1、骨髓间充质干细胞（BMSCs）的 PERCOLL 分离培养法原代培养：1. 取体重 150200 g 的大鼠，1% 的戊巴比妥钠腹腔注射或乙醚吸入麻醉，颈椎脱臼处死，75 % 的酒精浸泡消毒 5 min。2. 将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有 75% 酒精的离心管或烧杯中，移入超净台。3. 将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入 10 ml DMEM 完全培养基，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。4. 将剥离干净的骨头用少量 PBS 冲洗后，放入另一培养皿，加入
2、12 ml DMEM 完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用 2 ml 注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。5. 另取干净离心管 A，加入 10 ml PERCOLL 淋巴细胞分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜 30o 缓缓加入，切记不能冲破 PERCOLL分离液面，用 8 ml DMEM 完全培养基冲洗培养皿，同样加入离心管 A。6. 25003000 r/min，30 min 离心后，可见 A 中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管 B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红
3、细胞吸上来。7. 将 20 ml PBS 加入离心管 B，反复吹打混匀，1800 r/min 离心 10 min。8. 弃上清，重复步骤 7。9. 弃上清，加入 2030 ml（视计数情况而定，一般一只老鼠一个25 cm2 培养瓶）完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。传代、冻存 （25 cm2 培养瓶）：1. 当细胞融合度到达 90% 左右时，将培养液吸出，加入 PBS 冲洗细胞两次。2. 加入 0.25% 的胰酶 2 ml，置于 37培养箱中 23 min，取出在显微镜下观察，当 8090% 的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。3. 传代：加入 3 ml DMEM 完全培养基终
4、止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心 10 min。弃上清，加入 10 ml 培养基吹打混匀。分种于两个培养瓶中。4. 冻存：加入 3 ml DMEM 完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心 10 min。弃上清，加入 1 ml 冻存液吹打混匀，置于冻存管中 （4 3040 min，-20 1 h，80过夜，再移入液氮罐中） 。5. 复苏：1) 将细胞从液氮中取出，37轻微摇晃，使细胞快速融化。2) 75 酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，1000 r/min 5 min。3) 弃上清，加入 5 ml 完全培养基混匀细胞，接种于 25 cm2 培养瓶中。液体配置：DMEM完全培养基：L-DMEM，10% CS（L-DMEM+10% FBS原代培养用）。冻存液：10 % DMSO+20 % FBS+70 % L-DMEM细胞换液步骤1. 将废液缸放入超净台，开启紫外灯消毒 20 min，然后开风吹 5 min。2. 清洁双手。3. 按规范步骤进入细胞培养室（实验服，75%乙醇擦拭双手）4. 打开细胞培养箱取出细胞，拧紧瓶盖。从冰箱取出培养基。一起放入超净台。5. 将培养瓶内的培养基倒出，然后加入新培养基，拧紧瓶盖，放入培养箱（瓶盖要拧松）6. 收拾超净台，培养基放回原处。
