1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全福寿螺卵中类胡萝卜素的研究一、选题的背景与意义福寿螺原生于南美洲亚马逊河流域。上世纪七十年代末以来，因福寿螺蛋白质丰富，营养成分高，可供食用，且易饲养，而被中国、菲律宾、印尼、马来西亚、日本、泰国、越南等国家引进。但是，人们对福寿螺危害性缺乏认识，盲目引进饲养，且因福寿螺作为食用，适口性差，市场销路不畅，并且是广州管圆线虫的寄主，失去了食用价值。加之管理不严，致使其大量丢弃野外，但福寿螺适应环境的生存能力很强，繁殖速度惊人，迅速扩散到河湖田野。不但造成农作物的巨大损失，并在内河，湖泊大量繁殖，造成生态灾害。在2003年被国家列为首批外来生物之一。福寿螺80
2、年代末引进宁波市，因同样原因，扩散在到田间，内河，近几年宁波市各地都已有不同程度灾害，并且扩展蔓延迅速，发生逐年加重，并且浙江省内的福寿螺是大多是变异品种，具有较强抗寒能力。福寿螺造成农业、生态危害的原因，一方面是福寿螺食性广，适应能力强，繁殖快，另外一方面主要原因是其失去食用价值后，没找到可利用途径，加之对外来物种管理不力，导致其扩散到环境中。现在对于福寿螺的防治没有很好的方法，农田有采用化学防治，生物防治等方法，但是化学防治会带来新的环境问题，生物防治也有很大局限。且对于内河湖泊中的福寿螺，这些方法都无法使用。只是采用人工除卵等方法。福寿螺本身是一个丰富的蛋白质来源，同时与生活习性和繁殖方
3、式相联系，其体内和卵中具有丰富的强抗氧化和防入侵的活性成分。为此，本项目主要针对福寿螺卵中的抗氧化成分加以研究，明确其分布、活性大小，含量等特征，以期将福寿螺作为新的天然食品抗氧化剂的来源，为将来结合蛋白质加工技术对福寿螺进行综合利用打下基础。项目的进行对于充分利用福寿螺这一生物资源，开发其经济价值，同时通过恰当的管理控制其进一步的扩展、蔓延，降低甚至消除其对农业生产和生态带来的灾害，具有重要的社会，经济和生态效益。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容福寿螺卵中类胡萝卜素提取方法的优化主要问题1分析类胡萝卜素的抗氧化能力2确定提取溶剂3优化提取方法三、研究的方法与技术路线研究方法1卵内
4、活性成分提取及分离纯化2卵内活性物质的定性定量3活性物质提取方法的优化技术路线四、研究的总体安排与进度12010年12月14日12月21日福寿螺卵组分成分分析22010年12月22日12月31日福寿螺卵中抗氧化活性分析32011年2月15日3月15日优化提取方法五、主要参考文献卵的收集破碎萃取分离抗氧化活性分析组分分析优化方法的考察提取方法的优化时间蛋白质、脂肪、水分、灰分温度超声波溶剂1MARCOSSDREON,GUILLERMOSCHINELLA,HORACIOHERASETALANTIOXIDANTDEFENSESYSTEMINTHEAPPLESNAILSEGGS,THEROLEOFOV
5、ORUBINJARCHICESOFBIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS,2004,VOL422182王敏，祝渊静，赵国良等天然胡萝卜素的提取与分离J重庆理工大学学报自然科学，2010，24328323罗璇，石慧，郭城等产类胡萝卜素红酵母细胞壁成分分离及含量检测方法的研究J农产品加工，2010，372754赵永彬，尹明安不同溶剂对胡萝卜中类胡萝卜素提取的影响J安徽农业科学，2005,3346716735朱秀灵，车振明B一胡萝卜素生理功能及提取技术的研究进展J西华大学学报自然科学版，2005，171766沈国鹏，徐贵敏，刘芳脂溶性类胡萝卜素的提取及其稳定性研究J河南农业科学，2003
6、，830327赵丰丽，李秋临，湛玉芬柿子皮类胡萝卜素的超声提取及抗氧化活性的研究J食品与发酵工业，2008,3481831878李洋，徐雅琴微波法提取沙棘中类胡萝卜素最佳工艺的研究J食品工业科技，2008,2951931959张卫强，邓宇微波辐射萃取番茄红素的研究J食品工业科技，2002，235363710张海霞，杨云裳，张应鹏等胡萝卜中天然胡萝卜素超声提取工艺的研究J食品研究与开发，2007，287293111姬小明，邵惠芳，刘金霞等类胡萝卜素的提取及分离方法研究研究J河南科学，2008，261113371339毕业论文文献综述食品质量与安全福寿螺及类胡萝卜素的研究进展摘要详细介绍了福寿螺，
7、类胡萝卜素的常见提取及分离方法的最新研究进展。从福寿螺卵中提取类胡萝卜素将会是福寿螺和食用天然色素开发研究的最好交点。关键词福寿螺类胡萝卜素提取0、引言福寿螺和类胡萝卜素看似两个没有交集的研究对象，却因为食用天然色素的开发连接在了一起。接下去将会介绍他们各自的研究现状，以及共同开发的意义。1、福寿螺的研究现状关于福寿螺的研究最初大多集中在其生长规律和特性方面，后来慢慢向农田的生物化学防治方法过渡，最后福寿螺及其卵也都有不同的研究者从不同侧面的展开了零星的研究。11福寿螺生物特性的研究福寿螺（APPLESNAIL）又称苹果螺、大瓶螺，分类上属软体动物门、腹足纲、中腹足目、瓶螺科、瓶螺属，原产于南
8、美洲亚马逊河流域1。1981年作为食用螺引入中国，因其生长繁殖迅速，适应性强而成为中国危害巨大的外来入侵物种。福寿螺食性广，以植物性饵料为主2，主食各种水生植物、陆生草类和瓜果蔬菜，如各种浮萍、水花生、水葫芦、青菜、青草、瓜皮、水果等。也食人工投喂的糠麩、饼粕类饲料及下脚料等，在食物缺乏的时候也摄食一些残渣剩饵和腐殖质及浮游动植物等。福寿螺具有较长产卵期限，每年平均有3个星期的产卵期2，分别在4月份、6月份、10月份，每次产卵期为1016天，通常13天交配1次，产1次卵，每次1块。福寿螺均在夜晚产卵，白天不产卵，并且产卵于离水面2030CM的沟渠壁、河塘、河边树杆、竹篱笆及停泊在河中的船壳、稻
9、苗及杂草茎秆上。除此之外，黄鹏、林兆里等发现降雨量和气温的变化对福寿螺产卵量有极大影响。雨量对福寿螺田间产卵有明显的影响雨量越大产卵量越少；当降雨量大于70MM时，福寿螺的产卵量明显降低，但在降雨结束后的12天，福寿螺产卵量逐渐恢复上升，并达到一个新的高峰。福寿螺产卵量也随温度的起伏而波动在较短的周期内，温度的变化与福寿螺产卵量呈正相关；但从长期看温度的高低变化与福寿螺的产卵量并没有明显的相关。为此，在生产上降雨量和气温可作为福寿螺发生情况分析的重要依据3。12福寿螺防治的研究在研究了福寿螺的生物特性之后，针对福寿螺的危害，研究出了农业防治、生物防治、化学防治等技术方法4，目前化学防治仍然是应
10、用最普遍的一种。农业防治主要是人工捕捉成螺和消灭螺卵两种方法，安全无污染，但费工大。生物防治是通过养家禽取食福寿螺的方法减少螺源，降低成本，具有先进性，意义较大，应用前景广阔。化学防治中防治福寿螺主要药剂有70百螺杀可湿性粉剂、6密达杀螺颗粒剂、80五氯酚钠粉剂。由于福寿螺适应性强，分布范围广，难以根除，往往是短期见效，治标不治本。在实际防治过程中，应该采取农业防治、生物防治、化学防治等配套综合防治技术措施，多种防治方法并举，这样才能达到较好防治效果。13福寿螺内消化酶的研究福寿螺以植物性饵料为食，具有食量大、生长迅速的特点，因此体内必然含有高活性的消化酶，特别是分解细胞壁的纤维素酶和果胶酶。
11、众多研究者对此进行了研究。徐建荣、程东成等5对福寿螺消化酶进行了分析研究，用PH值为58的柠檬酸磷酸盐缓冲液分别从研磨后的福寿螺内脏中反复提取（约2S）后，再用双层纱布过滤，收集滤液然后离心30MIN（4000RPM）收集上清液，用纤维素、果胶和淀粉测酶活性，发现不同来源的消化酶活性不同，消化道中含有的纤维素酶和果胶酶活性较高，而肝脏中含的淀粉酶活性较高。毛孙忠、雷康福等6从福寿螺体内分离纯化得到一种均一的纤溶酶（ACFE）成分，其分子量为32KDPI为36，最适PH在95110之间，该酶热稳定性强，能抗4MOL/L脉处理其具有水解合成底物S2288和CHROMOZYMP的活性，活性受ZU2、
12、CU2等抑制，受对氨基磺酸氟（PMSF）抑制，但不受对羚甲基苯磺酸（PHMB）影响。张喆，赵红7等则分离出了获得经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单一纯的葡萄糖苷酶制剂测定该酶的最适反应温度为43，最适反应PH为51；在PH51，45下，该酶催化水杨素水解的KM值为340MMOL/L，活化能为5063KJ/MOL。研究几种效应物对酶活力的影响，结果表明MN2、CO2对酶有激活作用，而CU2、HG2、PB2、SDS及脲对酶有不同程度的抑制作用，其中CU2和HG2对该酶的抑制作用最强。庄总来、周兴旺8等测得福寿螺内纤维素酶各组分的酶活力分别为内切葡聚糖酶2065万U/G；（葡萄糖苷酶424万U/G；
13、外切葡聚糖酶048万U/G；酶粉的蛋白质含量为3769、水分为796、灰分为178。以花生壳作为纤维素酶作用对象，测定酶促反应的最适PH为526，最适温度为52。在PH52、40下，纤维素酶作用于花生壳生成葡萄糖，在2H内葡萄糖的生成量与反应时间成正比关系，然后逐渐缓慢；随着酶浓度的增大，葡萄糖的量也呈直线上升，说明从福寿螺分离得到的纤维素酶能有效地水解花生壳转化为可被利用的葡萄糖。特别是李燕红从福寿螺胃液中分离出了具有高EG，CBH以及木聚糖酶等多种酶的活力的EGX，其相对分子量为最适PH也在PH4448。14对福寿螺的其他研究张刚生和郝玉兰9使用了激光拉曼光谱分析福寿螺卵壳，证实里面出来六
14、防碳钙石外，还含有类胡萝卜素。HERAS等（2008）首次报道了福寿螺卵中具有防止入侵的活性成分，该成分能对卵提供化学防护，对小鼠具有神经毒性作用的活性成分。MARCOS10等研究了卵红蛋白在福寿螺卵抗氧化损伤保护系统中的作用。总得来说，对于福寿螺而言这些研究不系统，也不够全面深入。2、类胡萝卜素的研究现状关于类胡萝卜素的研究主要包括类胡萝卜素的种类及其生化特性、生理功效、提取方式等方面。21类胡萝卜素生化特性的研究类胡萝卜素（CAROTENOID）是一类广泛存在于自然界中的天然有色物质，通常是指40碳的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物（叶黄素）两大类色素的总称，其颜色通常为黄色到红色
15、，属于脂溶性四萜烯类化合物11。到目前为止，已知的类胡萝卜素约600多种，很多天然类胡萝卜素来自高等植物橙黄色的花朵（如向日葵、金盏花等）、橙红色的果实（如番茄、柑橘等）以及胡萝卜的根。但是类胡萝卜素含量最高的是微生物、植物和藻类的光合组织。类胡萝卜素一般可分为两类胡萝卜素和叶黄素12。前者以胡萝卜素为代表，仅含碳、氢两种元素，后者则是前者的含氧衍生物，如虾青素。另一种分类系统是将类胡萝卜素分为链状、单环和双环衍生物，它们的母体代表化合物分别为胡萝卜素、番茄红素和胡萝卜素。类胡萝卜素的性质由它的分子结构决定，共轭多烯链是类胡萝卜素分子的结构特征，这一结构使类胡萝卜素具有独特的色泽。类胡萝卜素在
16、生物体中表现出许多生物学功能13，是一种良好的自由基淬灭剂，具有显著的抗氧化性，可以有效地阻断细胞内的自由基链式反应，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、防癌方面和预防心血管疾病、白内障方面有显著作用，并能防止老化和衰老引起的多种退化性疾病，因而被认为是治疗和预防这些顽疾的理想药物14。22类胡萝卜素提取的研究提取是天然色素生产中较为关键的工序15之一，其中的影响因素也较多，例如提取工艺的流程，提取溶剂的选择。一般常见的提取方法有有机溶剂提取法16、酶反应法17、微波辅助提取法18、超声波辅助提取法19、超临界流体萃取法20等。不同的浸提溶剂对类胡萝卜素成分的溶解性不同，提取
17、效果也不一样21。王岁楼22、金国英23研究表明，用丙酮石油醚11混合溶剂对红酵母浸提效果最好；单一溶剂浸提效果以丙酮最好，丙酮浸提效果要明显高于其他单一溶剂的浸提结果。从色素提取后的细胞碎片颜色也可以证实上述的结果24。用丙酮石油醚11混合溶剂和丙酮浸提后的细胞碎片基本呈白色。从理论上讲，胡萝卜素分子结构为非极性，按照“相似相溶”原理，应该选用非极性有机溶剂来浸提色素，然而实验结果却完全相反。这可能与类胡萝卜素分子结构的空间变化有关。极性有机溶剂的浸提效果明显好于非极性有机溶剂25，与杨文报道的红酵母实验结果有所不同，这可能与菌株不同或操作方法不同有关。一般，采用非极性有机溶剂浸提细胞碎片，
18、需将细胞碎片26烘干，这无疑将引起热对类胡萝卜素的降解作用而改变了空间结构。赵丰丽、李秋临等27采用不同极性的溶剂，以柿子皮中类胡萝卜素的含量为指标，分别用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、及丙酮石油醚（体积比37）等作提取溶剂。通过单因素和正交试验得出以丙酮为提取溶剂，在柿子皮粉碎度为40目、超声频率40KHZ、提取两次条件下，柿子皮中类胡萝素的最佳提取工艺为料液比125（GML）、超声功率400W、超声时间20MIN。李洋、徐雅琴28则探讨了利用微波辐射提取沙棘中类胡萝卜素的影响因素，结果表明类胡萝卜素的最大吸收波长为449NM，各因素对类胡萝卜素提取的影响从高到低为功率时间料液比。最佳工艺条
19、件为用丙酮作提取剂，微波功率为300W，提取时间为40S，料液比（G/ML）为115，提取级数为三级时，提取效果最好。并由正交实验确定了微波条件提取沙棘中类胡萝B素的最佳工艺条件为提取溶剂丙酮，功率300W，萃取时问40S，料液比（G/ML）为115，提取次数为三次，能够比较完全地提取沙棘中类胡萝卜素。3、从福寿螺卵内提取类胡萝卜素根据目前的研究现状和我国的具体实际，对于福寿螺研究主要有2个趋势，一是利用福寿螺获得高产酶基因，进行克隆表达，从而获得高效的酶制剂。另外一个趋势是将集中在对福寿螺及其卵中的各种生物活性物质进行研究。特别是后一个趋势，将大大促进对福寿螺的综合利用进程，从而为充分利用该
20、资源，并控制其对农业、生态造成灾害发挥重大作用。本项目切合现今形式，对第二个趋势所涉及的方面进行研究，以期进一步科学利用治理福寿螺。而由于胡萝卜素29具有营养增补剂和食品着色剂的双重功效，被广泛用作饮料、食品及饲料添加剂。胡萝卜素是FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会确定的A类优秀食品添加剂。胡萝卜素已取代焦油系食用色素作为黄橙色色素用于饮料、人造奶油和冰淇淋等。美国已确认其可安全使用，于1987年批准胡萝卜素可作为食品添加剂用于婴幼儿食品。它也被广泛地应用于功能食品中，并有良好的商业前景。因此，我们可以在福寿螺卵内提取类胡萝卜素，不仅能够减少福寿螺的危害，增加附加值，也为食品的天然着色剂的
21、提取对象提供了一个新的选择。参考文献1林巧玉稻田福寿螺的发生及防治J植物保护,2004,320212张炳光福寿螺的发生规律与防治技术J现代农业科技,2005,8193黄鹏,林兆里,徐金汉等福寿螺卵期生物学特性J福建农林大学大学学报自然科学版,2010,325294林伟群,周锡跃稻田福寿螺的发生规律及综合防治J中国稻米,2005,2275徐建荣,程东成,李波福寿螺消化酶的活力测定研究及其酶解效果分析J水产养殖,2007,3356毛孙忠,雷康福,严哲福寿螺纤溶酶的分离纯化及其性质研究J温州医学院学报,2005,64614637张喆,赵红,周兴旺等福寿螺葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究J厦门大学
22、学报自然科学版,1999,022872918庄总来,周兴旺,唐志军等福寿螺纤维素酶的开发与应用J台湾海峡,2000,1699张刚生,郝玉兰福寿螺卵壳的激光曼拉光谱分析J分析仪器,2005,2272910MARCOSSDREON,GUILLERMOSCHINELLA,HORACIOHERASETALANTIOXIDANTDEFENSESYSTEMINTHEAPPLESNAILSEGGS,THEROLEOFOVORUBINJARCHICESOFBIOCHEMISTRYANDBIOPHYSICS,2004,VOL4221811李宁宁类胡萝卜素的研究进展J中国现代实用医学杂志,2004,3251531
23、2杨振水,袁德奎,罗显华天然类胡萝卜素色素的特性与开发利用研究J食品研究与开发,2005,26111011313刘翔,惠伯棣类胡萝卜素在体内外的抗氧化活性J食品工业科技,2008,291027928214朱秀灵,车振明胡萝卜素生理功能及提取技术的研究进展J西华大学学报自然科学版,2005,1717615王敏,祝渊静,赵国良等天然胡萝卜素的提取与分离J重庆理工大学学报自然科学,2010,243283216赵永彬,尹明安不同溶剂对胡萝卜中类胡萝卜素提取的影响J安徽农业科学,2005,33467167317沈国鹏,徐贵敏,刘芳脂溶性类胡萝卜素的提取及其稳定性研究J河南农业科学,2003,830321
24、8张卫强,邓宇微波辐射萃取番茄红素的研究J食品工业科技,2002,235363719张海霞,杨云裳,张应鹏等胡萝卜中天然胡萝卜素超声提取工艺的研究J食品研究与开发,2007,287293120廖传华,黄振仁超临界CO2萃取螺旋藻的实验研究J中成药,2003,252969821姬小明,邵惠芳,刘金霞等类胡萝卜素的提取及分离方法研究研究J河南科学,2008,26111337133922王岁楼,张平之从红酵母生产胡萝卜素的研究J山西食品工业,2000,2131823金国英酵母类胡萝卜素产生菌的筛选及其发酵条件的研究D浙江,浙江大学,2001,6124罗璇,石慧,郭城等产类胡萝卜素红酵母细胞壁成分分离
25、及含量检测方法的研究J农产品加工,2010,3727525徐海钱,钱卫,高东等红酵母生产类胡萝卜素的研究J工业微生物,1997,273212626TAKASHIWSTRATEGIESFORCONTROLLINGTHEAPPLESNAILPOMACEACANALICULATALAMARCKGASTROPODAAMPULLARIIDAEINJAPANESEDIRECTSOWNPADDYFIELDSJJARQ,2004,3827527赵丰丽,李秋临,湛玉芬柿子皮类胡萝卜素的超声提取及抗氧化活性的研究J食品与发酵工业,2008,34818318728李洋,徐雅琴微波法提取沙棘中类胡萝卜素最佳工艺的研究
26、J食品工业科技,2008,29519319529王海英,杜为民,李雯等螺旋藻干粉中胡萝卜素提取工艺研究J中国食物与营养,2010,66466本科毕业设计（20_届）福寿螺卵中类胡萝卜素的研究目录1引言12材料与方法221主要试剂与设备2211主要试剂2212主要设备222福寿螺卵的基本理化性质2221卵的采集及卵研磨液的制备3222水分含量的测定3223灰分含量的测定3224脂肪含量的测定3225蛋白质含量的测定323福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的选择3231福寿螺卵标准液的配制3232提取溶剂的选择3233测定方法324福寿螺卵类胡萝卜素与胡萝卜素的比较3241胡萝卜素的提取3242福寿螺卵类
27、胡萝卜素与胡萝卜素薄层色谱比较425福寿螺卵类胡萝卜素的抗氧化评价4251FRAP法测定总抗氧化活性4252FESO4标准曲线的绘制4253抗氧化总值与抗坏血酸对比426福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的优化4261优化工艺条件4262提取液浓度的计算43结果与讨论531福寿螺卵的基本理化特性532福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的确定533福寿螺卵类胡萝卜素与胡萝卜素的比较分析634抗氧化活性测定结果835单因素试验结果与分析936部分因子试验结果与分析1037提取条件的优化结果114小结13致谢错误未定义书签。参考文献15摘要本文以福寿螺卵为原料，测定了福寿螺卵的水分、灰分、脂肪、蛋白质的含量，并采用
28、不同溶剂进行类胡萝卜素的初步提取，比较了不同提取方法的效果，从而确定氯仿甲醇体系适宜提取福寿螺卵中类胡萝卜素。通过改变溶剂体积比、提取温度、提取时间、超声波等因素，进行提取方法的优化。实验结果表明当氯仿甲醇的溶剂体积比为037，提取温度为39，并进行超声波处理时，对福寿螺卵中类胡萝卜素的提取效果最好。关键词福寿螺卵；类胡萝卜素；提取ABSTRACTBASEDONTHEAPPLESNAILEGGSASMATERIALSINTHISPAGE,WEDETERMINEDITSCONTENTOFMOISTURE,ASH,FATANDPROTEINTHENWEEXTRACTEDTHECAROTENOIDS
29、INAPPLESNAILEGGSPRELIMINARYWITHDIFFERENTKINDSOFSOLVENT,ANDCOMPAREDTHEPERFORMANCEOFDIFFERENTEXTRACTIONMETHODS,SOTHATWEDETERMINETHEBESTEXTRACTIONSYSTEMISCHCL3CH3OHSYSTEMWEOPTIMIZEDTHEEXTRACTIONMETHODSBYCHANGINGTHEFACTORSLIKESOLVENTVOLUMERATIO,TEMPERATURE,TIME,ULTRASONICWAVETHEOPTIMUMCONDITIONSFORCAROT
30、ENOIDEXTRACTIONFROMAPPLESNAILEGGSWEREASCHCL3CH3OHIS037,THETEMPERATUREIS39ANDUNDERULTRASONICWAVEPROCESSINGKEYWORDSAPPLESNAILEGGSCAROTENOIDSEXTRACTION11引言福寿螺（APPLESNAIL）又称大瓶螺，原产于南美洲亚马逊河流域1，因其头部肉质细嫩鲜美，富含蛋白质、胡萝卜素、多种维生素和矿物质，在1981年作为食用螺引入中国2。福寿螺以植物性饲料3为主，主食各种水生植物、陆生草类和瓜果蔬菜，如各种浮萍、水花生、水葫芦、青菜、青草、瓜皮、水果等，也食人工投
31、喂的糠麩、饼粕类饲料及下脚料等，在食物缺乏的时候也摄食一些残渣剩饵和腐殖质及浮游动植物。但由于人们对福寿螺的危害性4缺乏认识，盲目引进，管理不当，同时该物种有生活适应性强、生长迅速、繁殖快等特点5，很快成为危害巨大的外来入侵物种，现已对农业以及生态造成巨大危害6。因此围绕该物种各行业展开了一系列研究。对于福寿螺及其卵，不同的研究者就不同的方面进行了少量的研究，比如，张刚生7研究了福寿螺卵壳的化学组成；毛孙忠8等对福寿螺纤溶酶的进行分离纯化并研究了其性质。HEARS等9首次报道了福寿螺卵中具有防止入侵的活性成分，该成分能对卵提供化学防护，对小鼠具有神经毒性作用的活性成分。总得来说，对于福寿螺的研
32、究还不够系统，也不够深入。事实上福寿螺体内和卵中具有丰富的生物活性物质，包括消化系统内的消化酶类10,11,12，体内的抗菌活性的多肽、免疫功能的酶类，以及卵中的强抗氧化和防入侵等活性成分。MARCOS等13研究发现卵红蛋白在福寿螺卵抗氧化损伤保护系统中具有重要作用，且这种胡萝卜素糖脂蛋白中类胡萝卜素成分与其抗氧化能力息息相关。人们普遍接受，类胡萝卜素可以作为抗氧化剂，特别是在胞膜形式14下虾青素是一种有力的抗氧化的模型。类胡萝卜素（CAROTENOID）是一类广泛存在于自然界中的天然有色物质，通常是指40碳的碳氢化合物（胡萝卜素）和它们的氧化衍生物（叶黄素）两大类色素的总称，其颜色通常为黄色
33、到红色，属于脂溶性四萜烯类化合物15。类胡萝卜素一般可分为两类胡萝卜素和叶黄素16。前者以胡萝卜素为代表，仅含碳、氢两种元素，后者则是前者的含氧衍生物，如虾青素。而我们研究的福寿螺卵中类胡萝卜素就是虾青素的一种。类胡萝卜素在生物体中能够表现出许多生物学功能17，是一种良好的自由基淬灭剂，具有显著的抗氧化性，可以有效地阻断细胞内的自由基链式反应18，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、防癌方面和预防心血管疾病、白内障方面有显著作用，并能防止老化和衰老引起的多种退化性疾病，因而被认为是治疗和预防这些顽疾的理想药物19。类胡萝卜素化合物以其独特的生物活性引起了国内外功能性食品和药品
34、的开发热20。其中胡萝卜素21具有营养增补剂和食品着色剂的双重功效，被广泛用作饮料、食品及饲料添加剂。胡萝卜素的生产方法有化学合成法和天然胡萝卜素生产法两种。而提取是天然色素生产中较为关键的工序22之一，其中的影响因素也较多，例如提取工艺的流程，提取溶剂的选择。一般常见的提取方法有有机溶剂提取法23、酶反应法24、微波辅助提取法25、超声波辅助提取法26、超临界流体萃取法27等。本研究先对福寿螺卵的基本理化性质进行检测，预估其提取特点，再对其中的类胡萝卜素进行初步提取，确定合适的提取溶剂体系。接着对福寿螺卵中提取的类胡萝卜素进行薄层色谱和分光光度法分析，比较从福寿螺卵提取类胡萝卜素的经济性。最
35、后结合众多文献的经验，对溶剂体积比、提取温度、提取时间、和是否进行超声波这些因素进行单因素、部分因子和响应面分析试验，进行提取条件的优化。22材料与方法21主要试剂与设备211主要试剂柠檬酸（C6H8O7H2O）分析纯上海试剂四厂昆山分厂磷酸氢二钠（NA2HPO412H2O）分析纯湖州化学试剂厂无水乙酸钠（CH3COONA）分析纯上海国药集团化学试剂有限公司冰乙酸（CH3COOH）分析纯上海国药集团化学试剂有限公司无水硫酸铵分析纯上海国药集团化学试剂有限公司甲醇分析纯上海国药集团化学试剂有限公司石油醚分析纯上海国药集团化学试剂有限公司氯仿分析纯上海国药集团化学试剂有限公司丙酮分析纯上海国药集团
36、化学试剂有限公司乙醇乙酸乙酯乙酸抗坏血酸分析纯分析纯分析纯分析纯上海国药集团化学试剂有限公司上海国药集团化学试剂有限公司上海国药集团化学试剂有限公司上海国药集团化学试剂有限公司硫酸亚铁分析纯上海国药集团化学试剂有限公司醋酸钠分析纯上海国药集团化学试剂有限公司三氯化铁TPTZ（三吡啶三吖嗪）分析纯上海国药集团化学试剂有限公司SIGMA公司生产212主要设备新型电热恒温鼓风干燥箱密封式恒温可调电炉CARY100紫外/可见光分光光度计电子天平AB204S电子天平PH33C型PH计宁波江南仪器厂嘉兴市欣欣仪器设备有限公司美国瓦里安公司余姚市金诺天平仪器有限公司上海台衡仪器仪表有限公司上海雷磁仪器有限公
37、司DKS22电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司旋涡混合器杭州泰林生物技术设备有限公司BIOGELP100BIORAD公司MICROCONYM30超滤浓缩离心管上海索莱宝生物科技有限公司CARY100紫外/可见光分光光度计UVVISIBLE公司SOEVALLSTRATOS冷冻高速离心机上海纳诺仪器有限公司冰箱海尔集团有限公司22福寿螺卵的基本理化性质不同样品因为其中水分、脂肪、蛋白质的含量不同，直接影响对其中物质的提取方式和提取效果，因此实验最初对样品福寿螺卵进行了基本理化性质的分析，测定了其水分、灰分、脂肪和蛋白质的百分含量。3221卵的采集及卵研磨液的制备在水塘、芦苇荡1等福寿螺卵高产地
38、中，选择颜色鲜艳、产期靠近的新鲜福寿螺卵进行采集。利用剪刀等工具剪下一段卵块依附的枝干以避免卵的破裂，从而保持卵块的完整性。将采集的卵块放入保鲜袋中，置于冰箱冷藏室中进行保藏待用。需要时称取适量的福寿螺卵块，在室温中静置片刻，待卵块略解冻后放入研钵中进行研磨，至研磨液均匀，没有明显的卵粒或者卵壳。研磨液现配现用，注意避免与空气的长时间接触而造成类胡萝卜素的损失。222水分含量的测定取5G福寿螺卵研磨液用干燥法测定其水分含量28。223灰分含量的测定取5G福寿螺卵研磨液测定其灰分含量28。224脂肪含量的测定取5G福寿螺卵研磨液用索氏抽提法测定其脂肪含量28。225蛋白质含量的测定取5G福寿螺卵
39、研磨液用凯氏定氮法测定其蛋白质含量28。23福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的选择231福寿螺卵标准液的配制精确称取100G均匀的福寿螺卵研磨液，分别装入50ML离心管中，配平后，在高速冷冻离心机中以5000RPM的转速离心15MIN，取中间的澄清液，倒入100ML的容量瓶中，注意避免上层泡沫进入容量瓶。向离心管中加入少量的蒸馏水，盖好盖后，摇匀，继续用5000RPM的转速离心15MIN，将中间的澄清液倒入容量瓶中。重复上述步骤至离心管的泡沫和沉淀不为鲜红色为止，再用蒸馏水定容至100ML，标准液配制完成。标准液如不立即使用，必须放入冰箱保藏室，防止类胡萝卜素的氧化。232提取溶剂的选择类胡萝卜素为
40、多烯类的脂溶色素，一般不溶于水，而易溶于脂溶性有机溶剂，然而不同的浸提溶剂对类胡萝卜素成分的溶解性不同，提取效果也不一样29。为充分将原料中的色素提出，本实验采用一系列不同极性的溶剂，如丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷丙酮混合液及氯仿甲醇混合液等，以提取物中类胡萝卜素的含量为指标，筛选出提取效果最好的溶剂体系。吸取2ML福寿螺卵标准液，分别加入编号离心管中，再加入6ML对应的不同溶剂，充分振荡05H，放入离心机中以5000RPM的转速离心15MIN。233测定方法由于类胡萝卜素的分子结构中存在类异戊二烯共轭双键，故吸光性能强，在400500NM内有强的吸收，对类胡萝卜素进行紫外可见光光谱扫描在4
41、86NM处有最大吸收值。因此，采用分光光度法对提取结果进行测定。由于标准胡萝卜素不稳定性，给标准曲线的制备带来困难，而采用02G/LK2CR207标准溶液制备的标准曲线，与胡萝卜素标准曲线完全吻合，并操作简便，重现性好。因此，本试验以K2CR207为标样，在486NM波长处测定吸光度，绘制标准曲线。24福寿螺卵类胡萝卜素与胡萝卜素的比较241胡萝卜素的提取经上述实验可确定，提取福寿螺卵类胡萝卜素的最佳提取剂为氯仿甲醇（体积比为13）。称取2ML4胡萝卜研磨液，加入离心管中，加入6ML氯仿甲醇（体积比为13），充分振荡半小时，放入离心机中以5000RPM的转速离心15MIN，测胡萝卜素提取液紫外
42、吸收光谱。242福寿螺卵类胡萝卜素与胡萝卜素薄层色谱比较向由氯仿甲醇（体积比为13）提取的福寿螺卵类胡萝卜素和胡萝卜素提取液中分别加入足量无水硫酸钠脱水。以石油醚丙酮（体积比为10035）试剂作展开剂，对两者做薄层色谱分析比较。25福寿螺卵类胡萝卜素的抗氧化评价将标准液稀释5个梯度，然后进行抗氧化总值的测定，并与抗坏血酸的抗氧化能力进行比对，判定福寿螺卵中的类胡萝卜素是否具有作为食品添加剂广泛应用的潜质。251FRAP法测定总抗氧化活性采用FRAP法评价被测样品的总抗氧化能力，因为抗氧化活性物质将FE3还原为FE2，FE2与TPTZ（三吡啶三吖嗪）结合生成明显的蓝色络合物，在593NM处有最大
43、吸收光，根据吸光度的大小来计算样品的总抗氧化能力。FRAP工作液的配制03MOL/LPH为36的醋酸盐缓冲液，100MMOL/LTPTZ溶液，20MMOL/LFECL3溶液，按1011的比例混合，现配现用。操作步骤FRAP工作液使用前在37水浴预热，取3ML，加150L不同浓度样液，300L去离子水，在37水浴锅中反应10MIN，以去离子水代替样液调零，在593NM测吸光度。根据还原力标准曲线，将达到相同吸光度所需的FESO4浓度记为FRAP值，表示总抗氧化能力的大小。252FESO4标准曲线的绘制浓度梯度为50，100，200，400，800，1000MOL/L的FESO4溶液，以FESO4
44、溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制。253抗氧化总值与抗坏血酸对比测定浓度梯度为0，4，8，12，16，20G/ML的抗坏血酸测定抗氧化总值，测定浓度梯度为0，002，004，006，008，010（设标准液浓度为1）的福寿螺卵溶液，绘制趋势图，比较两者的抗氧化能力。26福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的优化提取是天然色素生产中比较重要的工序，提取工艺是否合理，溶剂选择是否恰当，直接关系到产品的产量和质量，也影响后面工序的进行29。对福寿螺卵中类胡萝卜素的提取，根据提取物得率，提取液的浓度，对各种提取方法的优劣进行评价，从而筛选出合适的提取工艺。261优化工艺条件在溶剂选择的基础上，对所选定的溶剂
45、体系的溶剂体积比进行调节，并结合提取温度、提取时间、是否微波等因素进行单因素、部分因子和中心组合设计试验。通过测定提取剂不同层的比色值，推断出提取剂中提取的类胡萝卜素的含量，换算出提取率，从而对福寿螺卵中的类胡萝卜素的提取条件进行评价，进一步优化工艺条件。262提取液浓度的计算将提取液取出，置于1CM比色皿中，同标准曲线制备方法，在486NM处测定吸光度，通过之前得到的重铬酸钾标准曲线及其公式，算出提取液浓度。53结果与讨论31福寿螺卵的基本理化特性福寿螺卵的基本理化性质测定结果见下表311至表314，即福寿螺卵的水分含量为7605，灰分含量为1397，脂肪含量为069，蛋白质含量为122。表
46、311福寿螺卵的水分含量TABLE311THEMOISTURECONTENTOFAPPLESNAILEGGS编号123样品质量（G）500275003650039样品干燥后质量（G）118641203012052样品中水分含量（）762848759573759148样品的平均水分含量（）760523表312福寿螺卵的灰分含量TABLE312THEASHCONTENTOFAPPLESNAILEGGS编号123样品质量（G）500395010850028样品中灰分质量（G）070630694606965样品中灰分含量（）141150138621139222样品中平均灰分含量（）139664表313
47、福寿螺卵的脂肪含量TABLE313THEFATCONTENTOFAPPLESNAILEGGS编号123样品量（G）530775340353069样品中脂肪质量（G）003710037500366样品中脂肪含量（）069900702206897样品中平均脂肪含量（）06970表314福寿螺卵的蛋白质含量TABLE314THEPROTEINCONTENTOFAPPLESNAILEGGS编号空白123样品质量（G）0500175001050034消耗盐酸标准滴定液（ML）020462450434盐酸标准滴定液浓度（MOL/L）09648样品中蛋白质的含量（）125931225311791样品中平均蛋
48、白质含量（）1221232福寿螺卵类胡萝卜素提取方法的确定6重铬酸钾标准曲线见图321，线性方程Y02626X00036，R209874，在01G08G/ML范围内有良好线性关系。采用分光光度法对不同试剂的提取结果进行测定，根据吸光值在标准曲线中得出福寿螺卵类胡萝卜素的提取量。最终确定氯仿甲醇（体积比为13）提取效果最佳。图321重铬酸钾标准曲线FIGURE321THESTANDARDCURVEOFK2CR207表321不同提取剂提取液的吸光值TABLE321THEABSORBANCEOFEXTRACTINDIFFERENTEXTRACTIONAGENTS提取剂吸光值（486NM）水1177水
49、（抽滤）乙酸乙酯16481101氯仿乙醇甲醇096205640259丙酮1999正己烷丙酮（11）石油醚丙酮（11）乙酸丙酮（11）229119050984氯仿甲醇（13）氯仿甲醇（12）3766130333福寿螺卵类胡萝卜素与胡萝卜素的比较分析7图331福寿螺卵类胡萝卜素提取液光谱图FIGURE331THESPECTROGRAMOFCAROTENOIDSEXTRACTINAPPLESNAILEGGS图332胡萝卜胡萝卜素提取液光谱图FIGURE332THESPECTROGRAMOFCAROTENEEXTRACTINCARROTS图331和图332分别为福寿螺卵类胡萝卜素和胡萝卜中胡萝卜素在氯仿甲醇（体积比13）体系中提取液的光谱图，可以看到福寿螺卵类胡萝卜素的两个波峰分别为在486NM时，吸光值为4752，以及241NM时，吸光值为5938；而胡萝卜中胡萝卜素的两个波峰分别为在472NM时，吸光值为0288，以及在209NM时，吸光值为2484。通过比较，我们可以明显知道福寿螺卵中类胡萝卜素与胡萝卜中胡萝卜素的最大吸收峰波长不同，并且两者最大吸光值差距很大。就此数值进行比较，可初步确定福寿螺卵中类胡萝卜素的含量较胡萝卜中胡萝卜素中高。因为众所周知类胡萝卜素
