1、本科毕业论文系列开题报告生物工程地衣芽孢杆菌变异株发酵工艺研究一、选题的背景与意义地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS属硬壁菌门（FIRMICUTES）、杆菌纲（BACILLI）、芽孢杆菌科（BACILLACEAE）、芽孢杆菌属（BACILLUS）。由于地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。近年来,国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在发酵产酶、医药、饲料加工、农药等行业,取得了较好的研究成果。根据文献显示,关于地衣芽孢杆菌的专利有用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂地
2、衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产利用基因突变技术,改变地衣芽孢杆菌NCIB8061A淀粉酶的耐温性和耐酸性酶的性质等。本实验室在经60CO照射后的东海香参中分离得到一株能高效分解东海香参的菌株A，对该菌进行形态学特征、生理生化指标、16SRDNA和MIDI全自动微生物鉴定等发现其为地衣芽孢杆菌。该菌株为突变株，因此对其在医药和产酶等功能方面的研究具有重大的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）基本内容1碳源种类对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响2碳源量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响3氮源种类对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响4氮源量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响5金属
3、离子对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响6初始PH值对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响7接种量对地衣芽孢杆菌产蛋白酶发酵的影响（二）拟解决的主要问题浒苔水解最佳条件摸索，检测指标的选择将成为主要问题三、研究的方法与技术路线（一）实验安排以碳源种类、碳源量、氮源种类、氮源量、金属离子、初始PH值、接种量为变量进行单因素实验1碳源种类在基础培养基中分别添加浓度为75的不同碳源麦芽糖、蔗糖、环糊精、葡萄糖、可溶性淀粉和浒苔，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力2碳源量在基础培养基中分别添加浓度为25、35、45、55、65、75、85、95不同浓度最佳碳源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力3氮源种类在基础培养基中
4、分别添加浓度为3的不同氮源干酪素、牛肉膏、酵母浸膏、大豆蛋白、明胶、尿素、硫酸铵、蛋白胨，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力4氮源量在基础培养基中分别添加浓度为1、2、3、4、5、6、7、8等不同浓度的最佳氮源，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力5金属离子在基础培养基中分别添加浓度为0002的不同微量金属元素MG2、FE2、CA2、MN2、SN2、CU2、BA2、LI、FE3、ZN2，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力6初始PH值调节培养基初始PH分别为50、60、70、80、90、100、110和120，培养后测定发酵液的蛋白酶比活力7接种量分别按照2、4、6、8、10、12、14和16的添加水平，接种
5、培养12H的种子培养基于发酵培养基中，测定发酵液蛋白酶比活力（二）技术路线富集分离纯化培养基选择样品采集单因子试验文献查阅及实验设计样品采集富集分离纯种产碱性蛋白酶发酵培养基选择对不同培养基成分进行单因素实验运用响应面软件主效分析确定七个主要因素在根据响应面软件进行七因素七水平实验确定最优发酵培养基的配方运用最佳培养基配方对发酵各个条件进行单因素实验运用响应面软件根据上诉同样的方法确定出最佳发酵条件四、研究的总体安排与进度2010082010091实验前的准备工作查找资料，文献综述的撰写，英文参考文献的翻译；2文献整理，实验方案的确定；2010092010111开展实验；2优化实验方案中的各条
6、件；3获得实验过程中的各类数据。2011022011031整理和补充相关数据，整理实验结果；2撰写论文初稿。确定最佳发酵条件论文撰写碳源种类氮源种类氮源量碳源量数据分析金属离子初始PH值接种量3论文定稿。五、主要参考文献1荆谷，冯静，孔健，等微生物金属蛋白酶研究进展J生物工程进展，2002，22161632王吉庄，钟芳，王璋高水解度大豆肽的制备J食品工业科技，2003，24940423HADJALINE,AGREBIR,GHORBELFRIKHAB,ETA1BIOCHEMICALANDMOLECULARCHARACTERIZATIONOFADETERGENTSTABLEALKALINESERI
7、NEPROTEASEFROMANEWLYISOLATEDBACILLUSLIEHENIFONNISNHLJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2007,405155234PANT,LINSJFERMENTATIVEPRODUCTIONOFALKALINEPROTEASEASDETERGENTADDITIVEJCHINESEBIOCHEMSOC,1991,2049605BAKHTIARS,ESTIVEIRARJ,HATTIKAULRSUBSTRATESPECIFICITYOFALKALINEPROTEASEFROMALKALIPHILICFEATHERDEGRADINGNE
8、STERENKONIASPAL20JENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,200537555345406蔡雁，郝勃，喻子牛抗动物病原菌芽孢杆菌的筛选、初步鉴定和抗菌活性J微生物学杂志，200525519227唐丽娟，纪兆林，徐敬友，等地衣芽孢杆菌W10对灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物质J中国生物防治，2005，2132032058JOHNSONBA,ANKERH,MELENEYFLANEWANTIBIOTICREDUCEDBYAMEMBEROFTHEBSUBTILISGROUPMSCI,1945,1023763779赵婷，梁秀芝，刘成君皮革霉变真菌的分离鉴定及拮抗菌的筛选J中
9、国皮革，2005，3423101310唐娟，张毅，李雷雷等；地衣芽孢杆菌应用研究进展；湖北农业科学；2008，3，35135411POTUMARTHIR,SUBHAKARCHALKALINEPROTEASEPRODUCTIONBYSUBMERGEDFERMENTATIONINSTIRREDTANKREACTORUSINGBACILLUSLICHENIFORMISNCIM2042EFFECTOFAERATIONANDAGITATIONREGIMESJBIOCHEMICALENGINEERINGJOURNAL,2007,3418519212马永强，那治国，张娜，等地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱
10、性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究J食品工业科技，2008，2910818513章海锋，阮晖，刘婧，等地衣芽孢杆菌ZJUEL31410产胞外弹性蛋白酶的分批发酵研究J中国食品学报，2009，9113013614SB/T103171999蛋白酶活力测定法15史锋生物化学实验杭州；浙江大学出版社，2002929316KAILSJ,FMAUGERI,RODRIGUESMIRESPONSESURFACEANALYSISANDSIMULATIONASATOOLFORBIOPROCESSDESIGNANDOPTIMIZATIONJPROCBIOCHEM,2000,3553955017LIY,CUIFJ,LI
11、UZQETA1IMPROVEMENTOFXYLANASEPRODUCTIONBYPENICILLIUMOXALICUMZH30USINGRESPONSESURFACEMETHODOLOGYJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2007,4013811388毕业论文文献综述生物工程地衣芽孢杆菌变异株产蛋白酶的研究摘要地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。本文对国内外研究现状及展望进行了概述。关键词地衣芽孢杆菌；蛋白酶；现状引言地衣芽孢杆菌BACILLUSLICHENIFORMIS属硬壁菌门（FI
12、RMICUTES）、杆菌纲（BACILLI）、芽孢杆菌科（BACILLACEAE）、芽孢杆菌属（BACILLUS）。由于地衣芽孢杆菌安全性高、生长快速、抗逆性强、有高效的产酶能力、在较高温度下仍可存活等特点而被人们所广泛应用。在工业用酶当中，蛋白酶是用量最大、应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60以上，广泛应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域1。食品生产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶，其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点，所以，采用发酵工程技术生产蛋白酶，原料便宜，不受土地和季节的限制，是生产蛋白酶的优良方法2。用于食品加工的蛋白酶可以由多种菌种生产，其中，
13、地衣芽孢杆菌在蛋白酶生产中的应用较为广泛。POTUMARTHI,R等用地衣芽孢杆菌进行深层发酵产碱性蛋白酶，通过对通气量和搅拌速度研究，在通气量为3VVM，搅拌速度为200RPM时，发酵72H，碱性蛋白酶的含量最高，为102U/MG3。马永强等对地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行研究，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对产酶条件进行优化4。1研究现状近年来,国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在发酵产酶、医药、饲料加工、农药等行业,取得了较好的研究成果。根据文献显示,关于地衣芽孢杆菌的专利有用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法；地衣芽孢杆菌新菌
14、株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产；利用基因突变技术,改变地衣芽孢杆菌NCIB8061A淀粉酶的耐温性和耐酸性酶的性质等，因此对其在医药和产酶等功能方面的研究具有重大的意义。11地衣芽胞杆菌应用于发酵产酶研究111产碱性蛋白酶方海红等报道，分离到一株产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌011，并命名为地衣芽孢杆菌砀山亚种。该酶的最适作用条件为PH90，60。对该菌株进行连续4次不同的物理、化学方法的诱变处理。诱变剂为紫外线、亚硝酸、和低能N离子，处理方式为单独或复合处理两种。最后获得一株高产碱性蛋白酶的变异株C3203菌株产酶活力从725U/ML提高到12425U/ML
15、。该突变株的最适产酶条件为起始PH8090，培养温度3237，振荡培养时间4448H。胡承等从成都佳丰食品厂等处采集的样品中平板分离初筛到124株碱性蛋白酶产生菌，进一步复筛出一株高产碱性蛋白酶产生菌株，初步鉴定为地衣芽抱杆菌。在最适产酶条件下，酶活力单位高达7180U/ML。赵良启等对地衣芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的动力学进行了研究。证明了用MONOD方程描述地衣芽孢杆菌2709生长速率与基质浓度关系的合理性和合成碱性蛋白酶的发酵属于生长部分关联型。碱性蛋白酶活性受PH、金属离子、底物等的影响。碱性蛋白酶的最适PH一般大于90。二价金属离子如CA2、MG2、MN2等能提高碱性蛋白酶的活力，此外C
16、A2能增强绝大多数蛋白酶的稳定性5蛋白酶的特异性受到切开点两侧氨基酸残基，尤其是羧基端第一位氨基酸的影响。112产纤维素酶燕红等研究一株地衣芽孢杆菌对稻草降解作用。研究发现，在发酵过程中地衣芽孢杆菌菌体产酶过程也就是木质纤维素的降解糖化过程。上清液中的纤维素酶活和半纤维素酶活分别在发酵进行到第12H和48H时达到最高峰。总糖含量于第4H达到最高值，然后下降到一定程度后保持恒定。还原糖含量随发酵进行不断下降，达到一定值后保持恒定。该菌株对稻草长达5D的降解过程中结晶度未发生明显变化。底物残渣傅立叶红外光谱分析表明，此菌株对稻草中各组分都有一定降解。稻草中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为14
17、91、661和142。利用扫描电镜对底物残渣表面结构进行观察，可看到该菌株主要降解稻草的薄壁细胞，使其发生严重皱缩。113产高温淀粉酶蒋若天等从西藏当雄温泉附近的土壤中用锥虫蓝平板，55培养，筛选到一株分泌高温淀粉酶的菌株，经生理生化初步鉴定后，克隆16SRDNA基因测序，提交GENBANK比对后,鉴定为地衣芽孢杆菌。通过对该菌的生长条件和产酶条件的研究表明该菌高温特性良好，最高可以在65生长，产酶最适温度50；可以在PH30PH110的LB培养基中生长，最佳产PH100，LB培养基加入淀粉诱导，发酵液酶活可达80U。对该菌所产高温淀粉酶的性质研究表明酶的最适反应温度为95，100处理60MI
18、N发酵液酶活力没有明显下降，最适酶作用PH100，添加1G/L的钙离子具有激活作用。经优化培养基（黄豆粉15，玉米粉15，NACL1，K2HPO4001，KH2PO4001，CACL204，司盘4001，PH100）在50、装液量10、180R/MIN的摇床培养72后,测得酶活为105U。114产植酸酶李朝霞等以地衣芽孢杆菌为原始出发菌株，用紫外线反复诱变，最终获得一株中性植酸酶高产菌株B1ICHENIFORMISLL8，其酶活性约为原始出发菌株的2倍。该菌株具有稳定的遗传性能。通过单因素试验和正交试验对发酵条件进行了优化，当培养温度为55，PH为75，接种量为10时，经30H培养后，中性植酸
19、酶活力最高达到22684U/ML。115产葡萄糖苷酶方尚玲等从栀子果中分离到一株在较高温度下产葡萄糖苷酶的地衣芽孢杆菌，对其产酶条件进行了研究。通过单因素实验和正交实验确定该菌株产酶的最佳培养条件为碳源甘蔗渣粉麸皮一315，牛肉膏05，栀子甙02，KH2PO404，MNSO4004，PH值90，装液量20ML/250ML，种子液接种量10，45发酵24H。优化条件下发酵液中的酶活可达到9348U/ML。12地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的研究目前，国内外关于地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治的报道比较多。综合大量文献可知，地衣芽孢杆菌对植物的真菌性病害有较好的抑制效果，如烟草黑胫病6、番茄灰霉病7
20、、棉花枯萎8、辣椒病害9、水稻稻瘟病10和水果病害11等。13地衣芽孢杆菌应用于饲料加工的研究目前国内外研究表明，地衣芽孢杆菌有很强的生命活力、具备产生各种酶的能力，而且有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特性，饲料加工过程对其损失小。应用于鸡饲料12、奶牛饲料13、鱼饲料14。根据我国农业部公布的结果,允许饲用的芽孢杆菌菌种有枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS、纳豆芽孢杆菌BACILLUSNATTO、蜡样芽孢杆菌BACILLUSCEREUS、凝结芽孢杆菌BACILLUSCOAGULANS、缓慢芽孢杆菌BACILLUSLENTUS、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌BACILLUSPUMILUS等12
21、种。目前国内外研究表明，地衣芽孢杆菌有很强的生命活力、具备产生各种酶的能力，而且有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特性，饲料加工过程对其损失小。进入21世纪以来，关于地衣芽孢杆菌在饲料工业上的应用研究较多。131应用于鸡饲料郝生宏等研究自制粒制粒条件01MPA，65C地衣芽孢杆菌对03周龄肉仔鸡生产性能、血液生化指标和粪便大肠杆菌数的影响。结构与对照组相比，地衣芽孢杆菌可极显著降低1周龄肉仔鸡的平均采食量，显著提高3周龄肉仔鸡的血糖GLU水平，显著降低肠道大肠杆菌数。地衣芽孢菌对肉仔鸡其他生产和血液生化指标无显著影响。卜祥斌等通过在肉鸡日粮中添加沸石粉、低聚木糖和地衣芽孢杆菌试验，发现此配方能提高肉鸡
22、生产性能，且效果优于沸石粉、低聚木糖单独添加或二者联合添加。地衣芽孢杆菌有望成为鸡饲料的良好添加剂。132应用于奶牛饲料周振峰选用80头荷斯坦泌乳奶牛，按单因子随机配对设计，研究添加地衣芽孢杆菌制剂对泌乳奶牛生产性能的影响。结果表明，每千克精饲料中添加20亿单位的地衣芽孢杆菌产奶性能最好；奶品质有了改善，但差异不显著。并且研究了在奶牛饲料中添加地衣芽孢杆菌制剂能增强奶牛抵抗热应激的能力，可起到防病、抗病的作用。其机理是由于口服芽孢杆菌后，其作用于肠道集合淋巴结的抗原结合位点，或通过调整动物的微生物群尤其是增加双歧杆菌菌群数量，从而间接地发挥免疫赋活的作用，提高机体的局部或全部防御功能。133应
23、用于鱼饲料曹煜成等运用综合对比分析法探讨了地衣芽孢杆菌DE在优质草鱼养殖中的应用效果，结果表明，施用地衣芽孢杆菌DE可在一定程度上使水体环境和养殖生产性能得到优化，提高养殖草鱼的成活率，显著降低水体透明度及水中氨氮、硝酸盐含量，使水体PH、溶解氧有利于草鱼的生长。刘波等通过在异育银鲫饲料中添加地衣芽孢杆菌进行试验，结果表明地衣芽孢杆菌显著提高了鱼体增重率和干物质、粗蛋白及磷表观消化率，并降低了饵料系数，还显著提高了食糜蛋白酶和淀粉酶活性及肠道组织蛋白酶活性。添加地衣芽孢杆菌增加了肠道消化酶活性，促进了鱼体生长。刘文斌等通过将地衣芽孢杆菌分别与低聚木糖、复合酶制剂适量混合后加入异育银鲫饲料中，不
24、仅可以提高饲料的利用率，促进肠道有益微生物的生长和抑制有害微生物，并且能提高肝胰脏蛋白酶MRNA表达量和肠道酶活性。还有报道指出，地衣芽孢杆菌能分泌高活性的胞外酶系，可将水体中的有机残余物迅速降解为无机物，有效地促进养殖水体的生态良性循环。因此，将地衣芽孢杆菌作为鱼饲料添加剂，不仅可以促进鱼体生长，而且益于养殖水体的保护。14地衣芽孢杆菌应用于医药的研究141作用机理据报道，目前登记的地衣芽孢杆菌医药商品名为整肠生，是以地衣芽孢杆菌无毒菌株BL2活体菌株制成的胶囊，主要用于治疗一些肠道疾病。与传统的化学药物、抗生素、中药相比较，其作用机制完全不同。地衣芽孢杆菌口服以后以活菌形式进入肠道，在生长
25、代谢中能产生多种抗菌活性物质，如短杆菌肽、枯草杆菌素、制霉菌素和头孢菌素C等，可抑制肠道中的致病菌。而其是兼性厌氧菌，具有生物夺氧的作用，可促进益生菌生长而使肠道中微生态环境达到平衡，使腹泻等症状缓解或消失。地衣芽孢杆菌尚有促进巨嗜细胞非特异性吞噬作用，由于该菌不是肠道固有细菌，不会在肠道中长期定植，一般在停药后10D即全部排出体外，仅起治疗作用而不会造成远期不良反应。142临床试验无锡市东亭医院,在2000年5月至2003年8月对整肠生胶囊进行临床试验,应用整肠生治疗顽固性腹泻38例,经过观察病例在服用中未发现有任何不良反应。证实了整肠生胶囊的安全可靠性。刘恩权等用地衣芽孢杆菌颗粒剂与整肠生
26、胶囊分别治疗急性感染性腹泻及菌痢患者，临床总有效率两组分别为98360/61和96657/59，细菌清除率分别为875和933。治疗组无一例发生不良反应，对照组有1例发生便秘。地衣芽孢杆菌颗粒剂治疗急性感染性腹泻、细菌性痢疾与整肠生胶囊疗效相似，治疗中未见不良反应，证实了地衣芽孢杆菌颗粒剂安全有效，可更好地满足服用胶囊不便的患者的需要。何英四川三台县人民医院把80例真菌性肠炎患儿随机分为治疗组与对照组，分别给予地衣芽孢杆菌胶囊联合制霉菌素治疗和单用制霉菌素治疗。结果发现治疗组与对照组总有效率分别为9375、7500，不良反应发生率分别为833、938。因此可以得出地衣芽孢杆菌胶囊联合制霉菌素治
27、疗儿童真菌性肠炎的疗效优于单用制霉菌素15。143新型药剂的研究翟少华将双歧杆菌和地衣芽孢杆菌的肠生态制剂，联合应用于患有荷H22挖腹水癌小鼠，进行了一系列的试验16。在研究中发现，对荷H挖腹水癌小鼠进行化疗后，此种联合的肠生态制剂与化疗药物同时使用，不仅对H挖腹水癌细胞具有杀伤和促进凋亡作用，并可延长荷瘤小鼠生存天数，提高化疗的效果。由此证实了双歧杆菌和地衣芽孢杆菌的肠生态制剂的协同作用，并为将来的临床试验奠定了基础。15地衣芽孢杆菌应用于环境污染防治的研究地衣芽孢杆菌产生的特异酶可以降解拟除虫菊酯类农药残留17、吸附重金属18。周鸣等研究采用地衣芽孢杆菌死菌体吸附水中的CR6，其研究结果与
28、报道的同类研究相比较。地衣芽孢杆菌死菌体对CR6具有更好的吸附效果，在优化条件下，即温度为50，摇床转速140RMIN1，溶液PH值25，吸附时间2H，菌体浓度1GL1，CR6起始浓度300MGL1，菌体对CR6有最大吸附量605MGG1。胡洪波等报道了利用微生物吸附回收金、银、铂、铅等贵金属研究结果。地衣芽孢杆菌R08死菌体吸附PD2，吸附量可以达到每克菌体吸附2248MGPD2。2响应面法在培养基优化中的应用响应面法RSM是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，能够精确地研究各因子与响应值之间的关系，寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计
29、方法19。它可用在描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的相互关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响。RSM是一种适用性强的试验设计方法，不仅包括试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子水平最佳操作条件等功能，而且具有数据统计处理功能，显示出了其它试验方法如正交试验、因子试验、田口试验方法等所不具备的优点，该法不但具备试验次数少，周期短、精度高等优点20，而且可以建立连续变量曲面模型；同时，对影响试验指标的各因子水平及其交互作用进行优化和评价，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件2123。RSM已经在食品、医药、生物工程、农业、天然物提取等领域广泛的应用。3展望地衣芽孢杆菌作为医药
30、的研究最为成熟，已经形成了较完整的生产T艺，而且其医药商品整肠生的应用也较成熟。但是在农作物病害防治、饲料加工、环境污染治理等方面的研究，只是处于刚刚起步阶段，发展空间相当广阔。把分子生物学技术应用于地衣芽孢杆菌的研究，也将成为热点。目前对于地衣芽孢杆菌基因的认识还比较有限，其基因的克隆也很少。据文献报道，所克隆的基因主要是一些酶基因，如潘风光等从地衣芽孢杆菌中克隆了耐高温A淀粉酶基因，梁斌等克隆了角蛋白酶基因KERB，等。而关于地衣芽孢杆菌其他基因的克隆就更少了，克隆抗菌物质基因，将其应用于抗病育种，将成为防治植物病害的另一条更有效的途径。虽然已经有地衣芽孢杆菌高产蛋白酶工程菌报道，但是稳定
31、性较差，具体原因还有待进一步研究。另外，开发地衣芽孢杆菌应用于新型领域的研究也不可忽视。如在皮革制品中，多种真菌可生长繁殖，主要有白曲霉、拟青霉、黄绿青霉、黄曲霉、产黄曲霉和黑曲霉等，其中，部分真菌的生长受到地衣芽孢杆菌的抑制。赵婷等24报道，地衣芽孢杆菌对白曲霉、黑曲霉、拟青霉均有较好的抑制作用。目前应用地衣芽孢杆菌作为皮革防霉剂仅做了初步的研究，这一领域也为我们对地衣芽孢杆菌的应用研究扩展了空间。参考文献1荆谷，冯静，孔健，等微生物金属蛋白酶研究进展J生物工程进展，2002，22161632王吉庄，钟芳，王璋高水解度大豆肽的制备J食品工业科技，2003，24940423RAVIHANDRA
32、P,SUBHAKARCHALKALINEPROTEASEPRODUCTIONBYSUBMERGEDFERMENTATIONINSTIRREDTANKREACTORUSINGBACILLUSLICHENIFORMISNCIM2042EFFECTOFAERATIONANDAGITATIONREGIMESJBIOCHEMICALENGINEERINGJOURNAL,2007,341851924马永强，那治国，张娜，等地衣芽孢杆菌2709高去酰胺活性碱性蛋白酶发酵条件及酶学性质的研究J食品工业科技，2008，291081855HADJALINE,AGREBIR,GHORBELFRIKHAB,ETA1B
33、IOCHEMICALANDMOLECULARCHARACTERIZATIONOFADETERGENTSTABLEALKALINESERINEPROTEASEFROMANEWLYISOLATEDBACILLUSLIEHENIFONNISNHLJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2007,405155236方敦煌，李天飞，沐应祥，等拮抗细菌GP13防治烟草黑胫病的田间应用J云南农业大学学报，2003，18149527童蕴慧，郭桂萍，徐敬友，等拮抗细菌对番茄植株抗灰霉病的诱导J中国生物防治，2004，2031871898齐东梅，梁启美，惠明，等棉花枯萎、黄萎病拮抗芽孢杆菌的抗
34、菌蛋白特性J微生物学，通报，2005，32442469SIDAJ,EZZIYYANLM,EGEAGILABERTC,ETA1SELECTINGBACTERIALSTRAINSFORUSEINTHEBIOCONTROLOFDISEASESCAUSEDBYPHYTOPHTHORACAPSIEIANDAJTERNARIAALTEMATAINSWEETPEPPERPLANTSJBLOLOGIAPLANTARUM,2003,47456957410彭化贤，刘波微，陈小娟，等水稻稻瘟病拮抗细菌的筛选与防治初探J中国生物防治，2002，181252711蔡雁，郝勃，喻子牛抗动物病原菌芽孢杆菌的筛选、初步鉴定和
35、抗菌活性J微生物学杂志，2005，255192212祥斌，陈洁，刘红艳，等沸石粉、寡糖及益生素在黄鸡饲料中的应用效果研究J家畜生态学报，2006,271374013周振峰地衣芽孢杆菌对奶牛泌乳性能的影响J中国奶牛，20065131414刘文斌，尹君，方星星，等3种益生素配伍对异育银鲫生长、消化及肠道菌群组成的影响J海洋与湖沼，2007，381293515袁锦平整肠生治疗慢性顽固性腹泻38例J现代医药卫生，2005，21219519616翟少华肠生态制剂诱导H细胞凋亡的实验研究J徐州医学院学报，2005，25429229417丁海涛，李顺鹏，沈标，等拟除虫菊酯类农药残留降解菌的筛选及其生理特性研
36、究J土壤学报，2003，40112312918周鸣，刘云国，李欣，等地衣芽孢杆菌对C的吸附动力学研究J应用与环境生物学报，2006，121848719褚以文微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件J国外医药抗生素杂志分册，1999，202586120慕运动响应面方法及其在食品工业中的应用J郑州工程学院学报，2001，223919221AMBATP,AYYANNACOPTIMIZINGMEDIUMCONSTITUENTSANDFERMENTATIONCONDITIONSFORCITRICACIDPRODUCTIONFROMPALMYRAJAGGERYUSINGRESPONSESURFACEMET
37、HODSJJOURNALOFMICROBIOLOGYPROTEASESFERMENTATIONCONDITIONSRESPONSESURFACEMETHODOLOGY11引言11研究目的对一株从海地瓜中分离得到的地衣芽胞杆菌变异株发酵工艺进行研究。研究其产碱性蛋白酶、纤维素酶的最佳培养基配方和最优培养条件。并对其进行诱变处理，筛选出高产菌株。12研究意义在工业用酶当中，蛋白酶是用量最大、应用最广的一种，约占整个酶制剂产量的60以上，广泛应用于食品、饲料、制革、医药、银回收、纺织、化学工艺、废物处理和洗涤等领域1，如添加到动物饲料中以提高饲料利用率；用于制作海鲜调味品；用于CGM玉米渣的水解，以
38、制取玉米肽饮料；水解大豆蛋白生产大豆多肽等。由于市场的需求，高产、高效、耐高温、耐高碱的四高型碱性蛋白酶成为国内外当前研究的热点。食品生产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶，其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和培养方法简单等优点，所以，采用发酵工程技术生产蛋白酶，原料便宜，不受土地和季节的限制，是生产蛋白酶的优良方法2。纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质资源。据报道，全球每年通过光合作用产生的纤维素高达155109吨,其中89尚未被人类利用。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖，后者可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺
39、、环境污染等问题具有重要意义。13研究历史与现状131蛋白酶特性研究按最适PH分，蛋白酶可分为碱性、中性和酸性蛋白酶。碱性蛋白酶的最适PH一般大于90。碱性蛋白酶主要存在于细菌、放线菌和真菌中。目前，商业中应用的碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。碱性蛋白酶的分子量范围大多数集中在1835KDA，少数碱性蛋白酶的分子量例外，达到45或82KDA，也有少数碱性蛋白酶分子量很小，甚至达到8KDA。大部分碱性蛋白酶的最适PH值为911，如BACILLUSSP产碱性蛋白酶最适合PH为1011。金属离子对酶活性也有很多影响。二价金属离子如CA2、MG2、MN2等能提高碱性蛋白酶的活力，此外CA2能增强绝大多数
40、蛋白酶的稳定性3。研究认为，特定的CA2结合位点还影响到蛋白酶的活性及稳定性，可以保护这些酶热变性并且K在高温情况下保护其防止构象改变。二价金属离子对酶活有促进作用，MN2，FE2，ZN2，MG2，CO2能显著促进BACILLUSSUBTILIS分泌的蛋白酶的活力4。蛋白酶的特异性受到切开点两侧氨基酸残基，尤其是羧基端第一位氨基酸的影响。也有研究发现，羧基端第二位到第四位以及酶切位点氨基端第一位氨基酸对碱性蛋白酶切位点也有影响。如NESTERENKONIASPAL20分泌的碱性蛋白酶羧基端第二位位点偏好VAL，PRO等中性氨基酸5。碱性蛋白酶的最适温度分布范围较广，例如分离自嗜碱芽孢杆菌BAC
41、ILLUSSPB18的蛋白酶最适温度达到85，而来自深海的嗜低温菌PSEUDOMONASTRAINDYA分泌的冷活性蛋白酶最适温度为40。芽孢杆菌BACILLUSSP是一类需氧或兼性厌氧G目前也发现有G，在一定条件下能产生抗逆性内生孢子的化能异养菌。在自然界分布非常广泛，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。能够产生多种抗生素，包括肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类物质，对多种病原菌起到很好的抑制作用。132地衣芽孢杆菌的应用芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，因此，芽孢杆菌被广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染治理等各个行业。地衣芽孢杆菌BACIL
42、LUSLICHENIFORMIS是芽孢杆菌中较具应用潜力的2菌种之一。近年来，国内外对于地衣芽孢杆菌各方面应用的报道日益增多。在发酵产酶、医药、饲料加工6、分子生物技术等行业，取得了较好的研究成果。根据文献显示，关于地衣芽孢杆菌的专利有用地衣芽孢杆菌生产生物农药的方法7；地衣芽孢杆菌新菌株及其微生态制剂；地衣芽孢杆菌T1菌株的构建及其粗酶提取物的发酵生产；污水和有机物无害化处理；地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶对玉米的改性作用；地衣芽孢杆菌对鱼类消化功能的影响；地衣芽孢杆菌对养殖水体残余饵料的降解特性；地衣芽孢杆菌产生的杆菌肽，是一种强杀菌剂8，可以用于食品保鲜；用于食品加工的蛋白酶可以由多种菌种生产
43、，其中，地衣芽孢杆菌在蛋白酶生产中的应用较为广泛。133地衣芽孢杆菌应用前景地衣芽孢杆菌在医药上的研究已经形成较完整的生产工艺，例如其医药商品整肠生的应用比较成熟。在农作物病害防治、饲料加工、环境污染治理等方面的研究，处于刚起步阶段，发展空间较为广阔；把分子生物技术应用于地衣芽孢杆菌的研究，也是一大热点。据文献报道，目前对基因的认识比较有限，其基因克隆也很少。所克隆的基因主要是一切酶基因，其他基因的克隆就很少了，克隆抗菌物质基因，应用于抗病育种，将成为防治植物的一条更加有效的途径；开发地衣芽孢杆菌应用于新型领域的研究，地衣芽孢杆菌可抑制部分与皮革制品发霉有关的真菌9，作为皮革防霉剂，这一领域也
44、为我们应用地衣芽孢杆菌的研究扩展了空间10。14拟解决的问题通过对地衣芽胞杆菌发酵工艺的研究得出地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶和纤维素酶的最佳培养基配方和优发酵条件。POTUMARTHI,R等用地衣芽孢杆菌进行深层发酵产碱性蛋白酶，通过对通气量和搅拌速度研究，在通气量为3VVM，搅拌速度为200RPM时，发酵72H，碱性蛋白酶的含量最高，为102U/MG11。马永强等对地衣芽孢杆菌2709发酵生产高去酰胺活性碱性蛋白酶的发酵条件进行研究，以酶液对大豆蛋白的去酰胺度和肽键水解度为指标，对产酶条件进行优化12，从而得到了最佳碳源、碳源量、氮源、氮源量、PH值、接种量和金属离子。本研究从经过60CO照射的
45、东海香参水解液中分离得到一株具有高效降解蛋白的地衣芽孢杆菌，运用响应面方法对其蛋白酶发酵培养基和发酵条件进行优化。2材料和方法21菌种地衣芽孢杆菌，本实验室从经过60CO照射的东海香参水解液中分离、纯化。22主要试剂和仪器221主要试剂FOLIN酚试剂，SIGMA公司；牛白蛋白，国药集团化学试剂有限公司；干酪素，北京市海淀区微生物培养基制品厂；其他试剂均为AR级。222主要仪器T6新锐可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；PH计，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DXY恒温调速回转式摇床，上海杜科自动化设备有限公司；高速
46、冷冻离心机，HERAEUS有限公司。23培养基231种子斜面培养基3蛋白胨10G/L、牛肉膏3G/L、NACL5G/L、琼脂粉20G/L、自然PH。种子液体培养基中不加琼脂。232初始发酵培养基13（）蔗糖75、酪蛋白30、NACL05、K2HPO43H2O053、NA2CO32H2O003、NA2CO30056、MNSO40002、自然PH。24培养方法和发酵条件241种子培养方法将地衣芽孢杆菌从保存的斜面转接于新鲜试管斜面，37培养12H。取培养好的斜面，用接种环挑一环接种于盛有50ML无菌种子培养基的250ML三角瓶中，然后置于恒温调速回转式摇床中37培养12H，转速为160R/MIN。
47、242发酵培养方法分别取种子液，超净工作台上接入盛有50ML无菌种子培养基的250ML三角瓶中，接种量为6，置恒温调速回转式摇床中37、120R/MIN，发酵培养36H。25菌体生长测定取1ML发酵液稀释80倍，560NM处测光密度值。26蛋白酶活力测定采用福林FOLIN试剂显色法，参考SB/T10317199914。缓冲液是01MOL/L，PH1057的NA2CO3NAHCO3缓冲液。反应温度为40。蛋白酶活力单位的定义每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。蛋白酶比活力（U/G蛋白）蛋白酶活力（U/ML）/水溶性蛋白量（G/ML）27蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝法，参
48、见文献15。考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465NM；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595NM，而且消光系数更大，在一定蛋白质浓度范围内（11000G/ML，蛋白质染料复合物在595NM处的光吸收与蛋白质含量成正比。蛋白质含量（G/G鲜重）A（G）提取液总体积（ML）/测定所取提取液体积（ML）样品鲜重（G）A标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为G3结果与讨论31酪氨酸和蛋白质标准曲线Y00073X00155R20997200102030405060708020406080100酪氨酸含
49、量吸光值AY00139X00046R209978001020304050607080102030405060蛋白含量（）吸光值（A）32发酵过程中参数测定4在发酵过程中，每隔6H取样，测定OD560NM、PH值和蛋白酶比活力，结果如图1。020004000600080001000012000140001600018000200000612182430364248546066时间H蛋白酶比活力（U/G蛋白）0123456789吸光值30、PH值蛋白酶比活力细菌吸光值PH值图1蛋白酶发酵动力学曲线FIG1KINETICCURVESDURINGFERMENTAIONPRODUCTIONOFPROTEASE321菌体生长情况种子接种于发酵瓶中6H后进入对数期，30H后进入稳定期，36H后进入衰亡期，细胞衰亡自溶。322PH值变化起始12H，PH值急剧下降到62，之后慢慢回升到67左右，到36H后PH值又开始下降。323蛋白酶比活力起始6H，不产蛋白酶，到24H后，大量产酶，36H达到最大值，之后随着细胞自溶，PH值
