1、本科毕业论文系列开题报告生物工程雨生红球藻色素累积的生化调控一、选题的背景与意义虾青素是一种近年来进入国际研发领域的红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界，尤其是海洋生物体内，其抗氧化能力比其他类胡萝卜素强10倍，比维生素E强550倍，被誉为“超级维生素E”。虾青素的着色能力显著，并具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等一系列重要的生理功能，鉴于此，它被广泛应用于保健品、医药、水产养殖等领域，具有广阔的应用前景。雨生红球藻中虾青素的积累量可高达细胞干重的24,，被认为是自然界中天然虾青素含量最高的生物，利用红球藻来生产虾青素具有巨大的发展前景。雨生红球藻累积虾青素是为了保护自身细胞免受氧化作用和高光强等环
2、境胁迫作用的伤害，而在此种条件下是不利于生物量的大量累积的，因此解决生物量积累与虾青素积累这一矛盾问题便成为解决红球藻高效生产虾青素的关键。所以课题研究雨生红球藻色素累积的生化调控有助于解决该问题。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题利用UPLCQTOFMS分析系统，建立雨生红球藻虾青素定性与定量分析；利用建立的方法对雨生红球藻不同生化调控因子下虾青素及其酯类化合物进行分析。主要解决问题1、确立雨生红球藻虾青素提取方法；2、建立雨生红球藻虾青素分析方法；3、利用建立的方法对雨生红球藻不同生化调控因子下虾青素及其酯类化合物进行定量分析。三、研究的方法与技术路线研究的方法本研究首先确定雨生红球藻的
3、培养条件，然后收集不同生化调控因子（拟采用亚铁离子与过氧化氢因子）下红色的雨生红球藻样品，接下来提取虾青素并用高效液相色谱质谱技术对虾青素及其酯类化合物进行结构鉴定及定量分析。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月2012月15日更多地收集并阅读与该课题相关的中英文资料，对实验进行设计并制订出详细的研究方案，撰写开题报告与文献综述。2010年12月15日2月28日充分阅读相关的文献，翻译2篇英文文献。开始雨生红球藻的培养和收集实验。2010年3月1日4月15日建立虾青素提取方法及虾青素分析方法，上样分析，统计分析相关的数据，开始撰写论文初稿交导师评阅。2010年4月16日21日在导师
4、指导下修改论文，完成二稿，交指导师再次修改。2010年4月21日5月2日查找论文中的不足，完善论文并定稿，参加论文答辩。五、主要参考文献1滕长英,张立,缪静等雨生红球藻虾青素积累机制的研究进展J海洋科学,2006,301277812董庆霖,邢向英,赵学明光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响J水生生物学报,2007,313培养雨生红球藻收集不同生化调控因子下红色的雨生红球藻样品建立雨生红球藻虾青素及其酯类化合物UPLCQTOFMS分析方法分析雨生红球藻中虾青素的组成和结构，比较不同生化因子下虾青素含量确定使虾青素积累更快更稳定的调控方法4454473陈书秀,梁英光照强度对雨生红球藻叶绿素荧光特性
5、及虾青素含量的影响J南方水产,2009,51174董庆霖,赵学明,邢向英强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响J高校化学工程学报,2007,2146856885蒋霞敏,柳敏海,沈芝叶温度、光照与盐度对雨生红球藻诱变株虾青素累积的调控J中国水产科学,2005,1267147186任长江光强对雨生红球藻生长的影响J河南师范大学学报自然科版,2009,3661111137苗凤萍,李夜光,耿亚红等温度对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS生物量和虾青素产量的影响J武汉植物学研究,2005,23173768CAIMINGGANG,LIZHE,QIANXIANGEFFECTSOFIRONEL
6、ECTROVALENCEANDSPECIESONGROWTHANDASTAXANTHINPRODUCTIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJCHINESEJOURNALOFOCEANOLOGYANDLIMNOLOGY2009,2723703759高政权,孟春晓,王栋FE2,醋酸盐和双氧水对雨生红球藻积累虾青素的影响J上海水产大学学报,2007,16433434010李涛,李爱芬,张成武等FE3对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS生长及荧光特性的影响J武汉植物学研究,2009,27664364911梁英,陈书秀温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响
7、海洋湖沼通报J2009,311212012董庆霖,赵学明,邢向英等盐胁迫诱导雨生红球藻合成虾青素的机理J化学工程,2007,351454713蒋霞敏,柳敏海,任凯来化学因子对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控J宁波大学学报理工版,2005,9330631214MKOBAYASHIINVIVOANTIOXIDANTROLEOFASTAXANTHINUNDEROXIDATIVESTRESSINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJAPPLMICROBIOLBIOTECHNOL,2000,5455055515王劲,段舜山活性氧对雨生红球藻生长及虾青素含量的影响J生态科学
8、,2006,25321322116董庆霖,赵学明,邢向英乙酸钠诱导雨生红球藻合成虾青素的机理J微生学报,2007,3422566017孟春晓,高政权,叶乃好2,4二氯苯氧乙酸2,4D对雨生红球藻中虾青素积累的影响J微生物学通报2008,35121884188718高政权,孟春晓,刁英英施用水杨酸对雨生红球藻中虾青素积累的影响J水产科学,2007,26737738019高政权,孟春晓,车青添加萘乙酸NAA对雨生红球藻中虾青素积累的影响J黑龙江畜牧兽医,2007,11596220孟春晓,高政权外源脱落酸ABA对雨生红球藻中虾青素积累的影响J黑龙江畜牧兽,2007,7686921高政权,孟春晓外源乙
9、烯利对雨生红球藻中虾青素积累的影响J食品科学,2007,281037638022FENGPINGMIAO,DAYANLU,YEGUANGLIETALCHARACTERIZATIONOFASTAXANTHINESTERSINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJANALYTICALBIOCHEMISTRY,2006,35217618123HARKERM,TSAVALSAJINHIBITIONOFASTAXANTHINSYTHESISINGR
10、EENALGA,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIORESOURTECHNOL,1996,553207214毕业论文文献综述生物工程雨生红球藻积累虾青素的研究进展摘要本文探讨了影响雨生红球藻虾青素累积的因素，如光照、温度、营养盐、活性氧、植物激素和其它因子。并对雨生红球藻生产应用的前景做展望。关键词雨生红球藻；虾青素；生化调控雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻在多种不适宜生长的外界环境条件下能积累大量次生类胡萝卜素，其中80以上为虾青素ASTAXANTBIN及
11、其酯类。虾青素是一种近年来进入国际研发领域的红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界，尤其是海洋生物体内，其抗氧化能力比其他类胡萝卜素强10倍，比维生素E强550倍，被誉为“超级维生素E”。虾青素的着色能力显著，并具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等一系列重要的生理功能，鉴于此，它被广泛应用于保健品、医药、水产养殖等领域，具有广阔的应用前景。雨生红球藻中虾青素的积累量可高达细胞干重的24,，被认为是自然界中天然虾青素含量最高的生物，利用红球藻来生产虾青素具有巨大的发展前景1。雨生红球藻累积虾青素是为了保护自身细胞免受氧化作用和高光强等环境胁迫作用的伤害，而在此种条件下是不利于生物量的大量累积的，这便成为限
12、制红球藻高效生产虾青素的根本问题。1影响雨生红球藻虾青素累积的因素11光照光照是红球藻诱导虾青素大量积累的重要因子，高强度光照下虾青素的合成会得到促进27。董庆霖等在研究中得出强光照射诱导雨生红球藻合成虾青素的机理在于其提高了1，5二磷酸核酮糖羧化酶和硝酸还原酶活性，导致硝酸盐浓度迅速降低而最终又抑制了这两种酶的活性，造成雨生红球藻碳代谢光合作用及氮代谢效率大幅度下降，即“碳饥饿”和“氮饥饿”。在此状态下，为了生存，细胞内合成虾青素的相关基因被激活，藻细胞开始并积累合成虾青素以抵御不良的环境条件2。许多研究者认为，红球藻中虾青素大量合成的诱发因子可能是光合反应引起的氧胁迫，而不是光本身。尽管高
13、强度光照是虾青素合成的重要因子，但光照并不是虾青素合成的必要条件，在异养,没有光照条件下它也能以较慢的速度合成虾青素。12温度红球藻适宜的生长温度为20左右，提高温度有利于红球藻中虾青素的积累510。苗凤萍等在研究中发现22与25时的红球藻中虾青素的含量和产量最大，且样本中虾青素的产量及含量变异度较小，这说明雨生红球藻累积虾青素的最适温度范围在2225之间，因此在生产实践中，我们可考虑将温度控制在22与25左右，以使虾青素产量达到最高，获得最佳经济效益8。随着温度的不断升高，生物量与虾青素含量都经历了一个上升一最高一下降的过程，但是两者的变化却有所不同与最适温度时相比，温度升高和降低都使生物量
14、显著降低，28和18时的生物量基本一样，比25时降低了一半，但是低温比高温对虾青素含量的影响更大，15时虾青素的含量比25时降低了65，而28时只降低了17。低温对虾青素产量的影响是通过同时降低生物量和虾青素含量而起作用，而高温对虾青素含量的影响并不很大，主要是通过降低生物量而影响虾青素的产量8。13营养盐许多实验表明营养盐的缺乏会对雨生红球藻积累虾青素造成影响1115。董庆霖等提出盐胁迫诱导雨生红球藻合成虾青素的机理在于高浓度的氯化钠抑制了NR的活性，导致细胞内氮源供应不足即“氮饥饿”；高浓度的氯化钠和“氮饥饿”，二者都直接和间接地抑制1，5二磷酸核酮糖羧化酶的活性，并由此导致二氧化碳固定量
15、的减少碳饥饿，表现为细胞生长速率下降或停止生长。在此代谢状态下，为了生存雨生红球藻细胞内虾青素合成的相关基因被激活，开始合成并积累虾青素11。这与他们在光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响研究中得出的结论基本一致。蒋霞敏等在实验中得出缺氮条件能诱导红球藻的虾青素的形成。磷、铁离子对雨生红球藻虾青素的累积也有明显的促进作用。证明了在正常生长的红球藻中施加磷胁迫、铁胁迫都诱导虾青素的合成，推测是由于缺磷、缺铁使得红球藻生长不利，促使绿色的游动孢子向红色的静孢子转换，从而导致类胡萝卜素的大量累积12。14活性氧许多实验发现雨生红球藻积累虾青素与体内活性氧有关。在王劲等实验中发现1诱生剂亚甲基蓝MB能
16、够提高雨生红球藻虾青素含量，在添加浓度为107MOLL时，虾青素含量显著提高。2三种活性氧1O2,H2O2,OH均对雨生红球藻细胞生长有抑制作用，但MB对细胞生长的抑制作用小于H2O2和OH诱生剂16。15植物激素许多研究发现植物生长激素对雨生红球藻积累虾青素有促进作用1724。孟春晓等在研究中发现一定浓度的2，4D可能对雨生红球藻细胞积累虾青素存在影响，低浓度2，4D可能促进雨生红球藻细胞分裂而抑制虾青素积累；而高浓度2，4D却可能通过抑制雨生红球藻细胞分裂而促进虾青素积累，因为在雨生红球藻中藻细胞生物量的积累和虾青素的积累总是一对矛盾体。在研究中，添加200MGL的2，4D对雨生红球藻积累
17、虾青素具有明显的促进作用17。高政权等在实验中得出1一定质量浓度的水杨酸能促进雨生红球藻积累虾青素。25MGLSA处理能显著促进雨生红球藻积累虾青素比对照组提前23D；且虾青素产量比对照组提高758。310MGLSA处理对雨生红球藻积累虾青素有较强的促进作用比对照组提前L3D，但它对藻细胞有一定的副作用；而高质量浓度的SA1520MGL对藻细胞有强烈的致死作用18。其它植物激素如萘乙酸19，脱落酸20，乙烯利21，6一苄氨基嘌呤22等对雨生红球藻积累虾青素的影响也有相关报道。16其它因素李立欣等的研究结果中得出在BBM培养基中复合添加VB1、VB12和VH均能不同程度地促进雨生血球藻游动细胞的
18、生长。添加VB12VH可以显著提高细胞密度值、虾青素质量浓度,其他处理组促进效果次之25。除以上各影响因素外，干燥1、机械胁迫1、稀土元素CE26等也会促进虾青素的积累。2小结影响雨生红球藻累积虾青素的因子众多，现在有较多研究的有光照，温度，营养盐，活性氧，植物激素等，但是各因子之间的交互作用的研究较少。3展望目前虾青素作为天然色素和生物活性物质受到了极大的重视，具有广阔的应用前景和巨大的市场。随着人们对雨生红球藻虾青素积累条件、生理生化过程、酶学基础以及基因表达水平等认识的逐步清晰以及基因工程手段的逐步成熟，将会根本性地改变雨生红球藻虾青素生产的限制问题。参考文献1滕长英,张立,缪静等雨生红
19、球藻虾青素积累机制的研究进展J海洋科学,2006,301277812董庆霖,邢向英,赵学明光照强度对雨生红球藻合成虾青素的影响J水生生物学报,2007,3134454473陈书秀,梁英光照强度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响J南方水产,2009,51174董庆霖,赵学明,邢向英强光照对雨生红球藻合成虾青素的影响J高校化学工程学报,2007,146856885蒋霞敏,柳敏海,沈芝叶温度、光照与盐度对雨生红球藻诱变株虾青素累积的调控J中国水产科学,2005,1267147186任长江光强对雨生红球藻生长的影响J河南师范大学学报自然科版,2009,3661111137PARK,EUNKY
20、UNG,CHOULGYUNLEEASTAXANTHINPRODUCTIONBYHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERVARIOUSLIGHTINTENSITIESANDWAVELENGTHSJJMICROBIOLBIOTECHNOL2001,116102410308苗凤萍,李夜光,耿亚红等温度对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS生物量和虾青素产量的影响J武汉植物学研究,2005,23173769梁英,陈书秀温度对雨生红球藻叶绿素荧光特性及虾青素含量的影响海洋湖沼通报J2009,311212010TERENCEJEVENS,RANDALLPNIEDZ,GARY
21、JKIRKPATRICKTEMPERATUREANDIRRADIANCEIMPACTSONTHEGROWTH,PIGMENTATIONANDPHOTOSYSTEMIIQUANTUMYIELDSOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISCHLOROPHYCEAEJJAPPLPHYCOL,2008,2041142211董庆霖,赵学明,邢向英等盐胁迫诱导雨生红球藻合成虾青素的机理J化学工程,2007,351454712蒋霞敏,柳敏海,任凯来化学因子对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控J宁波大学学报理工版,2005,9330631213董庆霖,赵学明,邢向英乙酸钠诱导雨生红球藻合成虾青素的机理J微
22、生学报,2007,34225626014高政权,孟春晓,王栋FE2,醋酸盐和双氧水对雨生红球藻积累虾青素的影响J上海水产大学学报,2007,16433434015李涛,李爱芬,张成武等FE3对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS生长及荧光特性的影响J武汉植物学研究,2009,27664364916王劲,段舜山活性氧对雨生红球藻生长及虾青素含量的影响J生态科学,2006,25321322117孟春晓,高政权,叶乃好2,4二氯苯氧乙酸2,4D对雨生红球藻中虾青素积累的影响J微生物学通报2008,35121884188718高政权,孟春晓,刁英英施用水杨酸对雨生红球藻中虾青素积累的
23、影响J水产科学,2007,26737738019高政权,孟春晓,车青添加萘乙酸NAA对雨生红球藻中虾青素积累的影响J黑龙江畜牧兽医,2007,11596220孟春晓,高政权外源脱落酸ABA对雨生红球藻中虾青素积累的影响J黑龙江畜牧兽,2007,7686921高政权,孟春晓外源乙烯利对雨生红球藻中虾青素积累的影响J食品科学,2007,281037638022高政权,孟春晓,刘涛6苄氨基嘌呤对雨生红球藻中虾青素积累的影响J水利渔业，2007,276212623崔宝霞,钟方旭植物生长调节剂对雨生红球藻细胞增殖及虾青素积累的影响J水产科学,2008,27947848224韩春梅,刘建国,张勇不同激素配
24、伍对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS细胞生长和虾青素累积的调节作用J藻株差异及应用海洋与湖沼,2009,40443043625李立欣,段舜山,战友复合维生素对雨生血球藻生长及虾青素积累的影响J黑龙江科技学院学报,2009,191121526李哲,蔡明刚,黄水英等稀土元素CE对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究J海洋科学,2008,3293741本科毕业设计（20_届）雨生红球藻色素累积的生化调控目录1引言22材料与方法221藻种222雨生红球藻扩种培养条件223仪器和试剂324研究方法3241活体吸光方法的确定3242虾青素提取和含量检测3243光合参数的测定325添加
25、硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控3251光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用3252添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用4253添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异426添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控4261添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征4262添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响53结果与分析531添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控5311光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用5312添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用9313添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异1032添加过氧化氢对
26、雨生红球藻累积虾青素的调控13321添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征13322添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响164结论19致谢错误未定义书签。参考文献20摘要雨生红球藻作为一种能大量积累虾青素的生物被广泛研究，但是还存在诸如品系差异、累积产率、累积时间、返绿问题、胁迫调控时对微藻的致害或生理活性的可能影响等问题，因此对雨生红球藻的生化调控及其研究是很有必要的。本实验在雨生红球藻培养液中添加FE2和H2O2两种生化因子，通过测定虾青素特定吸光值、虾青素含量和LCMS分析研究这两种生化因子对雨生红球藻生长和积累虾青素的影响。结果表明加入FE2的实验组含有的色素
27、种类上与空白组一样，两组之间并无差别。但是，比较两组样品数据，发现相对对照组而言，实验组中各色素含量均有一定程度的增加，说明FE2有利于色素的积累，加入二价亚铁离子，虾青素的合成能力也会增加。在H2O2实验中，发现实验组细胞有死亡现象，这可能是由于H2O2的强氧化性所致，在本实验所设置的两个浓度下，H2O2并未表现出对虾青素合成有促进作用（从OD值反映），也并未对雨生红球藻生理生化造成很大影响。关键词雨生红球藻；虾青素；调控；FE2；H2O2ABSTRACTASANORGANISMWHICHCANACCUMULATEASTAXANTHIN,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISHASBE
28、ENWIDELYSTUDIEDBUTSOMEISSUES,SUCHASSTRAINDIFFERENCES,CUMULATIVEYIELD,CUMULATIVETIME,BACKTOGREENISSUES,ORWHENUNDERSTRESSCONTROLTHATMAYAFFECTPHYSICALACTIVITYOFMICROALGAESTILLEXISTS,SOITISNECESSARYTOSTUDYTHEBIOCHEMICALREGULATIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISTHEEFFECTSOFTWOBIOCHEMICAFACTORFE2ANDH2O2ONTHEGROWT
29、HANDTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHINCONTENTWEREINVESTIGATEDTHERESULTSSHOWEDTHATEXPERIMENTALGROUPWHICHADDFE2CONTAINEDTHESAMEPIGMENTTYPEWITHTHECONTROLGROUPHOWEVER,FROMTHETWOGOUPSSDATA,WEFOUNDTHATRELATIVETOTHETHECONTROLGROUP,THEPIGMENTCONTENTINTHEEXPERIMENTALGROUPINCREASED,WHICHINDICATEDTHATFE2ISCONDUCIVET
30、OTHEACCUMULATIONOFPIGMENT,INADDITION,BYADDINGFERROUSION,THESYNTHESISOFASTAXANTHINCAPACITYINCREASEDINH2O2EXPERIMENT,ITSCAMETOTHERESULTTHATTHECELLSINTHEEXPERIMENTALGROUPHAVETHEPHENOMENONOFDEATHWHICHMAYBEDUETOSTRONGOXIDATIONCAUSEDBYH2O2INTHEEXPERIMENT,H2O2WITHTWOCONCENTRATIONSNEITHERSHOWEDSTIMULATIVEEF
31、FECTTOTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHINREFLECTFROMTHEODVALUE,NORHADAGREATIMPACTONTHEPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISKEYWORDSHAEMATOCOCCUSPLUVIALISASTAXANTBINCONTROLFE2H2O21引言雨生红球藻（HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS）是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻在多种不适宜生长的外界环境条件下能积累大量次生类胡萝卜素，其中80
32、以上为虾青素（ASTAXANTBIN）及其酯类。虾青素是一种近年来进入国际研发领域的红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界，尤其是海洋生物体内，其抗氧化能力比其他类胡萝卜素强10倍，比维生素E强550倍，被誉为“超级维生素E”。虾青素的着色能力显著，并具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等一系列重要的生理功能，鉴于此，它被广泛应用于保健品、医药、水产养殖等领域，具有广阔的应用前景。雨生红球藻中虾青素的积累量可强达细胞干重的24,，被认为是自然界中天然虾青素含量最强的生物，利用雨生红球藻来生产虾青素具有巨大的发展前景1。近年来，国内外从与虾青素合成有关的诱导条件、红球藻细胞的光合变化、细胞形态变化、微结构变
33、化、生化指标以及合成酶表达的分子调控等方面进行了分析研究，目前已经有大量相关的实验报道。利用雨生红球藻生产虾青素在生产过程中还存在很多的问题，比如品系差异、累积产率、累积时间、返绿问题、胁迫调控时对微藻的致害或生理活性的可能影响等问题，因此对雨生红球藻的生化调控及其研究是很有必要的。影响雨生红球藻累积虾青素的因子众多，现在有较多研究的有光照26，温度7,8，营养盐913，活性氧14,15，植物激素1621等。在微量元素中，铁是微藻所要求的最基本的元素之一，因为它参与硝酸盐和亚硝酸盐的同化、硫酸盐的还原、氮的固定、叶绿素的合成和许多其他生物的合成和降解反应。即便在营养丰富的环境中，铁缺乏也会限制
34、微藻的生长，加入亚铁离子会促进虾青素的合成2。据报道，雨生红球藻中虾青素的合成也与其细胞内的活性氧有关，溶解氧和多种活性氧分子都可以有效诱导细胞内虾青素的合成和积累。虾青素在细胞内可能起着抗氧化的作用，清除环境胁迫和过度氧化产生的活性氧，防止活性氧对细胞产生伤害3,4。前期研究和文献都表明，添加FE2、H2O2等可以明显促进雨生红球藻对虾青素的累积。但是，化学调控与其他因子的综合作用影响尚不明确，化学调控后对累积色素类型组成、生理活性等方面的影响尚待研究。本研究的目的是寻求实际应用中更合理的多因子调控组合以及因此形成藻类生理生化和产物特征的影响。2材料与方法21藻种雨生红球藻797株购自中科院
35、海洋所，雨生红球藻363株为本研究室前期研究改良株。22雨生红球藻扩种培养条件选用NMB3培养液培养雨生红球藻于3000ML三角瓶中。NMB3培养液配方（母液）KNO3100GK2HPO410GMNSO4025GFESO47H2O25GNA2EDTA20GVB1205LGVB15LG,溶解于1000ML蒸馏水。以1B1000淡水比例使用。培养淡水经045M醋酸纤维滤膜过滤后煮沸冷却得到。于6000LX光强，（222），12H/12H光暗周期下进行静止培养，每天手摇12次，直至培养到对数生长期。23仪器和试剂ACQUITY超强效液相色谱分析系统，配置ACQUITY自动进样器；QTOFPREMIE
36、R强分辨四极杆与飞行时间串联质谱仪（美国WATERS公司）；ACQUITYUPLCBEHC8色谱柱（100MM21MM，17M）（美国WATERS公司）；MASSLYNX41数据处理系统（美国WATERS公司）；超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）；LDZX50FB强压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；TDLSO2B飞鸽低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TP300超声波清洗机（北京泰拓公司）；漩涡混合器（上海精科实业公司）；WO系列恒温水浴锅、旋转蒸发器均为上海中顺生物科技公司产品；SHZD（）循环水式真空泵（义乌平华仪器公司）等。色谱纯氯仿、
37、甲醇、乙腈、甲酸（美国SIGMAALDRICH公司）；纯水由超纯水系统制备。24研究方法本研究分析培养藻液中添加FE2和H2O2对雨生红球藻虾青素累积和光合参数的影响，结合光照条件的变化，分析以人工调控方式促进雨生红球藻累积虾青素的作用大小、对生成的虾青素组分的变化影响、以及调控对微藻自身生理活性的部分影响。241活体吸光方法的确定以离体虾青素检测波长490NM为相对定量的活体吸光波长，检测雨生红球藻培养过程中虾青素的相对变化趋势。采用全波长扫描多功能酶标仪（美国THERMO公司）检测490NM下藻液OD值。242虾青素提取和含量检测取10ML藻液于离心管中，3000RPM离心10MIN，弃去
38、上清液，用5KOH30甲醇破坏叶绿素5MIN后离心去上清液，再离心弃去上清液，收集到得藻体沉淀转入研钵中研磨后加入10MLDMSO（30下）抽提5MIN，超声波振荡，用UV7504紫外可见分光光度计在490NM下测定虾青素含量A490。用公式C（MGL1）45A490VA/VB计算单位体积雨生红球藻的虾青素含量。式中A490表示虾青素提取液在490NM下的吸光度值；C表示虾青素含量；VA表示提取液的体积；VB表示用藻液体积单位为（GML1）。243光合参数的测定取藻液2ML，用AQUAPEN手持式荧光仪测定FT（光合有效辐射（光量子）产量）、F0暗处理、QY（FV/FM）、QY暗处理（FV/F
39、M）、CHL光吸收OD680OD720这5个光合作用参数。25添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控251光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用实验设置了低光照、强光照两种实验条件，研究光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用。取培养到对数期的藻液（797株和363株），在24孔板上每孔添加藻液2ML。使用FESO4作为添加剂，最后使FESO4终浓度分别为0MGL1、075MGL1、125MGL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中，每天手摇数次。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约
40、为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。252添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用实验在强光照（10000LX）条件下进行，设置了正常添加和延后添加（实验第4天添加FE2）两种实验条件，研究添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用。取培养到对数期的藻液（雨生红球藻797株），在24孔板上每孔添加藻液2ML。使用FESO4作为添加剂，最后使FESO4终浓度分别为0MGL1、075MGL1、125MGL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中，
41、每天手摇数次。培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。253添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异为了研究添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异设置本实验。培养雨生红球藻797株于1000ML三角瓶中，藻液体积800ML，添加FESO4，使终浓度为075MGL1。设置空白对照组，每组3个平行。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中。培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22，每天摇动数次。2531虾青素含量测定在实验第4天取10ML藻液测定虾青素含量
42、，与490NM测定的OD值形成对比。2532LCMS分析待藻细胞转红后收集，冷冻干燥后备用。取冷冻干燥的藻样01G液氮研磨充分后，用氯仿甲醇（11）提取，振荡均匀，于超声破碎仪中超声5MIN后以4000R/MIN离心10MIN，移取上清液于旋转蒸发瓶中，重复提取多次至藻泥颜色变浅，基本上呈无色，将上述所有上清液合并。所有提取液用旋转蒸发仪上以30蒸发至干。用15ML乙腈复溶后上仪器分析。注意所有的操作过程都要避光进行。使用SUNFIRETMC18色谱柱（250MM46MM，5M），进样量10L，柱温20。紫外采用全波段扫描，波长为300650NM，通道A紫外波长为480NM，通道B紫外波长设为
43、645NM。流动相为（A）水溶液和（B）甲醇乙腈异丙醇混合溶液（V/V/V，1/2/1），流速06ML/MIN，洗脱梯度为在5MIN内B从80升到100，保持70MIN后在1MIN内降到80，保持19MIN。QQQMS条件采用大气压化学电离源（APCI）正离子电离模式，放电电流4I，鞘气压力35PSI；辅助气流量5，去溶剂温度400，离子传输毛细管温度250，质谱扫描范围为2002000，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。26添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控261添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征设置了低光照、强光照两
44、种实验条件，研究光照在添加H2O2促进虾青素累积过程中的作用。取培养到对数期藻液（797株和363株），在24孔板上每孔添加藻液2ML。使用H2O2作为添加剂，最后使H2O2终浓度分别为0MOLL1、108MOLL1、106MOLL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期,光照强度约为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。262添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响H2O2有强氧
45、化性，为了研究H2O2是否会对雨生红球藻生理、生化产生影响，设置本实验，通过测定光合参数来表征。设置了低光照、强光照两种实验条件。培养雨生红球藻797株于250ML三角瓶中，藻液体积100ML，使用H2O2作为添加剂，最后使H2O2终浓度分别为0MOLL1、108MOLL1、106MOLL1。每组设置3个平行。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。使用AQUAPEN手持式荧光仪
46、测定FT、F0、QY、QY暗处理、OD值等光合作用参数。测定时间为分装前，分装后5小时，第2天，第3天，第4天。3结果与分析31添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控311光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用光照是红球藻诱导虾青素大量积累的重要因子，强强度光照下虾青素的合成会得到促进26。有研究发现强光照射诱导雨生红球藻合成虾青素的机理在于其提强了1,5二磷酸核酮糖羧化酶和硝酸还原酶活性，导致硝酸盐浓度迅速降低而最终又抑制了这两种酶的活性，造成雨生红球藻碳代谢（光合作用）及氮代谢效率大幅度下降，即“碳饥饿”和“氮饥饿”。在此状态下，为了生存，细胞内合成虾青素的相关基因被激活，藻细胞开
47、始并积累合成虾青素以抵御不良的环境条件2。3111雨生红球藻797株结果A强光照在FE2添加作用中的影响经过对7天测定的OD值进行整理，分析强光照在FE2添加作用中的影响。图1添加不同浓度FE2时，于强光胁迫条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG1THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTFE2CONCENTRATIONSINHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION从图1中我们可以看到13天，实验组与对照组OD值增长基本相当，差异
48、不大。第4天开始，低浓度组增长速度比高浓度组和空白对照组明显加快，此后差异不断增大，高浓度组和空白对照组始终差异不大。实验进行到第7天，低浓度组OD值比空白组提高了51，差异明显（P005）。表1强光照实验条件下，雨生红球藻797株虾青素含量测定（490NM）TAB1DETERMININGTHEASTAXANTHINCONTENTOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797IN490NMUNDERHIGHLIGHTINGCONDITION实验组对照组123123A490009600680081002900350032虾青素含量C（UGML1）043203060364501305015
49、750144平均值0367501438方差00026505000012154两组比较实验组增量是空白组增量的256倍图1反应的是在24孔板上，小体积，强光照培养雨生红球藻797，添加FESO4对其积累虾青素的影响。表1反应的是在强光照实验条件下，大体积（800ML藻液）培养雨生红球藻797，添加FESO4对其积累虾青素的影响。可以看到实验组（添加FESO4075MGL1）与空白对照组虾青素含量已有明显区别，这与图2所反应的情况一致。B弱光照在FE2添加作用中的影响强光照被大量报道会有力促进虾青素合成，但是在生产过程中，往往会面临是否可以不进行光胁迫就能通过生化调控促进虾青素累积的问题。本实验试图比较相同的化学调控处理时，强弱光照强度的影响。图2添加不同浓度FE2时，于弱光照条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG2THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTFE2CONCENTRATIONSINLOWLIGHTINGCONDITION在弱光照试验中，从图中我们可以看到实验组与空白对照组OD值变化差异不大，低浓度组与空白
