1、1本科毕业论文系列开题报告生物工程氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化一、选题的背景与意义随着我国经济的迅速发展和城市化进程的加快，大量的工农业废水、生活废水排入天然水体中，造成水体富营养化速度加快，污染现象严重。根据环境监测总站的报道，我国大部分地表水和城市河道受到了不同程度的污染，氮素污染是引起水体污染的重要原因之一，而氮素废水的超标排放是水体富营养化的主要原因。水体的富营养化对人体的健康和水中生物都是非常有害的，因此去除废水中的氮素显得尤为重要。氮主要以NH4、NO2、NO3等形式对水体造成污染，对氮素污染的治理方法有很多，而最经济且对环境友好的方法当推生物脱氮了。传统生物脱氮是由好氧条件下
2、的硝化作用与厌氧条件下的反硝化作用完成的。由于生物脱氮技术在很多方面都有无可比拟的优势，如可操作性强、投资少、见效快、无二次污染、废水达标排放可靠性强等优点，所以目前对废水中氮素的处理主要采用生物脱氮法。而生物脱氮法主要受脱氮菌剂的活性、温度、PH和DO等因素的影响，其中脱氮菌剂是最重要的影响因子，它直接决定了生物脱氮作用的强度和代谢反应的特征。而氨氧化菌的氨氧化能力是去除氨氮的主要因素，因此选育高效的氨氧化菌株，并研究其氨氧化作用的最佳条件，对于应用生物脱氮法去除氨氮具有重要的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）基本内容1氨氧化菌（AOB）高效菌株的分离、筛选及其生物学性质研究。
3、2AOB氨氧化作用最佳理化参数的测定如PH、起始氨氮浓度、溶解氧等，得出氨氧化细菌发挥氨氧化作用的最佳条件范围。（二）拟解决的主要问题1氨氧化菌（AOB）高效菌株的分离、筛选及其生物学性质研究。2AOB氨氧化作用的最佳理化参数的测定如PH、起始氨氮浓度、溶解氧等，得出氨氧化细菌发挥氨氧化作用的最佳条件范围。三、研究的方法与技术路线2（一）研究的方法本实验，从养殖塘表面底泥采取样品，用氨氧化菌选择培养基进行富集分离，筛选出高效的氨氧化细菌菌株。利用特异性引物对AMOAF和AMOAR扩增氨氧化过程的关键酶氨单加氧酶基因，同时，用引物对27F和1541R扩增16SRDNA，测序，测序结果在NCBI上
4、BLAST进行比对分析，并得出相应结果。测定所获菌株的氨氧化的氨氧化菌的氨氧化活性最佳理化参数（如溶氧量、PH、起始氨氮浓度等）。（二）研究的技术路线四、研究的总体安排与进度2008年8月10月查阅文献，收集相关资料。2008年11月12月设计实验的宏观技术路线，制定大体实验步骤。2008年12月2009年8月菌种的富集、分离及菌种保藏。2009年9月2010年4月氨氧化菌株的分子鉴定。2010年5月11月所获菌株的氨氧化活性的最佳理化参数的测定。2010年11月2011年3月整理数据，总结实验，论文写作。五、主要参考文献1胡安谊,焦念志氧化古菌环境微生物生态学研究的一个前沿热点J自然科学进展
5、,2009,19（4）37037832王家玲环境微生物学M北京高等教育出版社，19983BRANDESJA,DEVOLAH,DEUTSCHCNEWDEVELOPMENTSINTHEMARINENITROGENCYCLEJCHEMICALREVIEWS,2007,1075775894KOOPSHP,POMMERENINGROSERADISTRIBUTIONANDECOPHYSIOLOGYOFTHENITRIFYINGBACTERIAEMPHASIZINGCULTUREDSPECIESJFEMSMICROBIOLOGYECOLOGY2001,37195KUENENJG,JETTENMSMEXTRA
6、ORDINARYANAEROBICAMMONIUMOXIDIZINGBACTERIAJAMERICANSOCIETYFORMICROBIOLOGYNEWS,2001,674564636李君文,郑金来,福寰等一些硝化细菌的分离与鉴定同J应用与环境生物学报,2004,1067867897张玲华,邝哲师,张宝玲高效硝化细菌的富集培养与分离J浙江农业学报,2002,1463483508罗琼芳,徐恒,张学俊等一株氨氧化菌的分离及其生物学特性研究J四川大学学报,2006,4336836879LEMARCHANDK,BERTHIAUMEF,MAYNARDC,ETALOPTIMIZATIONOFMICROBI
7、ALDNAEXTRACTIONANDPURIFICATIONFROMRAWWASTEWATERSAMPLESFORDOWNSTREAMPATHOGENDETECIONBYMICROARRAYSJJOURNALOFMICROBIOLOGICALMETHODS,2005,6311512610STEPHENJR,MCCAIGAE,SMITHZ,ETALMOLECULARDIVERSITYOFSOILANDMARINE16SRRNAGENESEQUENCESRELATEDTOBETASUBGROUPAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAJAPPLENVIRONMICROBIOLOGY1996
8、,62414711刘金吉N1奈基乙二胺光度法测定水中亚硝酸盐氮预处理方法的改进环境检测管理与技术,2005,171848612陈凤凰,袁菊,郭道俊等水杨酸钠次溴酸钠流动注射分析法测定水中的氨氮含量J分析仪器,2008,10642442613邱珊莲,周易勇不同培养基对湖泊氨氧化细菌MPN计数的影响J微生物学通报,2008,35101668167314周德庆微生物学实验手册（I细菌）M上海科技出版社，19869716315沈萍,范季容,李广武微生物学实验M北京高等教育出版社,199916JJASON,LCANTERA,FIONAL,ETALEFFECTSOFIRRIGATIONSOURCESONA
9、MMONIAOXIDIZINGBACTERIALCOMMUNITIESINAMANAGEDTURFCOVEREDARIDISOLJBIOLFERTILSOILS2006,4324725517STEPHANIEA,BOYLEYARWOOD,PETERJBOTTOMLEY,ETALCOMMUNITYCOMPOSITIONOF4AMMONIAOXIDIZINGBACTERIAANDARCHAEAINSOILSUNDERSTANDSOFREDALDERANDDOUGLASFIRINOREGONJENVIRONMENTALMICROBIOLOGY200810112956296518LEEANNRACZ,
10、TANIADATTA,RAMESHGOELEFFECTOFORGANICCARBONONAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAINAMIXEDCULTUREJBIORESOURCETECHNOLOGY10120106454646019AVRAHAMIS,CONRADRPATTERNSOFCOMMUNITYCHANGEAMONGAMMONIAOXIDIZERSINMEADOWSOILSUPONLONGTERMINCUBATIONATDIFFERENTTEMPERATURESJAPPLENVIRONMICROBIOL696152616420AVRAHAMIS,LIESACKW,CONRA
11、DR2003EFFECTSOFTEMPERATUREANDFERTILIZERONACTIVITYANDCOMMUNITYSTRUCTUREOFSOILAMMONIAOXIDIZERSJENVIRONMICROBIOL669170521VANOTTIMB,HUNTPGNITRIFICATIONTREATMENTOFSWINEWASTEWATERWITHACCLIMATEDNITRIFYINGSLUDGEIMMOBILIZEDINPOLYMERPELLETSJTANSAETIONSOFTHEASAE,2000,43240541422陈铭，周晓云固定化细胞技术在有机废水处理中的应用与前景J水处理技
12、术,1997,2329823蒋字红，黄霞，俞毓馨几种固定化细胞载体的比较J环境科学，1993,1421124闵航,郑耀通,钱泽澎等聚乙烯醇包埋厌氧活性污泥聚乙烯醇包埋后，在厌氧条件下处理含AOX废水,处理废水的最优化条件J环境科学，1994,1551025张彤,曹国民,赵庆祥固定化微生物脱氮技术进展J城市环境与城市生态,2000,1321726周定,王建龙,候文华等固定化细胞在废水处理中的应用及前景J环境科学,1993,1455127AHNYH,CHOIHCAUTOTROPHICNITROGENREMOVALFROMSLUDGEDIGESTERLIQUIDSINUPFLOWSLUDGEBEDR
13、EACTORWITHEXTERNALAERATIONJPROCESSBIOCHEMISTRY,2006,4191941195028CAMPOSJL,GARRIDOFERNANDEZM,MENDEZR,ETALNITRIFICATIONATHIGHAMMONIALOADINGRATESINANACTIVATEDSLUDGEUNITJBIORESOURETECHNOLOGY,1999,681411485毕业论文文献综述生物工程氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化摘要本文对氨氧化菌的研究现状及其在固定化微生物技术的应用进行了介绍。描述了固定化微生物在国内外处理氨氮废水、含酚废水以及其他有机废水处理中的研
14、究现状。指出了微生物固定化技术的应用存在的问题，并提出了氨氧化生物脱氮技术未来的主要发展方向。关键词氨氧化菌,氨氮,硝化作用,生物脱氮,固定化技术AMMONIUMOXIDATIONBACTERIARESEARCHANDAPPLICATIONPROGRESSABSTRACTINTHISPAPER,AMMONIUMOXIDATIONBACTERIUMRESEARCHSTATUSANDTHEAPPLICATIONOFTHEIMMOBILIZEDMICROORGANISMSTECHNOLOGYWEREINTRODUCEDDESCRIBESTHEIMMOBILIZEDMICROORGANISMATHOM
15、EANDABROAD,THETREATMENTOFAMMONIANITROGENWASTEWATER,OFHYDROXYBENZENEWASTEWATERANDOTHERORGANICWASTEWATERTREATMENTOFTHECURRENTRESEARCHSTATUSPOINTSOUTTHEIMMOBILIZEDMICROORGANISMSTECHNOLOGYAPPLICATIONEXISTINGPROBLEMS,ANDPUTSFORWARDTHEAMMONIUMOXIDATIONBIODENITRIFICATIONTECHNOLOGYTHEMAINDEVELOPMENTDIRECTIO
16、NINTHEFUTUREKEYWORDSAMMONIUMOXIDATIONBACTERIAAMMONIANITROGENNITRIFICATIONBIODENITRIFICATIONIMMOBILIZEDTECHNOLOGY引言目前,含氮化合物引起的水体污染和富营养化日益加剧,已经造成了生态破坏、资源匮乏、水环境污染等严重后果。生物脱氮技术能够有效地去除污染水体和富营养化水体及底泥环境中的氮素,具有十分重要的意义和极大的实用价值。生物脱氮的理论基础是微生物作用下的硝化作用和反硝化作用。硝化作用NITRIFICATION作为自然界氮循环的重要环节之一,是指NH4或NH3被氧化为NO2至NO3的一
17、系列生化反应。亚硝化作用则是硝化作用从NH4或NH3到NO2的反应过程,是氮素循环的重要环节,由氨氧化细菌NH3OXIDIZERS,又被称为初级硝化细菌PRIMARYNITRIFIERS、亚硝化细菌AMMONIAOXIDIZINGBACTERIA来完成。从氮转化的角度来看,亚硝化细菌在生态圈中居于重要地位12,它们转化无机氨态氮为亚硝酸盐氮,与氨化细菌、硝化细菌等其它微生物共同作用,推动氮素循环的不断进行34。作为生物脱氮硝化阶段的重6要限速步骤,亚硝化的作用机理和基于亚硝化作用的生物脱氮技术的深入系统研究、开发,能为高效节能的氨氮废水生物处理工艺提供新的理论和思路。1氨氧化微生物参与亚硝化作
18、用的微生物主要是亚硝酸细菌,或称氨氧化细菌,有自养型和异养型之分。11自养氨氧化微生物一般将氨氧化细菌归为硝化杆菌科。近年在硝化细菌系统发育研究中,基于16SRRNA寡聚核苷酸的序列比较分析最先为硝化细菌的系统发育多样性提供了框架。自养亚硝化细菌为硝化杆菌科的两个生理亚群之一,在自然界氮循环链中起重要作用,能将氨态氮转化为亚硝酸盐氮,并从该氧化过程中获得能量,同化无机碳化合物如CO32、HCO3和CO258,合成细胞物质。在细菌系统发育图谱中根据16SRRNA序列同源性分析910,把亚硝化细菌生理亚群中的亚硝化单胞菌属归为紫色细菌群PROTEOBACTERIA的B亚群。其它基于16SRRNA序
19、列同源性分析或氨单加氧酶AMMONIAMONOOXYGENASE,AMO序列分析进行系统发育关系的研究表明,除海洋亚硝化球菌NITROSOCOCCUSOCEANUS和嗜盐亚硝化球菌NITROSOCOCCUSHALOPHILUS为紫色细菌群的C亚群GAMMASUBDIVISIONORGAMMASUBCLASS外,亚硝化细菌各属构成紫色细菌群B亚群。一般亚硝化细菌的最适酸碱度是从中性趋于弱碱性的区段。亚硝化细菌的培养温度因菌源而异,范围较宽。从中温环境下分离的菌株,最适生长温度为2628,从高温环境下分离的菌株,40下生长良好。一般亚硝化细菌最佳生长温度为35,亚硝化单胞菌在3036生长最好。欧洲
20、亚硝化单胞菌NITROSOMONASEUROPAEA是研究得最详细的典型自养型氨氧化细菌。除了亚硝化单胞菌属NITROSOMONAS外,其它能把氨氧化成亚硝酸的细菌属包括亚硝化螺菌属NITROSOSPIRA、亚硝化球菌属NITROSOCOCCUS、亚硝化弧菌属NITROSOVIBRIO、亚硝化叶菌属NITROSOLOBUS、亚硝化胶团菌属NITROSOGLOEA、亚硝化囊菌属NITROSOCYSTIS。土壤生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化叶菌属、硝化螺菌属。海洋生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属。盐湖生境中则有亚硝化单胞菌属。12异样氨氧化微生物自养硝化
21、作用在自然界生物硝化过程中占主导地位,但在某些环境中,真菌、放线菌、异养细菌等异养硝化微生物进行化能有机营养,能将氨、羟胺或有机氮化合物如肟等氧化成亚硝酸和硝酸。实际上,一个世纪以前就有关于异养硝化微生物及其异养硝化作用的报道,近几十年研7究者相继不同类型生境发现和分离了多种具有硝化活性的异养微生物包括细菌、放线菌、真菌。其中,异养硝化细菌有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、粪产碱菌、PB16假单胞菌以及一些新发现的菌种或属。2氨氧化机理及分子生物学的研究21氨氧化机理氨氧化细菌是一类化能自养型细菌,氨是其进行自养生长的唯一能源。从热力学观点来看,亚硝化细菌利用的基
22、质为低级能源。相对于呼吸链上的电子载体而言,氨氧化的氧化还原电位值E0CNO2/NH4340MV,氧化磷酸化效率很低,所能产生的ATP非常有限。亚硝化细菌中不存在基质水平磷酸化,它们依靠氧化磷酸化来贮存能量。异养微生物可以利用很多基质,包括无机N和有机N,如铵、胺、酰胺、N烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等生成NO21115,这也是异养硝化作用与自养硝化作用不同的特点之一。也正因为如此,异养硝化作用的底物及其代谢途径至今仍不甚清楚。异养硝化微生物的硝化速率较低。因此,只有环境条件不利于自养硝化时如酸性环境才发生异养硝化作用。尽管单位生物量的异养菌氧化NH3的速率较自养菌要慢23个数量级,但
23、异养菌的生长速率快,对环境的适应性也强,因此其总体的氧化NH3的速率并不比自养菌慢。22分子生物学研究亚硝化主要包括由氨单加氧酶AMMONIAMONOOXYGENASE,AMO催化的氨氧化成羟胺以及由羟胺氧化还原酶HYDROXYLAMINEOXIDOREDUCTASE,HAO催化的羟胺氧化为亚硝酸的系列生化反应。目前已经在AMO、HAO的分离纯化以及相关基因序列分析与外源表达方面进行了比较深入的探讨。3氨氧化应用的现状固定化微生物技术固定化微生物技术1624是从60年代开始迅速发展起来的一项新技术，它是通过采用化学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用的一种
24、基本技术。微生物细胞固定化的方法多种多样，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用来对微生物细胞进行固定化。按照固定载体及其作用方式不同，主要有共价结合固定化、吸附固定化、包埋固定化和交联固定化四大类。70年代后期，随着水环境污染的日益严重，研究高效生物处理废水系统的要求日益迫切，国内外开始应用固定化技术来处理废水。国外最早进行硝化、反硝化方面研究的是NILSSO，他用海藻酸钙固定假单孢反硝化菌PSEUDOMONASDENITRIFICANS，取得了一定效果。随后,VANOTTI21等用PVA冷冻法把硝化污泥固8定在聚乙烯醇小球里，用来处理养猪废水。采用批量试验和连续试验进行好氧处理，研究结果
25、表明硝化污泥小球不受养猪废水高BOD浓度的影响，适用于快速和有效地去除厌氧养猪废水塘中的NH4。中村25用聚丙烯酰胺固定硝化细菌和反硝化细菌，采用厌氧固定床和好氧流化床对含氨废水进行生物脱氮试验，结果表明在低温时，固定化硝化细菌的硝化速度比悬浮系统增加67倍，固定化反硝化菌的反硝化速度比悬浮系统提高3倍。同时，硝化和反硝化所需的时间分别从4H、3H减少到2H、2H，可以使处理设备减少容积50。周定等26将脱氮微生物包埋于聚乙烯醇中，结果表明在低温、低PH值的条件下，固定化细胞能够保留比未包埋细胞更高的脱氮活性，并且可减轻溶解氧对脱氮的抑制作用，脱氮微生物在固定化载体中可以增殖。这说明利用固定化
26、微生物可以在较低PH值、较低温度和较高溶解度的条件下获得较好的处理效果，即增加了脱氮过程对寒冷气候、入水条件的适应性。曹国民等25利用两种常用的固定化载体海藻酸钠和聚乙烯醇PVA混合固定硝化菌和反硝化菌，研究了好氧条件下同时硝化和反硝化的可行性及其脱氮特性。结果表明硝化菌和反硝化菌混合固定时，由于载体内部形成了适合硝化和反硝化的环境，可以在好氧条件下同时进行硝化和反硝化，实现单级生物脱氮。固定化微生物技术以其独特的优点在废水处理领域中引起了普遍的关注，进行了广泛的研究与应用2728，但要实现其实用化或工业化，还有许多问题需要进一步研究解决。1针对不同的废水体系，选择合适的微生物固定化载体，以提
27、高废水处理效率。选用单一载体和混合载体对微生物细胞浓度、活性的影响以及传质性能等因素影响的研究有待进一步深入。2固定化微生物细胞球在废水处理过程中可能对某些悬浮物质或高分子物质处理效果欠佳还可能出现发胀上浮或堵塞粘结等现象，所以需对废水进行适当的物理、化学预处理，或与其他工艺组合使用。3固定化载体的成本及使用寿命是决定其经济可行性的关键因素，因此，开发适合于固定化微生物细胞的高效生化反应器亦是一个有待解决的问题。可以预计，伴随着微生物技术和生物技术的发展，固定化细胞技术将成为一项高效而实用的废水处理技术，在今后几十年中将发挥其独特的魅力。4结语氨氧化作用的研究得到广泛关注。氨氧化与反硝化脱氮的
28、耦合,特别是能够同步异养硝9化和好氧反硝化异养硝化微生物的发现,极大地丰富了生物脱氮理论及工艺,对硝化作用的本质有了更充分的认识。对氨氧化菌相关酶及基因的研究,有助于彻底阐明氨氧化过程及机制,为氨氧化菌相关酶的固定化和基因改造提供理论依据,并为将来大规模利用基因工程菌进行高效废水生物处理奠定基础。参考文献1胡安谊,焦念志氧化古菌环境微生物生态学研究的一个前沿热点J自然科学进展,2009,1943703782王家玲环境微生物学M北京高等教育出版社,19983BRANDESJA,DEVOLAH,DEUTSCHCNEWDEVELOPMENTSINTHEMARINENITROGENCYCLEJCHEM
29、ICALREVIEWS,2007,1075775894KOOPSHP,POMMERENINGROSERADISTRIBUTIONANDECOPHYSIOLOGYOFTHENITRIFYINGBACTERIAEMPHASIZINGCULTUREDSPECIESJFEMSMICROBIOLOGYECOLOGY2001,37195KUENENJG,JETTENMSMEXTRAORDINARYANAEROBICAMMONIUMOXIDIZINGBACTERIAJAMERICANSOCIETYFORMICROBIOLOGYNEWS,2001,674564636李君文,郑金来,福寰,等一些硝化细菌的分离与
30、鉴定同J应用与环境生物学报,2004,1067867897张玲华,邝哲师,张宝玲高效硝化细菌的富集培养与分离J浙江农业学报,2002,1463483508罗琼芳,徐恒,张学俊,等一株氨氧化菌的分离及其生物学特性研究J四川大学学报,2006,4336836879LEMARCHANDK,BERTHIAUMEF,MAYNARDC,ETALOPTIMIZATIONOFMICROBIALDNAEXTRACTIONANDPURIFICATIONFROMRAWWASTEWATERSAMPLESFORDOWNSTREAMPATHOGENDETECIONBYMICROARRAYSJJOURNALOFMICROB
31、IOLOGICALMETHODS,2005,6311512610STEPHENJR,MCCAIGAE,SMITHZ,ETALMOLECULARDIVERSITYOFSOILANDMARINE16SRRNAGENESEQUENCESRELATEDTOBETASUBGROUPAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAJAPPLENVIRONMICROBIOLOGY1996,62414711刘金吉N1奈基乙二胺光度法测定水中亚硝酸盐氮预处理方法的改进J环境检测管理与技术,2005,171848612陈凤凰,袁菊,郭道俊,等水杨酸钠次溴酸钠流动注射分析法测定水中的氨氮含量J分析仪器,2008,1
32、0642442613邱珊莲,周易勇不同培养基对湖泊氨氧化细菌MPN计数的影响J微生物学通报,2008,3510166816731014周德庆微生物学实验手册（I细菌）M上海科技出版社,19869716315沈萍,范季容,李广武微生物学实验M北京高等教育出版社,199916JJASON,LCANTERA,FIONAL,ETALEFFECTSOFIRRIGATIONSOURCESONAMMONIAOXIDIZINGBACTERIALCOMMUNITIESINAMANAGEDTURFCOVEREDARIDISOLJBIOLFERTILSOILS2006,4324725517STEPHANIEA,BO
33、YLEYARWOOD,PETERJBOTTOMLEY,ETALCOMMUNITYCOMPOSITIONOFAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAANDARCHAEAINSOILSUNDERSTANDSOFREDALDERANDDOUGLASFIRINOREGONJENVIRONMENTALMICROBIOLOGY200810112956296518LEEANNRACZ,TANIADATTA,RAMESHGOELEFFECTOFORGANICCARBONONAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAINAMIXEDCULTUREJBIORESOURCETECHNOLOGY1012
34、0106454646019AVRAHAMIS,CONRADRPATTERNSOFCOMMUNITYCHANGEAMONGAMMONIAOXIDIZERSINMEADOWSOILSUPONLONGTERMINCUBATIONATDIFFERENTTEMPERATURESJAPPLENVIRONMICROBIOL696152616420AVRAHAMIS,LIESACKW,CONRADR2003EFFECTSOFTEMPERATUREANDFERTILIZERONACTIVITYANDCOMMUNITYSTRUCTUREOFSOILAMMONIAOXIDIZERSJENVIRONMICROBIOL
35、669170521VANOTTIMB,HUNTPGNITRIFICATIONTREATMENTOFSWINEWASTEWATERWITHACCLIMATEDNITRIFYINGSLUDGEIMMOBILIZEDINPOLYMERPELLETSJTANSAETIONSOFTHEASAE,2000,43240541422陈铭,周晓云固定化细胞技术在有机废水处理中的应用与前景J水处理技术,1997,2329823蒋字红,黄霞,俞毓馨几种固定化细胞载体的比较J环境科学,1993,1421124闵航,郑耀通,钱泽澎,等聚乙烯醇包埋厌氧活性污泥聚乙烯醇包埋后,在厌氧条件下处理含AOX废水,处理废水的最优化
36、条件J环境科学,1994,1551025张彤,曹国民,赵庆祥固定化微生物脱氮技术进展J城市环境与城市生态,2000,1321726周定,王建龙,候文华,等固定化细胞在废水处理中的应用及前景J环境科学,1993,1455127AHNYH,CHOIHCAUTOTROPHICNITROGENREMOVALFROMSLUDGEDIGESTERLIQUIDSINUPFLOWSLUDGEBEDREACTORWITHEXTERNALAERATIONJPROCESSBIOCHEMISTRY,2006,4191941195028CAMPOSJL,GARRIDOFERNANDEZM,MENDEZR,ETALNIT
37、RIFICATIONATHIGHAMMONIALOADINGRATESINANACTIVATEDSLUDGEUNITJBIORESOURETECHNOLOGY,1999,6814114811本科毕业设计（20_届）氨氧化菌的分离及其氨氧化条件优化12目录目录11摘要131引言142材料与方法1521样品来源1522培养基、试剂及使用方法1523氨氧化细菌的富集与分离1724菌株的鉴定1725氨氧化活性影响因子分析17251溶氧量17252PH值17253起始氨氮浓度1726分析方法173结果与讨论1731菌株的鉴定17311菌落菌体形态鉴定17312分子鉴定183121功能基因鉴定183122
38、16SRDNA鉴定183123AOB菌株分类学地位1932菌株AOB1氨氧化活性研究19321溶氧量19322PH值20323起始氨氮浓度204结论21致谢错误未定义书签。参考文献21附录错误未定义书签。错误未定义书签。13摘要从舟山近海南美白对虾养殖池塘底泥样品中筛选到一株具有氨氧化功能的细菌，命名为AOB1。菌株AOB1好氧，革兰氏阴性，球状；菌落呈淡黄色、干燥、针尖状。16SRDNA序列分析表明，该菌株与NITROSOMONASEUTROPHAC91T的相似性为100，氨氧化功能基因氨单加氧酶（AMOA）比对也表明，该菌株与NITROSOMONASEUTROPHAC91T的相似性为98。
39、在30，100R/MIN时，25ML200ML培养基装量范围内装液量越少氨氧化率越高；最适PH值为8，PH值大于或小于8时，氨氧化效率都明显受影响；氨氮浓度在1MG/L200MG/L的范围内，氨氧化速率随氨浓度的升高而加快，在200MG/L1200MG/L的范围内氨氧化速率基本保持不变，但当氨氮浓度高达2000MG/L时，其活性受到明显的抑制。因此，AOB1菌株不仅对养殖水体，而且对高浓度氨氮废水的处理也具有潜在的应用价值。关键词氨氧化细菌；亚硝化单胞菌；鉴定；氨单加氧酶基因ABSTRACTASTRAINOFAMMONIAOXIDIZINGBACTERIAL,AOB1,WASISOLATEDF
40、ROMTHESEDIMENTOFCOASTALPENAEUSVANNAMEIREARINGPONDINZHOUSHAN,ZHEJIANGPROVINCEITISAEROBIC,GRAMNEGATIVE,SPHERICALANDTHESINGLECOLONYISLIGHTYELLOW,DRYANDNEEDLETIPLIKEITS16SRRNAGENESHOWS100SIMILARITYWITHTHATOFNITROSOMONASEUTROPHAC91TANDITIS98SIMILARWITHNITROSOMONASEUTROPHAC91TINAMMONIAMONOOXYGENASEAMOAAMM
41、ONIAOXIDATIONRATEISHIGHERWITHMOREMEDIAINFLASKSINTHERANGEOF25ML200MLMEDIAAT30,100R/MINTHEOPTIMUMPHIS8FORAMMONIAOXIDATIONTHERATEOFAMMONIAOXIDATIONRISEDWITHTHEINCREASEOFAMMONIUMCONCENTRATIONINTHERAGEOF1MG/L200MG/L,REMAINEDSAMEINTHERAGEOF200MG/L1200MG/L,ANDWASSIGNIFICANTLYINHIBITEDWHENTHEAMMONIACONCENTR
42、ATIONUPTO2000MG/LTHEREFORE,STRAINAOB1ISNOTONLYUSEFULINTHETREATINGOFAQUACULTUREWASTEWATER,BUTALSOHASTHEPOTENTIALAPPLICATIONINTHEFIELDOFINDUSTRIALWASTEWATERWHICHHASHIGHAMMONIUMCONCENTRATIONKEYWORDSAMMONIAOXIDIZINGBACTERIANITROSOMONASIDENTIFICATIONAMMONIAMONOOXYGENASE141引言随着我国经济的迅速发展和城市化进程的加快，大量的工农业废水、
43、生活废水排入天然水体中，造成水体富营养化速度加快，污染现象严重。根据环境监测总站的报道，我国大部分地表水和城市河道受到了不同程度的污染，氮素污染是引起水体污染的重要原因之一，而氮素废水的超标排放是水体富营养化的主要原因。水体的富营养化对人体的健康和水中生物都是非常有害的，因此去除废水中的氮素显得尤为重要。氮主要以NH4、NO2、NO3等形式对水体造成污染，对氮素污染的治理方法有很多，而最经济且对环境友好的方法当推生物脱氮了。传统生物脱氮是由好氧条件下的硝化作用与厌氧条件下的反硝化作用完成的。由于生物脱氮技术在很多方面都有无可比拟的优势，如可操作性强、投资少、见效快、无二次污染、废水达标排放可靠
44、性强等优点，所以目前对废水中氮素的处理主要采用生物脱氮法。而生物脱氮法主要受脱氮菌剂的活性、温度、PH和DO等因素的影响，其中脱氮菌剂是最重要的影响因子，它直接决定了生物脱氮作用的强度和代谢反应的特征。而氨氧化菌的氨氧化能力是去除氨氮的主要因素，因此选育高效的氨氧化菌株，并研究其氨氧化作用的最佳条件，对于应用生物脱氮法去除氨氮具有重要的意义。随着集约化和工厂养殖的发展，养殖水体中出现氨积累现象，对养殖动物产生毒害作用，严重时会造成大批死亡14。因此，养殖水体中的氨浓度的控制成为高密度养殖的一个重要环节。控制措施之一就是施用硝化细菌，将氨氧化成亚硝酸盐，然后再进一步氧化成对养殖动物无害的硝酸56
45、。高效的氨氧化菌和亚硝酸氧化菌的筛选和配伍是调控水体氨氮浓度的关键。目前较常用的氨氧化菌属于化能自养细菌，生长十分缓慢，采用传统的细菌分离培养分析检测法研究AOB相当费时、繁琐78。我们经过一年的时间，从舟山南美白对虾海水养殖池塘底泥样品中分离纯化得到一株具有较高氨氧化活性的菌株，通过16SRDNA和AMOA功能基因序列比对对该菌株进行了鉴定，研究了其氨氧化特性。氮素污染是引起水体富营养化的重要原因之一，因此污水的脱氮处理对于维持水体清洁以及防止富营养化都具有重要的作用，硝化反硝化的工艺路线是目前废水脱氮处理的最主要工艺路线，该工艺的技术核心是硝化作用，其效率的高低往往决定着整个处理系统效率的
46、高低41。硝化作用中的氨氧化细菌可以将水体中的氨氮转为亚硝酸盐，再结合反硝化细菌转化为氮气溢出水体完成脱氮。其中氨氧化细菌包括亚硝酸叶菌属NITROSOLOBUS、亚硝酸球菌属NITROSOCCUS、亚硝酸螺菌属NITROSOSPIRA和亚硝酸单孢菌属NITROSOMONAS等。一般将氨氧化细菌归为硝化杆菌科。近年在硝化细菌系统发育研究中,基于16SRRNA寡聚核苷酸的序列比较分析最先为硝化细菌的系统发育多样性提供了框架。自养亚硝化细菌为硝化杆菌科的两个生理亚群之一,在自然界氮循环链中起重要作用,能将氨态氮转化为亚硝酸盐氮,并从该氧化过程中获得能量,同化无机碳化合物如CO32、HCO3和CO2
47、58,合成细胞物质。在细菌系统发育图谱中根据16SRDNA序列同源性分析910,把亚硝化细菌生理亚群中的亚硝化单胞菌属归为紫色细菌群PROTEOBACTERIA的B亚群。其它基于16SRDNA序列同源性分析或氨单加氧酶AMMONIAMONOOXYGENASE,AMO序列分析进行系统发育关系的研究表明,除海洋亚硝化球菌NITROSOCOCCUSOCEANUS和嗜盐亚硝化球菌NITROSOCOCCUSHALOPHILUS为紫色细菌群的C亚群GAMMASUBDIVISIONORGAMMASUBCLASS外,亚硝化细菌各属构成紫色细菌群B亚群。一般亚硝化细菌的最适酸碱度是从中性趋于弱碱性的区段。亚硝化
48、细菌的培养温度因菌源而异,范围较宽。从中温环境下分离的菌株,最适生长温度为2628,从高温环境下分离的菌株,40下生长良好。一般亚硝化细菌最佳生长温度为35,亚硝化单胞菌在3036生长最好。欧洲亚硝化单胞菌NITROSOMONASEUROPAEA是研究得最详细的典型自养型氨氧化细菌。15除了亚硝化单胞菌属NITROSOMONAS外,其它能把氨氧化成亚硝酸的细菌属包括亚硝化螺菌属NITROSOSPIRA、亚硝化球菌属NITROSOCOCCUS、亚硝化弧菌属NITROSOVIBRIO、亚硝化叶菌属NITROSOLOBUS、亚硝化胶团菌属NITROSOGLOEA、亚硝化囊菌属NITROSOCYSTI
49、S。土壤生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化叶菌属、硝化螺菌属。海洋生境中常见的是亚硝化单胞菌属、亚硝化球菌属、亚硝化螺菌属。盐湖生境中则有亚硝化单胞菌属。自养硝化作用在自然界生物硝化过程中占主导地位,但在某些环境中,真菌、放线菌、异养细菌等异养硝化微生物进行化能有机营养,能将氨、羟胺或有机氮化合物如肟等氧化成亚硝酸和硝酸。实际上,一个世纪以前就有关于异养硝化微生物及其异养硝化作用的报道,近几十年研究者相继不同类型生境发现和分离了多种具有硝化活性的异养微生物包括细菌、放线菌、真菌。其中,异养硝化细菌有反硝化假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、产碱杆菌、节杆菌、粪产碱菌、PB16假单胞菌以及一些新发现的菌种或属。氨氧化细菌是化能自养细菌，具有繁殖速率慢，世代周期长等特点，因此在污水处理中要保持硝化细菌的较好生长，需要较长的时间，难以高效地应用。本章的研究内容包括了氨氧化活性影响因子分析，氨氧化活力维持，了解其生长状况，为水体富营养化中氮素的去除提供了数据支持。2材料与方法3样品来源舟山近海南美白对虾高位养殖池塘表层底泥。31培养基、试剂及使用方法A富集培养基硫酸铵NH42SO4030G磷酸二氢钠NAH2PO4025G硫酸镁MGSO47H2O001G磷酸氢二钾K2HPO4075G硫酸锰MNSO4003G碳
