1、本科毕业论文系列开题报告生物工程两株溶藻弧菌的分子鉴别一、选题的背景与意义弧菌在水生环境中分布非常广泛，与真核生物（如鱼、虾、人等）有密切的关系。某些弧菌是重要的水产养殖动物的病原菌，有些还是人类的致病菌，严重的甚至致人死亡。然而，除了作为病原菌，弧菌在生态环境中也具有不可取代的作用。弧菌可以吸收溶解有机物质，从而对水环境中的营养循环起作用；某些弧菌可以分解几丁质，增加了氨基糖的来源；还有的弧菌可以降解多元环芳香烃以及产抗生素等。核糖体RNA（RRNA）分子存在于所有细胞生物中，RRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来重现所有细
2、胞生物间的进化关系。另外，由于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。16SRRNA基因序列包含10个可变区VARIABLEREGION和11个恒定区CONSTANTREGION，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SRRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SRRNA基因为分类标准的各大数据库例如GENEBENK、EMBL等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。然而，16SRRNA基因在弧菌的分类鉴定
3、中却存在一定的问题，我们可以借助于16SRRNA基因的测序及比对分析，将弧菌鉴定到属乃至科的水平，但鉴定至种的水平就存在一定难度，因为在弧菌科中，16SRRNA序列的相似性高达976以上，有些弧菌种之间的相似度甚至接近100。因此，我们必须寻找新的用于鉴定的标志分子来增强我们对于弧菌分类的认识。随着弧菌发现的种类的增加，以及分类学中新的问题的出现，新的分子鉴定基因不断出现，用具有较高分辨率的分子基因如RECA基因、GYRB基因、DNAE基因、MDH基因和GAPA基因等多种基因与16SRRNA基因相结合，共同分析鉴定，从而将其精确定位。本研究采用PCR方法同时进行16SRRNA和另一种高分辨基因
4、如（RECA基因等的分子鉴定，通过序列同源性分析显示，确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。此项课题为进一步探究多基因分子鉴定在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。相信随着科学技术的发展，分子鉴定系统将会越来越完善，分子鉴定的精度也会越来越高，而且随着人们对基因的进一步深化了解和实验技术的发展，分子鉴定将会朝着系统化和高精度化发展，那些难以准确定位的物种终将被准确定位。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容本实验主要是对采
5、样获取的两株弧菌中提取其总DNA，获得该两株菌的16SRRNA基因和另一种标记分子，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。（二）拟解决的问题16SRRNA基因与其他高分辨基因如RECA基因等相结合进行对弧菌进行鉴别和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1、实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进行分离纯化后接种到培养皿培养备用。2、形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴别。3、总DNA提取大试管液体扩繁，收集10ML培养液，离心；加入2MLTE悬浮菌体，溶菌酶100UL（50MG/ML）、RNASEA10UL10MG/ML，摇
6、匀；水浴30MIN加入120UL10SDS和蛋白酶K20MG/ML10UL60水浴30MIN1H加入500UL5MOL/LNACL，320ULCTAB/NACL，65水浴10MIN3ML酚氯仿25241抽提一次（一定要混匀）转移上清后用等体积氯仿异戊醇241抽提1次加入1/10体积的3MOL/LNAAC，06体积异丙醇沉淀DNA用70的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。所得的沉淀DNA用50UL水溶解，加入50UL的5MOL/L的NACL溶液，充分混匀。加入06倍体积的异丙醇沉淀后重
7、新70酒精洗涤。风干后，用25UL水溶解样品。风干后，用50UL水溶解样品，20保藏。4、PCR方法测定获取目的基因序列16SRRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20TA反应体系中含有无菌蒸馏水144L，1PCR缓冲液2L，15MMOL/LMGCL216L，4DNTP混合物04L，引物各02L，25U/L的TAQDNA聚合酶02L，模板DNA1L。PCR反应条件为95预变性3MIN、接94变性LMIN、55复性1MIN和72延伸2MIN，30个循环后72温育6MIN。5、随机测序及序列分析琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至PMD19T载体，对序列进行序列测定。序列测定和
8、分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLAST分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJNIGACJP/，等电点分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，系统进化分析由MEGA40版程序完成TAMURAETAL，2007。6、菌种分类位置确定根据细菌形态、培养基理化特性测定的结果，依据相关资料，并结合细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属分类位置判定。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201011毕业论文选题2
9、01012进行文献查阅收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。201101获得两株弧菌基因16SRRNA基因序列，对其进行分析。201102通过对两株弧菌的其他标记分子进行分子鉴别，确定其具体种类。201103数据材料的整理和总结。201103完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社20011061282STEFANH,HELMUTW,KARINNB,ETALISOLATIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSFROMSEAWATERAQUARIAJINTJHYGENVIRONHEALTH,2000,2
10、0316921753周洪彦,梁冬医学相关弧菌的分类及鉴定进展综述J中国食品卫生杂志,2002,247494KANEKOT,COLWELLRRECOLOGYOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSANDRELATEDORGANISMSINTHEATLANTICOCEANOFFSOUTHCAROLINAANDGEORGIAJAPPLMICROBIOL,1973,281009210175林业杰,陈亢川,陈拱立,等溶藻弧菌噬菌体的分离J微生物学报,1993,33428522896陈强,鄢庆枇,马甡溶藻弧菌致病性研究进展J海洋科学,2006,30884897CARLOSR,ALICIAET,JU
11、ANLB,ETAL,ASSOCIATIONOFAEROMONASHYDROPHILAANDVIBRIOALGINOLYTICUSWITHLARVALMORTALITIESOFSCALLOPJJOURNALOFINVERTEBRATEPATHOLOGY,1996,6721322188夏慧勇一起溶藻弧菌引起的食物中毒J中国实用医药,2008,371391409THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459610龙雯,陈存社16SRRNA测序
12、在细菌鉴定中的应用J北京工商大学学报,2006,49101211焦振泉,刘秀梅细菌分类与鉴定的新热点16S23SRDNA间区J微生物学通报,2001,1858912朱传华,何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828213THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETA1USEOFRECAASANALTERNATIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYM
13、ICROBIOLOGY2004,545,91992414刘文强,贾玉萍,赵宏坤16SRRNA在细菌分类鉴定研究中的应用J动物医学进展,2006,2711151815塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738116谢珍玉,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869517李献梅,王小芬,杨洪岩等促旋酶B亚单位基因GYRB在鉴别细菌近缘种中的应用J微生物学报48570170618邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,40（6）69269819THOMPSONFL,KLOS
14、EKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459620张晓君,陈翠珍,阎斌伦等凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征J海洋与湖沼2009,40565466221WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLOGYM198628429622THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBA
15、CTERIOL2005,188134592459623马筱玲,陈学民,黄尊波细菌鉴定中鉴别试验的选择方法J陕西医学检验2000,1531224李琳,李槿年,余为一细菌分类鉴定方法的研究概况J安徽农业科学,2004,32354955125焦振泉,刘秀梅细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展J国外医学卫生学分册,1996,635636126LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721327谢庶洁一簇海洋放线菌的MLSA分析及其DNA降解现象的研究D厦门大学,2
16、009毕业论文文献综述生物工程弧菌分类及常用鉴定方法的研究进展摘要随着人们对于弧菌的认识需不断深入，必需对其建立一个稳定的实用的分类鉴定系统。常用的分类鉴定方法有表型特征分类鉴定、遗传型分类鉴定等，但他们都存在一定的弊端。本文就弧菌分类、分类鉴定的常用方法以及分类鉴定的新进展进行了综述。关键词弧菌溶藻弧菌16SRRNA分类鉴定弧菌属（VIBRIO）隶属于变形杆菌纲弧菌科，是菌体短小的革兰氏阴性菌，体长约0515微米，通常呈运动杆状、直或弯曲成杆状，嗜温，化能有机营养型，也可以进行兼性厌氧发酵，一般可以在海水琼脂及选择性培养基TCBS上生长，大多数氧化酶活性阳性1。弧菌在水生环境中分布广泛，与真
17、核生物（如鱼、虾、人等）有密切的关系。某些弧菌是重要的水产养殖动物的病原菌，有些还是人类的致病菌，严重的甚至致人死亡。然而，除了作为病原菌，弧菌在生态环境中也具有不可取代的作用。弧菌可以吸收溶解的有机物质，从而对水环境中的营养循环起作用；某些弧菌可以分解几丁质，增加了氨基糖的来源；还有的弧菌可以降解多元环芳香烃以及产抗生素等等。溶藻弧菌VIBRIOALGINOLYTICUS属于弧菌属，无芽孢、荚膜，单独存在或尾端相连，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧的海生弧菌2。以前被认为是副溶血弧菌的生物型，1974年伯杰氏细菌鉴定手册中将它列为副溶血弧菌型，后证实两者的DNA中GC含量不同，1984版把它从副溶血弧
18、菌中划分出来，成为一个独立的种3。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处4，数量居海水类弧菌之首5，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌。溶藻弧菌为嗜温菌，从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少6，其对养殖动物的致病性也多发生在夏季7。此外，溶藻弧菌对人的致病性也有大量报道,可引起人食物中毒，可经创面感染人体引起蜂窝组织炎、中耳炎，甚至引起败血症等肠道外感染8。1弧菌的分类从1854年，意大利医师FILIPPOPACINI发现第一种弧菌开始到2002年，弧菌种类已增加至47种，而且每年都有新的弧菌被发现及鉴定，弧菌属所包括的种类也会越来越多。2004年，THOMPSON等通
19、过16SRRNA，RECA与RPOA基因序列分析，将弧菌划分为4个科，即SALINIVIBRIOACEAE，ENTEROVIBRIOACEAE，PHOTOBACTERIACEAE，VIBRIONACEAE。VIBRIONACEAE只包含弧菌属这一个属，属中包括除了VFISCHERI群之外所有的63种弧菌。其中，通过对16SRRNA，23SRRNA，RECA，GYRB等进行序列分析及表型分析显示，VCHOLERAE和VMIMICUS应当列入属的行列，但是这两个却是弧菌属的成员。同时有人表示，弧菌属是一个独立的系统发育群，可以提升至科的行列来进行研究。像这样的问题仍有待进一步研究讨论9。随着弧菌数
20、量不断增多，人们对于弧菌的认识需不断深入，必需对其进行系统的分类鉴定。因此建立一个稳定的实用的分类鉴定系统是当务之急。2弧菌基因的分子鉴定核糖体RNA（RRNA）分子存在于所有细胞生物中，RRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来重现所有细胞生物间的进化关系10。另外，由于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。分类学历史上5S，16S，23SRRNA基因都曾用于细菌包括弧菌的分类鉴定中，它们是系统发育研究的标志分子，被称为“分子计时器”11。其中16SRRNA基因序列的应用最
21、普遍，由于16SRRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，利用16SRRNA基因分析，不仅速度快，而其精度更高，适于分析大量弧菌的种群变化规律研究12,13。将样本中16SRRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SRRNA序列信息，再与16SRRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类14。然而，16SRRNA基因在弧菌的分类鉴定中却存在一定的问题，我们可以借助于16SRRNA基因的测序及比对分析，将弧菌鉴定到属乃至科的水平，但鉴定至种的水平就存在一定难度，因为在弧菌科中，16SRRNA序列的相似性高达976以上，
22、有些弧菌种之间的相似度甚至接近10015,16。因此，我们必须寻找新的用于鉴定的标志分子来增强我们对于弧菌分类的认识。其他已被使用过的标志分子有HSP60，GYRB17,18，RECA19,20，RPOA，RPOB，ATPA，等等。3弧菌常用鉴定方法1970年，COLWELL提出了多项分类的概念，这一概念的提出极大推动了分类学的发展。多项分类鉴定技术主要围绕表型特征、遗传学特征这两方面的信息建立的9。31表型特征分类鉴定对于弧菌的比较传统的分类鉴定方法就是表特征鉴定法，其表性特征包括形态学特征21、生理生化特征22、抗生素的敏感性、噬菌体分型、血清学分析、蛋白质分析等。其中，生理生化特征测定法
23、是经常用来鉴定弧菌的实验方法，某些实验室把该方法当作早期弧菌鉴定的特别方法23。表型特征分类鉴定在早期的弧菌分类鉴定中起到了不可替代的作用。然而随着被发现的弧菌的越来越多，单纯靠表型特征分类鉴定已经越来越困难。这就为我们的进一步研究造成阻碍。32遗传型分类鉴定在过去的几十年中，出现了一系列基于弧菌的遗传信息而进行的分类鉴定技术，这些技术中常用的主要有DDHDNADNAHYBRIDIZATION，AFLP（AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM），REPPCR（REPETITIVEEXTRAGENICPALINDROMEPCR），微阵列技术（MICROARRAYS
24、），MLSTMULTILOCUSSEQUENCETYPING等等24,25，而最为常用且可靠性也高的有DDH，AFLP，REPPCR。相比传统的表型特征，遗传型分类鉴定更可靠，但由于实验起来比较繁复，又不能通过因特网建立信息库，因此仅局限于世界上几个实验室在使用，实在不是既实用又可以普及的分类鉴定方法。4多基因位点序列分析法（MLSA，MULTILOCUSSEQUENCEANALYSIS）由于16SRRNA基因无法将弧菌鉴定至种或者株的水平，因此我们寻找了新的标志分子来增强我们对于弧菌系统发育和分类的认识26。然而，仅依靠单个基因并不能代表整个基因组的可比性，因为单一基因可能会因多种外界因素而
25、受到影响。2002年，细菌菌种定义复评特别委员会达成了一项共识，即至少要对存在于染色体上的多个位点中的五个基因进行分析，才能得到足够的信息将一株细菌划分至种的水平，这种方法即为MLSA9。近年来MLSA的出现给弧菌的分类鉴定提供了一种更方便更实用的方法。其相对方便快速，经济上也较节约，后续的序列比对分析等也都可以在互联网上免费完成。现在的一种趋势是对核心基因组中的多个管家基因进行测序及系统发育学分析等，以达到对弧菌分类鉴定的目的。通过实验不难看出，几个基因的综合分析会使分类鉴定更加准确27。参考文献1东秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社20011061282STEFANH,HEL
26、MUTW,KARINNB,ETALISOLATIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSFROMSEAWATERAQUARIAJINTJHYGENVIRONHEALTH,2000,20316921753周洪彦,梁冬医学相关弧菌的分类及鉴定进展综述J中国食品卫生杂志,2002,247494KANEKOT,COLWELLRRECOLOGYOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSANDRELATEDORGANISMSINTHEATLANTICOCEANOFFSOUTHCAROLINAANDGEORGIAJAPPLMICROBIOL,1973,281009210175林业杰,陈亢川,陈拱
27、立,等溶藻弧菌噬菌体的分离J微生物学报,1993,33428522896陈强,鄢庆枇,马甡溶藻弧菌致病性研究进展J海洋科学,2006,30884897CARLOSR,ALICIAET,JUANLB,ETAL,ASSOCIATIONOFAEROMONASHYDROPHILAANDVIBRIOALGINOLYTICUSWITHLARVALMORTALITIESOFSCALLOPJJOURNALOFINVERTEBRATEPATHOLOGY,1996,6721322188夏慧勇一起溶藻弧菌引起的食物中毒J中国实用医药,2008,371391409THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHE
28、FIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459610龙雯,陈存社16SRRNA测序在细菌鉴定中的应用J北京工商大学学报,2006,49101211焦振泉,刘秀梅细菌分类与鉴定的新热点16S23SRDNA间区J微生物学通报,2001,1858912朱传华,何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828213THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETA1USEOFRECAASANALTERNA
29、TIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICROBIOLOGY2004,545,91992414刘文强,贾玉萍,赵宏坤16SRRNA在细菌分类鉴定研究中的应用J动物医学进展,2006,2711151815塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738116谢珍玉,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869517李献梅,王小芬,杨洪岩等促旋酶B亚单位基因GYRB在鉴
30、别细菌近缘种中的应用J微生物学报48570170618邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,40（6）69269819THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459620张晓君,陈翠珍,阎斌伦等凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征J海洋与湖沼2009,40565466221WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLO
31、GYM198628429622THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRIOSJBACTERIOL2005,188134592459623马筱玲,陈学民,黄尊波细菌鉴定中鉴别试验的选择方法J陕西医学检验2000,1531224李琳,李槿年,余为一细菌分类鉴定方法的研究概况J安徽农业科学,2004,32354955125焦振泉,刘秀梅细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展J国外医学卫生学分册,1996,635636126LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIO
32、VULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMICROBIOLLETTERS1999,1741620721327谢庶洁一簇海洋放线菌的MLSA分析及其DNA降解现象的研究D厦门大学,2009本科毕业设计（20_届）两株溶藻弧菌的分子鉴定目录摘要1ABSTRACT1引言21材料与方法311实验材料312药品与试剂313实验仪器414方法4141菌株的分离纯化4142DNA的提取4143引物选择514416SRRNA基因的PCR扩增与测序514516SRRNA基因的系统发育树构建5146TOXR基因的PCR扩增与测序5147TOXR基因的系统发育树构建62数据分析和结果621弧菌的分离及形态特
33、征62216SRRNA序列分析723TOXR基因序列分析93讨论1031弧菌形态特征观察1032弧菌分子鉴定结果104结论11致谢12参考文献131摘要弧菌属包含了大量的非常相似的细菌种类，并且每年都有新的弧菌被鉴定发现。随着弧菌数量的逐渐增多，人们对于弧菌的认识需要不断深入，对其进行系统分类鉴定的任务就不可避免。然而，随着各种细菌鉴定方法的出现，没有一个客观的分类标准成为了研究弧菌的巨大障碍，建立一个稳定的实用的分类鉴定系统刻不容缓。传统细菌鉴定方法程序繁琐，时间长，费用高，无法满足快速鉴定各种弧菌的要求。16SRRNA基因序列广泛的应用于对弧菌的鉴定中，但由于在某些弧菌之前，16SRRNA
34、序列的相似性高达976以上，因此无法很好对其进行鉴定。因此，本实验采用PCR方法，对分离的弧菌同时进行16SRRNA基因和TOXR基因系统发育分析，结合细菌形态等结果，最终确定该弧菌的分类学地位，以求通过这些建立一套溶藻弧菌分子鉴别的方法系统。关键词溶藻弧菌，16SRRNA基因，TOXR基因，系统发育分析ABSTRACTTHEVIBRIOGENUSCONSISTSOFALARGENUMBEROFBACTERIALSPECIESWITHGREATSIMILARITYANDEVERYYEARANEWDISCOVERYOFVIBRIOWEREIDENTIFIEDWITHTHEGRADUALINCRE
35、ASEINTHENUMBEROFVIBRIO,PEOPLENEEDTOKEEPINDEPTHUNDERSTANDINGOFVIBRIOANDTOCARRYOUTTHETASKOFCLASSIFICATIONANDIDENTIFICATIONSYSTEMISINEVITABLEHOWEVER,WITHTHEEMERGENCEOFAVARIETYOFBACTERIALIDENTIFICATIONMETHODS,THEREISNOOBJECTIVECRITERIAFORTHECLASSIFICATIONOFVIBRIOBECOMEAHUGEOBSTACLETOTHEESTABLISHMENTOFAS
36、TABLESYSTEMOFCLASSIFICATIONANDIDENTIFICATIONOFPRACTICALURGENCYTRADITIONALMETHODSOFBACTERIAIDENTIFICATIONPROCEDURESCUMBERSOME,TIMEISLONG,EXPENSIVE,CANNOTMEETTHEREQUIREMENTSOFRAPIDIDENTIFICATIONOFVARIOUSVIBRIO16SRRNAGENESEQUENCESAREWIDELYUSEDINTHEIDENTIFICATIONOFVIBRIO,BUTBEFORE,INSOMEVIBRIO,16SRRNASE
37、QUENCESIMILARITYASHIGHAS976ORMORE,SOITSNOTVERYWELLIDENTIFIEDTHEREFORE,THISEXPERIMENTWILLADOPTTHEPRCMETHOD,WHICHWILLHAVEAPHYLOGENETICANALYSISOF16SRRNAANDTOXRGENEONTHESEPARATEDVIBRIOANDTHENCOMBINETHERESULTSOFTHEFORMSOFBACTERIAANDFINALLYDETERMINETHETAXONOMICALSTATUSOFTHEVERYVIBRIO,ANDULTIMATELYDETERMIN
38、ETHETAXONOMICSTATUSOFVIBRIOINORDERTOESTABLISHASETOFTHESEMOLECULARIDENTIFICATIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSMETHODSYSTEMKEYWORDSVALGINOLYTICUS,16SRRNAGENE,TOXRGENE,PHYLOGENETICANALYSIS2引言溶藻弧菌VIBRIOALGINOLYTICUS属于变形菌纲弧菌属，无芽孢和荚膜，尾端相连或单独存在，为嗜盐嗜温性、兼性厌氧、化能有机营养型的海生弧菌1。以前被认为是副溶血弧菌的生物型，1974年伯杰氏细菌鉴定手册2中将它列为副溶血弧菌型，研究
39、发现两者之间仅有6070的基因组同源性3，1984版把它从副溶血弧菌中划分出来，成为一个独立的种4。溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处5，并且数量居海水类弧菌之首6，但其为嗜温菌,从夏季到冬季，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少7,8。另外，溶藻弧菌也大量分布在海洋动物中9，如意大利亚德里亚海海域采集的紫贻贝MYTILUSEDULISLINNAEUS，其中分离出的溶藻弧菌占弧菌总数的1/3左右。溶藻弧菌为海洋中正常菌群之一，在生态环境中具有不可取代的作用。它可以吸收溶解有机物质，对水环境中的营养循环起到一定的作用；某些弧菌可以分解几丁质，从而增加氨基糖的来源；还有的弧菌可以降解多元
40、环芳香烃，以及产抗生素。但同时，溶藻弧菌亦是海洋生物弧菌病中危害最大的病原菌之一，溶藻弧菌在食品中特别是海产品中的数量远比副溶血弧菌为多，常对水产养殖业造成巨大的经济损失。溶藻弧菌为嗜温菌，其对养殖动物的致病性多发生在夏季10，由赤道向两极随着温度的降低其数量也明显减少，在水温2532E下容易流行5，在夏季，溶藻弧菌病的爆发不仅造成水产养殖业的损失，若处理不当，存在于海产品中的溶藻弧菌也会对人类的健康造成损害11，能够引起人食物中毒12、耳炎13等等目前我国水生动物细菌性疾病的治疗主要依赖投放大量抗生素，不仅使病原菌产生了耐药性，而且对人类的健康造成威胁。因此，建立一种快速、敏感、准确的病原检
41、测技术，就变得非常重要了。弧菌的分类从1854年，意大利医师FILIPPOPACINI发现第一种弧菌开始到2002年，从1981年至2002年，弧菌种类已增加至47种，而且每年都有新的弧菌被发现及鉴定，弧菌属所包括的种类也会越来越多。比较基因组学研究分析，点突变、染色体重排、基因的丢失和获得都是引起弧菌进化及特化的原因。2004年，THOMPSON等通过16SRRNA，RECA与RPOA基因序列分析，将弧菌划分为4个科，即SALINIVIBRIOACEAE，ENTEROVIBRIOACEAE，PHOTOBACTERIACEAE，VIBRIONACEAE。VIBRIONACEAE只包含弧菌属这一
42、个属，属中包括除了VFISCHERI群之外所有的63种弧菌。其中，通过对16SRRNA，23SRRNA，RECA，GYRB等进行序列分析及表型分析显示，VCHOLERAE和VMIMICUS应当列入属的行列，但是这两个却是弧菌属的成员。同时有人表示，弧菌属是一个独立的系统发育群，可以提升至科的行列来进行研究。像这样的问题仍有待进一步研究讨论14。随着弧菌数量不断增多，人们对于弧菌的认识需不断深入，必需对其进行系统的分类鉴定。尽管弧菌属的分子分类在迅速发展，但密切相关的物种之间和个别菌株的分类进度仍然有限。因此建立一个稳定实用的分类鉴定系统是当务之急。弧菌基因的分子鉴定核糖体RNA（RRNA）分子
43、存在于所有细胞生物中，RRNA基因与细菌整个基因组的变化相比，有高度的保守性。其本身的进化就反映了生物系统发育历史，因此可以用来显示所有细胞生物间的进化关系15。另外，由于其在细菌染色体上存在多个拷贝，现已作为标记基因广泛应用于细菌分类学和细菌的分子流行病学研究中。分类学历史上5S，16S，23SRRNA基因都曾用于细菌包括弧菌的分类鉴定中，它们是系统发育3研究的标志分子，被称为“分子计时器”16。其他已被使用过的标志分子有HSP60，GYRB，RECA，RPOA，RPOB，ATPA，DNAJ，LUX，TOXR等等，ZEIGLER认为，要选择这样的基因，基因必须至少满足四个标准1这些基因必须是
44、在细菌基因组中广泛存在的；2这些基因在基因组中必须是一旦拷贝形式存在的；3基因必须要足够长来包含系统发育学信息，但是也要足够短而使测序的花费不必太高，一般在9002250BP；4基因序列必须能以足够的准确度和精确性来预测基因组之间的关系。其中16SRRNA基因序列的应用最普遍，由于16SRRNA基因核苷酸序列总长度适宜，结构完整，利用16SRRNA基因分析，不仅速度快，而其精度更高，适于分析大量弧菌的种群变化规律研究17,18。将样本中16SRRNA的基因片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得16SRRNA序列信息，再与16SRRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中的位
45、置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类19。然而，16SRRNA基因在弧菌的分类鉴定中却存在一定的问题，我们可以借助于16SRRNA基因的测序及比对分析，将弧菌鉴定到属乃至科的水平，但鉴定至种的水平就存在一定难度20，因为在弧菌科中，16SRRNA基因序列的相似性高达976以上，有些弧菌种之间的相似度甚至接近10021,22。因此，我们必用其他的标志分子来增强我们对于弧菌分类的认识。TOXR基因是广泛存在于弧菌中的和毒力相关的调节基因，在调节编码霍乱弧菌肠毒素基因、菌毛23和一些外膜蛋白在内的基因中发挥关键作用24。TOXR基因序列具有高度保守性，其编码的蛋白具有1个高度变异的膜结合区25。就
46、现有的细菌基因组序列数据库来看，该基因只存在于弧菌科中。TOXR基因广泛应用于对如哈维氏弧菌、副溶血弧菌等弧菌的鉴定26。研究的意义本实验采用16SRRNA基因和TOXR基因同时进行PCR扩增、测序，通过序列同源性分析，确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种方便有效的弧菌鉴别方法，可在实践中加以推广应用。本实验为进一步探究多基因分子鉴定在弧菌鉴定上发挥的作用以及寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究环境中弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。1材料与方法11实验材料从宁波北仑台塑、鄞州以及象山梭子蟹养殖塘采集水样或蟹体样品用于弧菌的分离。12药品与试剂
47、1TAQDNA聚合酶5UNITSL1购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2DNTPS其中DATP、DGTP、DCTP、DTTP均为10MMOLL1，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；310PCRBUFFER购自上海生工生物工程技术服务有限公司；4LB液体培养基蛋白胨10GL1，酵母提取物5GL1，NACL10GL1，PH70,高温高压灭菌后4保存；5TCBS培养基平板酵母膏5G，蛋白胨10G，蔗糖20G，硫代硫酸钠10G，柠檬酸钠10G，牛胆酸钠3G，牛胆汁粉5G，氯化钠10G，柠檬酸铁1G，溴麝香草酚蓝（2溶液）20ML，草酚蓝（1溶液）4ML，琼脂15G，PH86，高温高压灭菌后冷至
48、60铺平板；46酚/氯仿/异戊醇（25241）（体积比）4避光短期保存；7氯仿/异戊醇（241）（体积比）4保存；8NAAC5MOL/L高温高压灭菌后4保存；910SDSSDS10，PH72，室温保存；1010TEBUFFER10MMOL/LTRISHCL，100MMOL/LEDTA，PH视需要而定，高温高压灭菌后4保存；1150TAEBUFFER配制方法称量TRIS242G，NA2EDTA2H2O372G于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ML去离子水，充分搅拌均匀；加入571ML的冰乙酸，充分溶解；加去离子水定容至1L后，室温保存。其他倍数TAE按照对应倍数要求稀释即可。12CTAB/NAC
49、L溶液10CTAB，07MNACL在80ML双蒸水中溶解41GNACL，然后缓慢加入10GCTAB十六烷基三甲基溴化铵，同时加热并搅拌，可加热至65溶解，定容终体积至100ML；13RNASEA溶液将RNASEA溶于10MOL/LTRISHCLPH75，15MMOL/LNACL中，配成10MG/ML的溶液，于100加热15分钟，冷却后用15ML离心管分装成小份保存于20。13实验仪器1BIORAD梯度PCR仪2EPPENDORF微量移液器3EPPENDORFCENTRIFUGE冷冻离心机（5415R）4EPPENDORFCENTRIFUGE冷冻离心机（5415D）5电泳仪（BGPOWER600I）上海精宏实验设备有限公司产品6电子天平（AL104）梅特勒托利多仪器有限公司产品7台式高速冷冻离心机（TGL16M）长沙湘仪离心机仪器有限公司8紫外可见分析装置9UV3100PCSPECTROPHOTOMETER分光光度计10电热恒温水槽DK8D型上海精宏实验设备有限公司产品11超低温冷冻冰箱12RXZ智能型人工气候箱宁波江南仪器厂产品13水平摇床14XYJ875净化工作台（GB616885）苏州市伟业空调净化有限公司产品15微电脑
