIPPIENSIS）NM_206959FJ_392028EU_306564原鸡（GALLUSGALLUS）三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）日本虎斑猛水蚤（TIGRIOPUSJAPONICUS）XM_395165NM_001043411NM_079175AY851368EU432549EU637017XM_001640639GQ503177EF621884FJ628362FN908508AY815927XM_002578372意蜂（APISMELLIFERA）中国桑蚕（BOMBYXMORI）果蝇（DROSOPHILAMELAN
16、OGASTER）美洲斑潜蝇（LIRIOMYZASATIVAE）红眼旋轮虫（PHILODINAROSEOLA）漫游盘网轮虫（ADINETAVAGA）海葵（NEMATOSTELLAVECTENSIS）可口革囊星虫（PHASCOLOSOMAESCULENTA）耳鲍（HALIOTISASININA）东亚三角涡虫（DUGESIAJAPONICA）梅氏新贝尼登虫（NEOBENEDENIAMELLENI）日本血吸虫（SCHISTOSOMAJAPONICUM）曼氏血吸虫（SCHISTOSOMAMANSONI）36HSP90在梅氏新贝尼登虫不同发育时期的表达分析利用QRTPCR分析了梅氏新贝尼登虫HSP90在不
17、同发育时期虫卵、钩毛蚴、成虫的表达状况。根据LIVAKSCHMITTGEN（2001）提出的相对标准曲线法2CT对相对定量的结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫HSP90基因MRNA的相对表达量。各组间HSP90基因表达的差异用SPSS软件（130）中的单因素方差分析法（ONEWAYANOVA）进行分析，以P005为显著性差异。结果表明，HSP90在胚胎3个不同发育时期中均有表达，且伴随着胚胎发育，HSP90的表达量逐渐减少，在虫卵时表达量最多（图3所示）。表3NMHSP90基因在虫卵、钩毛蚴和成虫三个阶段的表达量（HSP90/28S）TAB3EXPRESSIONOFNMHSP90GENEDURI
18、NGTHEPERIODOFEGG,ONCOMIRACIDIUMANDADULT（HSP90/28S）EGGONCOMIRACIDIUMADULTHSP90001457864049300021372923853000063103165558001234439549800014904875088000099708215401001112539215300016423758110001219072801700136969643960002182201441500012190728017平均值00129363481350001863089286700010165648532标准误00015171937
19、667000034860026291000027750937546图7HSP90基因在虫卵、钩毛蚴和成虫三个阶段的表达差异FIG7DIFFERENTEXPRESSIONOFNMHSP90GENEDURINGTHEPERIODOFEGG,ONCOMIRACIDIUMANDADULT4讨论HSP90是一种组成型表达的蛋白，是细胞内一种重要的分子伴侣，也是HSP家族中为数不多的含有内含子的成员之一。HSP90主要功能是特异地与多种细胞功能蛋白如逆转录蛋白、甾体激素受体、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等结合而改变这些蛋白的功能状态。目前关于HSP90的研究较多，结果显示出在不同的生物，不同组织，不同发育时期，
20、其表达量和所起的功能都存在差异1117。但在梅氏新贝尼登虫中的研究目前未见报道，本试验通过文库测序的方法得到梅氏新贝尼登虫HSP90的CDNA序列，并通过QRTPCR探讨了不同发育时期HSP90表达的差异。梅氏新贝尼登虫HSP90基因2295BP的全长CDNA序列中，开放阅读框编码的721个氨基酸包含HSP90家族保守ATPASE结构（图2、3）。C末端一致序列MEEVD可被HOPHSP70ANDHSP90ORGANIZINGPROTEIN的TPRTETRATRICOPEPTIDEREPEATDOMAIN识别，进而与热休克蛋白70构成分子伴侣复合体。氨基酸序列相似性分析表明，梅氏新贝尼登虫HS
21、P90序列与其他已知物种的HSP90序列存在一定差异但高于60。基于NJ法构建的系统发生树进一步显示此序列与同属内物种HSP90序列相距较近，亲缘关系较近。此外，梅氏新贝尼登虫HSP90氨基酸序列N末端缺少HSP90亚型特有的磷酸化位点序列QTQDQ。这些结果表明，克隆所得到的梅氏新贝尼登虫HSP90CDNA序列为HSP90亚型。据文献，HSP90在动物胚胎发育过程中起着非常重要的作用。如HSP90通过激活转录因子MYOD参与肌肉发育18，HSP90则与神经系统、视网膜和骨的发育有关1920。在哺乳动物胚胎发育过程中，HSP90亚型可诱导滋养层分化、参与胎盘发育。利用基因敲除技术使小鼠胚胎的H
22、SP90基因失活，发现其胚胎出现异常生长，母体和胎儿间的物质交换被阻断21。但是在原生动物中，对HSP90的研究仍处于探索阶段。本文分析了梅氏新贝尼登虫HSP90在发育不同时期的表达情况。结果显示，HSP90基因在梅氏新贝尼登虫不同发育阶段均有表达，虫卵时期表达最强烈。总而言之，本文首次报道了梅氏新贝尼登虫热休克蛋白90，它与已报道的HSP90有着共同的结构特征。此外，表达分析表明该HSP90在梅氏新贝尼登虫发育中起着重要作用，为进一步弄清HSP90的功能和寻找防治此类病虫害的方法提供理论基石。参考文献1TAKESHIH,FUMIK,NORITAKAHEFFECTOFNEOBENEDENIAG
23、IRELLAEMONOGENEAINFECTIONONHOSTAMBERJACKSERIOLADUMERILICARANGIDAEAQUACULTURE,2009,2881591692HARTLFU,HAYERHARTLMMOLECULARCHAPERONESINTHECYTOSOLFROMNASCENTCHAINTOFOLDEDPROTEINJSCIENCE,2002,295185218583王婷婷,陈松林,孟亮等大菱鲆热休克蛋白90基因CDNA的克隆及其表达特征渔业科学进展,2010,31251594CSERMELY,PSCHNAIDER,T,SOTI,C,ETALTHE90KDAMOLE
24、CULARCHAPERONEFAMILYSTRUCTURE,FUNCTIONANDCLINICALAPPLICATIONSPHARMACOLTHER1998,7921291685陈奕,丁健热休克蛋白9O一癌症治疗的新靶点癌症,2004,2389689746刘宪玲,叶苓,王建波等热休克蛋白HSP90在人胃癌组织及耐药细胞系中的表达J第四军医大学学报,2000,2121311347施一江,赵攻,许先发,等主要人热休克蛋白在癌组织及癌旁正常组织中表达水平的比较研究J中华肿瘤学杂志,1998,2042772798左东升,范婕,商爱民等热休克蛋白90在人胃癌与癌旁及淋巴结转移癌中表达的研究张家口医学院学
25、报,2002,195459周向红,阎斌伦,王萍等条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建淮海工学院学报,2010,192818410李玉保,鲍恩东,赵茹茜等HSP70和HSP90荧光定量RTPCR检测方法的建立南京农业大学学报,2008,31211612011YANOM,NLATOZ,TNAAKAS,ETA1EXPRESIONANDROLESOFHEATSHCOKPROTEINSINHUMANBREASTCANCERJJPNJCANCERRES,1996,87990891512唐斌,王世贵,王峰巍等异色瓢虫的HSP90基因的克隆与特性分析中山大学学报,2010,492727813
26、林亚秋,郑玉才,吉红等草鱼HSP90基因CDNA序列克隆及其组织表达差异水产科学,2009,28833944214林生,潘大仁,周以飞等果蔗HSP90基因的电子克隆及序列分析热带作物学报,2009,30121824183015马炳田,万佳等水稻中一个与OSHSP90互作的新基因特性分析中国水稻科学,2009,23434234816刘大丽,张欣欣,程玉祥等逆境下水稻ORYZASATIBALRHSP90基因的克隆及功能分析分子植物育种,2006,4331732217JILLL,JOHNSON,CELESTEBPLASTICITYOFTHEHSP90CHAPERONEMACHINEINDIVERGE
27、NTEUKARYOTICORGANISMSCELLSTRESSANDCHAPERONES,200914839418DU,SJ,LI,H,BIAN,YHEATSHOCKPROTEIN90ALPHALISREQUIREDFORORGANIZEDMYOIFBRILASSEMBLYINSKELETALMUSCLESOFZEBRAFISHEMBRYOSSCI,2008,105255455919RUTHEFRORDSL,LINDQUISTSHSP90ASACAPACITORFORMORPHOLOGICALEVOLUTIONJNATURE,1998,396670933634220WEGELEH,MULLERL,BUCHNERJHSP70ANDHSP90ARELAYTEAMFORPROTEINFOLDINGJREVPHYSIOLBIONCHEMPHARMACOL,2004,15114421VOSS,AK,THOMAS,T,GRUSS,PMICELACKINGHSP90BETAFAILTODEVELOPAPLACENTALLABYRINTHDEVELOPMENT,2000,1271L1
