酵母表达系统.doc

1、集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 1 酵母表达系统 及其应用 集美大学生物工程学院 2011 级研究生 微生物专业 陈丽娜 学号： 2011227006 摘要 酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具 ， 拥有转录后加工修饰功能 ， 适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比 ，酵母表达系统操作简便 ， 成本低廉 ， 可大规模进行发酵 ， 是 表达真核基因产物的制备工具，越来越受到了人们的青睐。 关键词 酵母表达系统 基因 外源 表达 应用 Yeast Expression Systems and its Application Biologica

2、l Engineering College of Jimei University Lina Chen Student Number : 2011227006 Abstract Yeast expression system is a powerful tool that used to research and analyse the expression of eukaryotic protein. It has the function on processing and modifying after transcription so that it suits to express

3、exogenous functional protein stably. Compared with insects expression system and mammals expression system, yeast expression system is easy and simple to handle, much cheaper so it can be performed in large fermentation and it is a preparation tool on expressing eukaryotic gene. It gets more and mor

4、e favour of people. Keywords Yeast expression system gene foreign expression application 集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 2 引言 随着基因组研究迅速发展 ， 越来越多的新基因被克隆和分离 ， 基因功能的研究已成为 21 世纪生命科学领域 中的重大课题。基因表达技术是基因工程技术的核心 1。 分子生物学技术的发展为利用生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种蛋白表达系统，其中酵母表达系统是最近发展起来的新型表达系统。 酵母 ， 一

5、般是指以芽殖为主，形态结构简单的一类真菌。主要分布于子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。随着分子生物学技术的发展，利用微生物表达系统生产外源基因产物已成为可能 2。酵母作为单细胞真核生物，具有操作简单，可表达真核基因产物等优点，越来越受到了人们的青睐 ，而且 可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具 。 1. 酵母表达系统的特点 大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基

6、因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系 统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用 2,3。 酵母是单细胞低等真核生物，因而其表达系统兼有上面两种表达系统的优势：一是，酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产 ， 有效降低了生产成本。 二是，

7、酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力 ， 收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰 ， 性质较原核表达的蛋白质更加稳定 ， 特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列 ， 能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外 ， 因此很容易纯化 4。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益。 集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 3 2. 常用酵母表达系统 酵母一般 可 分成三大类： (1) 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母 (Schizosac

8、charomyces pombe)； (3) 非常规酵母 (Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称，主要有巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris，Pichiamethanolica)、乳酸克鲁维亚酵母 (Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)、烷烃利用型耶鲁酵母 (Yarrowia lipolytica) 等属酵母。近年来，甲醇酵母资源引起人们的强烈兴趣，其中尤以 Pichia pastoris 使用最多、最广泛，已被认为最具有发展前景的异源蛋白生产工具之一 1。 2. 1 酿

9、酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)表达系统 6,7 酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的 大肠杆菌 。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自 1981 年 Hitzemom 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入 。 2.1.1 用于酵母基因表达的 载体 2.1.1.1 YIp（ yeast integration plasmid）型载体 这是一种整合型载体，如 Yip5.它不含酵母的

10、 DNA 复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，含有整合介导区，此载体整合到染色体上，稳定性高，缺点为拷贝数低，但采取一些措施可以初步解决这个限制问题。第 1 个策略：用酵母转座子以产生多个插入拷贝；第 2 个策略：将 re-DNA 插入到核糖体 DNA（ rDNA）簇中， 在宿主的 X2 号染色体上以 150 串联重复序列存在。用特殊的质粒如 pMIRY2 转化可产生上百个整合拷贝，整合的 pMIRY2在无选择压力下分裂时保持稳定 。 2.1.1.2 YEp（ yeast episomal plasmid） 型载体 这是一种附加型载体， 如 Yep13， 它含有酿酒酵母 2 质粒 DNA 复

11、制有关的部分或全部序列 。 该载体常以 30 或更多拷贝存在，但不稳定 。 它能独立于酵母染色体之外复制，为穿梭质粒 （ E.coli 和 S.cervisiae）。 为了克服这些载体的不稳定性，以脆弱的 srbl-1突变的宿主株为基础建立自然选择系统 。 这个菌株要求渗透压稳定，否则会裂解，转化集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 4 后带野生型 SRB 的自主复制 YEp 型质粒与此菌株进行互补， 便 可在培养基上保持选择性 8。 2.1.1.3 YCp(yeast centromeric plasmid)型载体 和酵母附加型载体 YEp 一样含有酵母 菌中的 自主复制 序列 ARS

12、， ARS 序列中含有酵母菌染色体 DNA 上与染色体均匀分配有关的序列 CEN， 能够提高转化效率。 YCp 质粒携带有染色体着丝粒 ，这与质粒和细胞纺锤体的联合作用有很大关系 ，且能使自复制的质粒只有一个 。 YCp 质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 1-5 个 7。 2.1.2 用于基因表达的宿主菌 酿酒酵母 在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2107bp）早在 1996 年就完成 ，它有 16 条染色体，约 6000 个 ORF，仅 4%的酵母基因有内含子 。 由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌 。

13、 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于 30 kD 的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的 C 端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有 30 个或更多的拷贝，含有自动复制序列 (automaticreplicating sequence， ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含 ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了 pM

14、IRY2 ( for multiple integration into ribosomalDNA in yeast ) 质粒，旨在将目的基因靶向整合到 rDNA 簇上 (rDNA 簇为酵母基因组中串联存在的 150 个重复序列 )，因此利用 pMIRY2 质粒可以得到 100 个以上的拷贝。值得注意的是， 酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有 40 个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端 -1， 3-甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗 (如 HBV 疫苗、口蹄疫疫苗等 )。 2. 2 甲醇营养型酵母表达系统 甲醇营养型酵母包括汉

15、逊 酵母属 (Hansenula )， 毕赤酵母属 (Pichia)， 球拟酵母属(Torulopsis)等 ， 能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长 ， 甲醇可以诱导它们表达集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 5 甲醇代谢所需的酶 ， 如醇氧化酶 (AOX1)、二羟丙酮合成酶 (DHAS)、 甲酸脱氢酶 (FMD)等。 AOX1 的甲醇诱导表达量可占到胞内总蛋白质的 20 % 30 %， 表明 AOX1 的合成受转录水平的调控 ， AOX1 启动子 ( PAOX1)具有较高的调控功能 ， 可用于外源基因的表达调控 3。 2.2.1 汉逊酵母表达系统 2 是一种极为理想的外源基因表

16、达系统，它具有很多特殊的优点 是一种耐热酵母，最适生长温度为 37-43 ，最高生长温度可达 49 ，生长范围较宽，易于操作控制。 内含有特殊的甲醇代谢途径，含甲醇氧化酶（ MOX）、甲醇脱氢酶（ FMD）和二经丙酮合成酶（ DHAS）几种特殊的酶；甲醇代谢途径关键酶的表达受阻遏 /解阻遏机制调控，乙醇、高浓度的甘油和葡萄糖阻遏基因表达 ， 甲醇、低浓度的甘油和葡萄糖解除阻遏。 此酵母中 MOX、 DHAS 和过氧化物酶贮存于过氧化物酶体 ， 表达外源蛋白时可以在外源蛋白 C 末端加上一固定氨基酸序列 ： S/A/C-K/R/H-L， 从而将其定位于过氧化物酶体 ， 避免对细胞产生毒害且免受蛋

17、白酶降解。 此酵母目前已构建了多种营养缺陷株 ：ura3、 his3、 leu2、 trp3 和 ade11 等 ， 筛选方便。 可以通过非同源重组整合多拷贝基因 ，拷贝数可达 100 以上 ， 也可 通过同源重组 ， 利用葡萄糖 /胆 碱或葡萄糖 /甲醇 /硫酸 铵 完成表达。 2.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母 （ Pichia pastoris）表达系统最为常用 ，它由野生型石油酵母 Y11430 突变而来 ， 常用的 3 株宿主菌是 GS115， KM71 和 MC100-34。 毕赤酵母表达载体都是穿梭载体 ， 主要有三大类 ， Origina

18、l pichia 表达载体 ，Easyselect pichia 表达载体 ， Multi-copy pichia 表达载体。毕赤酵母表达载体具有胞内分泌和胞外分泌之别 ， 一般应用胞外分泌型载体。而且该载体还有自我复制的游离载体和整合型载体两种类型 ， 大多数实验室都采用整合型载体 ， 整合型载体通过用不同的酶切 (如 Bgl Not1 或 Pme1 Sac1 等 )线化后 ， 使之以单一交叉或双重交叉替换同源重组方式整合到酵母基因组的 AOX1 或 His4 基因的位置 ， 并随酵母的生长而稳定存在。下面是具有代表性的甲醇表达载体 (pPICZA. B. C 3.6Kb)结构 1： 5AO

19、X1：含有 AOX1 启动子，可强烈启动外源蛋白的表达，同时也是载体和宿主集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 6 菌发生重组的位置。当酵母的 AOX1 基因被替换而丢失后，使酵母利用甲醇的速度变慢，此时宿主菌利用弱的 AOX2 基因启动合成 AOX，即产生了 Muts 表型 (methanolutilizati on slow)，反之即称为 Mut+表型； MCS：多克隆位点 提供外源基因插入的位点； Signal：编码 N 末端信号肽序列，可引导外源蛋白分泌到细胞外； C-myc：方便检测外源蛋白位点 ； 6His： 纯化外源蛋白的标签 ， 为蛋白的下游加工提供方便 ； 3AOX1

20、TT： 3末端转录终止序列和终止位点 ， 同源重组位置之一 ； Zeocin： 既可在大肠杆菌中 筛选 ， 又可作为阳性重组酵母转化子筛选的抗性基因 ； Puc ori： 大肠杆菌复制起点。 外源目的基因在甲醇酵母的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达，先以甘油为碳源的培养基上增殖菌体，当达到 OD 值为 3-6 时，离心弃上清后悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达，间隔 24 h 添加培养基总量的 0.5%-1%的甲醇，以弥补甲醇的消耗。在进行表达的过程中，各种条件有待优化，一旦最佳条件确定，即可按比例放大，进行高密度大规模的发酵。 2. 3 裂殖酵母 ( Schizogenesis pom

21、be)表达系统 1 裂殖酵 母不同于其他酵母菌株 ， 它具有许多与高等真核细胞相似的特性 ， 它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是 ， 目前对它的研究较少 4。 裂殖酵母表达系统中通常采用以 2m环和 ars1 作质粒复制起始点的游离载体。 ars1是从裂殖酵母的染色体中克隆出来的，作为质粒的自我复制序列 (ARS)。含有裂殖酵母的 ars1 的质粒能够以多拷贝的形式在细胞中存在，但当细胞进行有丝分裂时质粒容易丢失。裂殖酵母的稳定 stb 序列可以使转化子在有丝分裂和减数分裂时仍能稳定存在。将稳定的 stb 序列和 ars1 连接在一起构建的载体能够以多拷贝的形式在裂

22、殖酵母细胞中稳定存在，其拷贝数为 80 左右。在以抗生素 G418 为选择压力的情况下，可以提高质粒的拷贝并维持其稳定，在某些情况下每个细胞的质粒数高达 200。高效表达载体 pTL2M就属于此类载体，它含有高效的 hCMV 启动子，其不含有任何复制起点和营养缺陷型标记，使用时必须与转导载体 (pAL7)共转化进入裂殖酵母宿主。在细胞内两个载体发生同源重组，成为一个载体在胞内复制。在表达载体 pTL2M 中，外源基因的表达受 hCMV启动子和抗生素 G418 的浓度的调控。采用此载体膜蛋 白也可以得到高效表达。 集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 7 3. 利用酵母菌表达外源基因的步骤

23、 4,5 以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例 ， 包括如下步骤 :将目的基因克隆入毕赤酵母表达载体 ， 收获阳性重组表达质粒 用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒 ， 使之线性化 将线性化的阳性重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母菌株 (如 GS115， KM71) 将转化物接种 HIS4 缺陷平板进行第一轮筛选 用不同浓度 G418 平板进行第二轮筛选 挑选10 20 个克隆进行小规模诱导培养 ， 鉴定外源基因的表达量 挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养 ， 以制备外源基因的表达蛋白质 。 4. 影响酵母表达外源蛋白的因素 1 转入酵母中的外源基因所表达的蛋白质水平的高低与许多因素有关 ， 如菌株的

24、类型、载体的拷贝数和稳定性、外源基因序列的内在特性、培养条件等。只有对这些诸多因素进行全面了解和优化 ， 克服影响酵母表达外源蛋白水平不确定性因素 ， 减少试验的盲目性 ， 提高酵母外源基因表达产量。 4.1 外源基因特性 主要涉及外源基因 mRNA 5端非翻译区 (5/2U TR)、 A + T组成和密码子的使用频率。分述如下 ： (1) 一个适当长度的 5非翻译区可极大地促进 mRNA 有效地翻译。 UTR 太长或 太短都会造成核 糖 40S 亚单位识别的障碍 ， 如 AOX1 基因 5-U TR 长为 114 nt， 并且富含 A + U。因此 ， 对于最佳蛋白表达量 ， 维持外源基因

25、mRNA 5-UTR 尽可能和 AOX1 mRNA 5-UTR 相似是必需的 ， 并且最好是保持两者一致。另外 5-UTR 中应避免 AUG 序列以确保 mRNA 从实际翻译起始位点开始翻译。起始密码 AUG 周围不应形成二级结构 ， 这可以通过密码子的替换来达到目的 ； (2)许多高 A + T 含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录。因此 ， 对 AT 含量丰富的基因 ， 最好是重新设计序列 ，使 其 A + T 含量在 30 %-55 %范围内 ； (3)如果外源基因中含有稀有密码子 ， 则在翻译过程中会产生瓶颈效应而影响表达。对 110 个酵母基因使用密码子的统计学分析表明密码子的嗜

26、好性与基因表达量密切相关。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。在所有的 61 个密码子中有 25 个是酵母所偏爱的。对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。高效表达的基因几乎毫无例外地使用这 25 个偏好密码子。 集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 8 4.2 启动子的影响 一般说外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系 ， 所以 ， 选用强启动子对高 效表达就十分重要。如目前酿酒酵母组成型的强启动子 PGK， ADH1， GPD 等 ，诱导型强启动子 GAL1， GAL7 等 ， 巴氏毕赤酵母启动子 AOX1 已被克隆用于外源基因的表达。最近在巴

27、斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PGAG， 在它的控制下 -LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的 PAOX1 驱动的产量更高 ， 由于该组成型启动子不需要甲醇诱导 ， 发酵工艺更简单 ， 同时其产量更高 ， 所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。 4.3 外源基因拷贝数和稳定性 表达载体在酵母细胞中的拷贝数对外源基因表达有明显的影 响。酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷贝表达载体基础。如以 2m 环为基础构建的酵母菌附加型质粒 YEp 常以 30 或更多拷贝数存 ， 但稳定性差。如果外源基因克隆进入2m质粒上的 Hpal 位点 ， 可使外源基因稳定高

28、效表达 ;酵母核糖体 RNA 的基因 rDNA在染色体中具有 100 200 个重复 ， 是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。一般情况下 ， 毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高 ， 则蛋白表达量愈大。而 在 一些情况 下， 高拷贝数对产量 不会 有什么效果。 4.4 表达条件的优化 表达条件的优化主要包括通气 量、培养基、摇菌密度、蛋白酶、诱导剂的含量等。对这些诸多表达条件需要综合考虑 ， 整体优化 ： (1)充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。试验中采取多种措施如培养基体积不超过摇瓶体积 10% 30%、提高摇床转速、用几层纱布等 ； (2)有多种培养基 ， 如 BM

29、GY/BMMY， BMG/BMM，MGY/MM 等都可用来毕赤酵母表达。 BMGY/BMMY 中含有酵母膏和蛋白胨 ,可作为富营养物 ,使菌体更好地生长 ,从而增加生物量 ; (3) 通过调整培养基的 pH 值 ， 在培养基中添加 1%酪氨酸蛋白水解物等措施来抑制蛋白酶活性 ， 使 降解程度减至最低。此外选用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法 ； (4) 理论上来说 ， OD 值越高 ， 生物量越大 ， 则总的表达量也越大。 但 OD 值越高 ， 则培养基中的氧和营养供给越受限制。诱导前 OD600 = 2-3， 浓缩 10 倍 OD600 为 20-30 为宜。 (5) 诱导期间培

30、养基中定期补充诱导剂 ， 对于诱导表达外源蛋白十分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加甲醇 ， 以弥补甲醇的消耗和蒸发。一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 9 体积的 0.5 %为宜。 5. 应用 利用酵母表达系统生产制备外源基因的表达产 物已有十余年的历史 ， 其中的S.cerevisiae 表达系统和 P. pastoris 表达系统最受人们的青睐。 酵母表达系统在很多领域都有应用， 涉及 动物界、植物界 和微 生物界 。 截止目 前，利用酵母表达系统人们已经成功地表达了多种生物 (包括细菌、真菌、病毒、原生生物、植物、脊椎动物

31、、人类 )的许多蛋白质，涉及酶类、蛋白酶体、蛋白酶体抑制物、受体、单链抗体、抗原、调控蛋白等多种蛋白质。 陈义平等 9利用毕赤酵母表达系统成功表达了印第安纳型水泡性口炎病毒核衣壳蛋白。 汪文俊 10研究了红法夫酵母 中 虾青素生物合成的分子机制。 Zhang 等 11成功在毕赤酵母表达系统中高效表达了恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白 1C 的末端片段。 Lin 等 12研究了人体血管抑制素在毕赤酵母中的生产工艺。 在植物领域，酵母表达系统被用于蛋白质的亚细胞定位和后期蛋白生物活性的分析，植物功能基因组学研究等。 潘维锋等 13研究了酵母表达系统在植物功能基因组学研究中的应用。 Moehnke 等

32、14利用酵母表达系统对高山香柏木的过敏原进行了研究。 在医学领域，酵母表达系统已经成功地应用于基因工程疫苗制备、基因工程药物制备 (如抗体药物、蛋白质药物 )和蛋白质功能研究等 。 Haiyin 等 15利用细菌和酵母表达体系研究了 大豆炭腐病内切葡聚糖酶基因产物的特性。 国外，用于肌萎缩侧索硬化治疗的胰岛素样生长因子 1(IGF21)和血清代用品人血清白蛋白 (HSA)已经通过了临床实验，正在等待 FDA 批准即可进入临床使用。乙肝表面抗原作为亚单位疫苗已经在市场上销售。 结语 酵母这一传统的最简单的真核微生物，已成为现代分子生物学重要的模式工具和外源基因表达的重要宿主，并在应用中显示出 种

33、种优势， 其完善的分子生物学操作方法，成熟的高密度发酵技术，已成为科学研究和生产商业化蛋白的重要表达系 统之一。 研究人员不断改进酵母的遗传特性和生理特性 ， 这些突破更加提高了酵母 表达系统 的应用。但是，酵母作为一种表达系统还存在一些不够完善的地方：外源基因在酵母细胞中的表达还有很多规律没有认识；一个基因能否在酵母中表达，能不能高效表达还有很大的随机性；表达高等生物基因产物与其天然蛋白在结构上还有待改进。但可以相信，随着现集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用 10 代分子生物学技术的发展，人们将进一步地探索各种酵母表达系统的强启动子元件、分泌信号肽、翻译后蛋白的加工及修饰机制及外源蛋

34、白表达的影响因素，有理由推测 这一表达体系 会有无限的发展空间 。 参考文献 1董清华 ,沈元月 . 酵母表达系统研究进展与展望 . 北京农学院学报 ,2008,23(2):72-75. 2宋丽推 ,于群 ,卜凤荣 . 几种主要的酵母表达系统研究进展 . 中国输血杂志 , 2003,16(3):209-211. 3于平 . 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 . 工业微生物 ,2005,35(3):50-54. 4吴丽娟 ,蒋建新 ,朱佩芳等 . 酵母表达系统及其应用研究 . 生命的化学 ,2003,23(1):46-49. 5Michael A, Carol A, Jeffrey J. Fore

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