1、本科毕业论文系列开题报告生物工程曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN4的克隆与表达一、选题的背景与意义PEROXIREDOXIN4是新近发现的抗氧化酶家族成员中的一个亚类，具有独特的催化特性和可逆性过氧化循环，广泛存在于各种生物体内。近年来PEROXIREDOXIN4研究发展迅速，PEROXIREDOXIN4的抗氧化性以及PEROXIREDOXIN4在不同生物组织中的分布广泛性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值，在不同的生物组织中作用机制各不相同。PEROXIREDOXIN4在细胞内主要起抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用；参与
2、细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。在生物养殖、生物工程、生物制药、生理活动调控、疾病防治、研究寄生性原虫疫苗等方面展示出广阔的应用前景。而关于曼氏无针乌贼的PEROXIREDOXIN4的作用目前尚不明确，更没有人做过关于它的研究。所以对曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN4进行克隆与表达，研究它的特殊生物学功能具有重大的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1克隆PEROXIREDOXIN4CDNA全长及其氨基酸序列分析2检测PEROXIREDOXIN4在不同组织中表达情况和分析3进行PEROXIREDOXI
3、N4关键结构域的重组及其电泳检测4不同环境因子影响后的表达情况5所得到重组蛋白的活性检测三、研究的方法与技术路线1PEROXIREDOXIN4全长CDNA序列的克隆与获得2基因的核苷酸分析和氨基酸序列分析3重组表达载体的构建及转化宿主菌4重组蛋白的诱导表达5表达产物的初步分析6重组蛋白的电泳检测7含有重组质粒的宿主菌的扩大培养和分离纯化8重组蛋白的浓度和活性测定四、研究的总体安排与进度201010201011毕业论文选题201011201012进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方案。201012201012撰写综述和开题报告及任务书。201012开题报告答辩2011120112实地
4、采样、试验研究、数据处理和分析2011220113完成外文翻译2011320114论文撰写2011420115提交并答辩五、主要参考文献1章波,向渝梅,白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展J生理科学进展,2004,3543523552RHEESG,KANGSW,CHANGTS,ETALPEROXIREDOXIN,ANOVELFAMILYOFPEROXIDASEJIUBMBLIFE,2001,52235413史河秀,王世鄂2CYSPEROXIREDOXINS的研究进展J解剖学研究,2007,2953803834MIZUSAWAH,ISHII,T,BANNAISPEROXIREDO
5、XINIMACROPHAGE23KDASTRESSPROTEINISHIGHLYANDWIDELYEXPREASEDINTHERATNERVOUSSYSTEMJNEUROSCILETT,2000,283457605IMMENSCHUHS,BAUMGARTVOGTE,TANM,ETALDIFFERENTIALCELLUARANDSUBCELLULARLOCALIZATIONOFHEMEBLINDINGPROTEIN23/PEROXIREDOXINIANDHEMEOXYGENASELINRATLIVERJJHISTOCHEMCYTOCHEM,2003,518162116316张成林,李建远抗氧化蛋
6、白PEROXIREDOXIN6研究进展J医学研究杂志,2010,3961211247王蔚,刘芸等过氧化物氧化还原蛋白家族的功能与调节机制J生命的化学,2010,241841888JANGHH,LEEKO,CHIYH,ETALTWOENZYMESINONE,TWOYEASTPEROXIREDOXINSDISPLAYOXIDATIVESTRESSDEPENDENTSWITHINGFROMAPEROXIDASETOAMOLECULARCHAPERONEFUNCTIONJCELL,2004,11756256359JANGHH,KIMSY,PARKSK,ETALPHOSPHORYLATIONANDCON
7、COMITANTSTRUCTURALCHANGESINHUMAN2CYSPEROXIREDOXINISOTYPEIDIFFERENTIALLYREGULATEITSPEROXIDASEANDMOLECULARCHANPERONEFUNCTIONSJFEBSLETT,2006,580235135510LEEW,CHUIKS,RIDDELLJ,ETALHUMEMPEROXIREDOXIN1AND2ARENOTDUPLICATIVEPROTEINSTHEUNIQUEPRESENCEOFCYS83INPRX1UNDERSCORESTHESTRUCTURALANDTUMCTIONALDIFFERENCE
8、SBETWEENPRX1ANDPRX2JBIOLCHEM,2007,2824220112202211WOOHA,CHAEHZ,HWANGSC,ETALREVERSINGTHEINACTIVATIONOFPEROXIREDOXINSCAUSEDBYCYSTEINESULFINICACIDFORMATIONJSCIENC,2003,300665365612YOYD,CHUNGYM,PARKJK,ETALSYNERGISTICEFFECTOFPEROXIREDOXINIIANTISENSEONCISPLATININDUCEDCELLDEATHJEXPMOLMED,2002,34427327313CH
9、ENMF,CHENWC,WUCT,ETALP53STATUSISAMAJORDETERMINANTOFEFFECTSOFDECREASINGPEROXIREDOXINIEXPRESSIONONTUMORGROWTHANDRESPONSEOFLUNGCANCERCELLSTOTREATMENTJINTJRADIATONCOLBIOLPHYS,2006,6651461146314ZHANGB,WANGY,LIUK,ETALADENOVIRUSMEDIATEDTRANSFEROFSIRNAAGAINSTPEROXIDOXINIENHANCESTHERADIOSENSITIVITYOFHUMANINT
10、ESTINALCANCERJBIOCHEMPHARMACOL,2008,75366066215王春琳,樊晓旭,余红卫等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构动物学报,2008,54236637216李星颉,戴建寿,唐志跃曼氏无针乌贼怀卵量及生殖力J浙江水产学院学报,1985,411717郭新,范广钻,郏国生浙江近海曼氏无针乌贼食性的初步分析J浙江水产学院学报,1985,4214514618林福申我国的曼氏无针乌贼资源J海洋信息,1991,45252619吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报,1990,14214915220章波,粟永萍,艾国平PEROXI
11、REDOXIN蛋白家族与电离辐射J中华放射医学与防护杂志,2005,251959721舒勍,程训佳PEROXIREDOXIN与寄生虫J中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20211511822刘转转,王海龙,马广源等刚地弓形虫PEROXIREDOXIN基因的克隆与表达与免疫原性分析J中国人兽共患病学报,2009,4433433823章波,许雪青等小鼠PEROXIREDOXIN基因家族的生物信息学分析J第三军医大学学报,2005,27984785024林育涛寄生性原虫中PEROXIREDOXIN的研究进展J国际医学寄生虫病杂志,2006,3523323625张庆利,李富花,张继泉等中国对明虾过
12、氧化物还原酶基因在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定J中国生物工程杂志,2008,2824752毕业论文文献综述生物工程PEROXIREDOXIN4研究概况摘要PEROXIREDOXIN4是新近发现的抗氧化酶家族成员中的一个亚类，具有独特的催化特性和可逆性过氧化循环，广泛存在于各种生物体内。近年来PEROXIREDOXIN4研究发展迅速，PEROXIREDOXIN4的抗氧化性以及PEROXIREDOXIN4在不同生物组织中的分布广泛性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值，在不同的生物组织中作用机制各不相同。PEROXIREDOXI
13、N4在细胞内主要起抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用；参与细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。在生物养殖、生物工程、生物制药、生理活动调控、疾病防治、研究寄生性原虫疫苗等方面展示出广阔的应用前景。关键词PEROXIREDOXIN4；生物学功能；作用机制和肿瘤；应用前景；1、PEROXIREDOXINS（PRXS）家族概述PRXS首先是从酵母中的25KD蛋白质鉴定出来的，最初被命名为巯基特异性抗氧化酶，这种特殊的过氧化物酶引起了很多研究者的兴趣，大量的亚型和特性相继在哺乳动物细胞中发现，接着在各种生物体内都发现了他
14、们的踪迹。目前，已发现的PEROXIREDOXIN蛋白在SWISSPROT数据库中总共有78个相关记录。动物的PEROXIREDOXIN家族包括6个成员，PRX、和。6个成员的同源性比较结果表明PRXI的同源性相对较高；PRXV与其它成员的同源性约为10左右，没有显著的相似性；而PRXVI与另外4个成员的同源性相对较低，约为40左右。研究表明高等真核生物的同源基因在低等真核生物中仍具有功能，这显示该家族基因在进化上的保守性12。PRXS可以分为3个亚类2CYSPRXSPRX其氨基末端和羧基末端分别有一个高度保守半胱氨酸残基CYS且需要这两个残基共同参与氧化还原反应，其中一个氧化态的和一个还原态
15、的半胱氨酸形成分子间二硫键，构成同型二聚体；不典型2CYSPRX（PRX也包含两个氨基残基，位于同一肽中，氧化态和还原态的半胱氨酸构成单体；1一CYSPRX只在氨基末端含一个保守半胱氨酸残基且只需要这一个半胱氨酸发挥氧化还原作用34。2、分布PRX和PRX位于细胞质中；PRX表达线粒体定位序列而特异的位于线粒体；PRX分布于内质网，因其氨基末端有分泌蛋白信号序列，合成后常分泌到细胞外；PRX和和PRX位于细胞质中57。3、PEROXIREDOXINS生物学功能通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物，在消除代谢产生的过氧化物中具有重要作用。然而对该家族基因的生物学功能研究显示其还具有其他的活性参与
16、细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢；通过调节细胞内过氧化氢的浓度参与细胞因子信号的级联放大等，还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。31抗氧化与自由基清除功能该家族蛋白均具有将过氧化氢还原为水的能力。其中2CYSPRX以硫氧还蛋白为电子受体，而1CYSPRX的电子受体还不明确。在氧应急条件下，该家族基因的表达被上调，以清除细胞内多余的活性氧分子。32细胞增殖与分化家族的某些成员具有刺激细胞增殖的功能。PRX蛋白也被称为增殖相关蛋白，PROLIRMIONASSOCIATEDPROTEIN，PAG，与细胞增殖和分化密切相关。在原代培养的人乳腺上皮细胞系中，
17、血清刺激能诱导PAG的表达升高，且RAS转化后的细胞对血清刺激的反应更明显。而在HL60细胞诱导分化时，细胞增殖停止，该基因的表达降低。此外，PRX蛋白也被称为造骨细胞特异因子OSTEOBLASTSPECIFICFACTOR，OSF3，是从造骨细胞系MC3T3E1中克隆，能促进骨细胞的增殖。研究证实，其反义RNA能抑制MEL细胞的分化，这提示该基因产物与细胞增殖和分化相关。33参与细胞信号传导有证据表明，过氧化氢是细胞内的一种信号分子，其浓度在真核细胞中受到严格控制。过高的过氧化氢会损害细胞功能，甚至导致细胞死亡。作为细胞内信号分子，它可以与信号通路中蛋白质的巯基反应，使之活化或失活。其中，P
18、EROXIREDOXIN家族蛋白可能具有重要作用。另外，在一些细胞因子的信号转导中，过氧化氢具有重要的作用。342CYSPEROXIREDOXINS的分子伴侣功能不仅作为过氧化物酶清除过氧化氢起抗氧化作用，且在氧化应激下发生过氧化引起结构改变起分子伴侣作用。JANG8等研究发现酵母CPRX和暴露在氧化应激下，其从低分子量转变为高分子量复合物，使其经历了从过氧化物酶到分子伴侣的功能转变，后来在人类中也发现了这种作用，将HPRXI磷酸化的靶氨基酸残基THR90替换为ASP模拟磷酸化状态，其分子伴侣功能增强，并伴随着高分子量复合物产生9。而且不同PRX的分子伴侣功能不同，PRXI在83点位上有一个半
19、胱氨酸，二聚体能通过二硫键形成多聚体功能增强，PRX的功能就较弱但有更强的抗氧化能力10。4、PEROXIREDOXIN蛋白的抗氧化作用机制PEROXIREDOXIN不含有结合金属的离子，无需与金属离子结合就具有抗氧化作用。PEROXIREDOXIN含高度保守的具还原活性的半胱氨酸，与酶的抗氧化活性有关，该位点的突变研究证实了其为活性部位。两类PEROXIREDOXIN在作用机制上有所不同。2CYSPRX以同源二聚体形式存在。在发挥抗氧化作用时，其一条肽链上的CYS巯基与另一肽链上的CYS”巯基之间脱氢形成分子间二硫键即CYSSSCYS”，以供氢而还原氧化，其中间产物为CYSSOH。然后再依靠
20、硫氧还蛋白为供氢体将还原型辅酶的H转移至PEROXIREDOXIN，使其恢复原来的结构和功能。故其还原能力最终来自还原型辅酶。体外研究显示当缺乏生理性供氢体时，一些小分子物质如二硫苏糖醇D33“、巯基乙醇等可以作为其供氢体，但是谷胱甘肽不能作为供氢体。在发挥功能时，有部分蛋白被过氧化为CYSSOH而失活。PRXV在发挥氧化还原功能时，其作用机制与前者有所区别它依靠分子内二硫键CYSSSCYS的形成来供氢，而由硫氧还蛋白将其还原。1一CYSPEROXIREDOXIN因仅含一个CYS残基，故主要是通过肽链CYS氧化为CYSSOH而提供氢离子来还原氧化物，其供氢体不明确。其作用机制尚需进一步研究11
21、。5在肿瘤中的作用PRXS蛋白对肿瘤细胞的支持保护作用提示其成为肿瘤治疗靶点的可能，YO12等发现将胃癌细胞转染PRX2基因的反义核酸可促进抗肿瘤药物顺铂诱导的细胞凋亡。CHEN13等用PRX1基因的反义核酸转染人肺癌细胞可增强其对放疗的敏感性，进一步研究发现PRX1低表达后引起的肿瘤抑制和放疗增敏作用与肿瘤抑制基因P53的活化有关。ZHANG14等用PRX1SIRNA干扰人肠癌细胞SW480后发现，低表达PRX1的肿瘤细胞凋亡增加，移植到裸鼠细胞的人肠癌瘤体在放射前注射PRX1SIRNA可增加瘤体对放疗的敏感性。另外，乌贼墨汁储存于墨囊中，王春琳16等对曼氏无针乌贼1619墨囊进行了组织学及
22、墨汁形成的超微结构，研究表明墨囊壁由外膜、肌肉层和黏膜三部分组成，墨腺体呈索状，集中于墨囊底部，墨汁颗粒以游离态形式分布于索状腺体的间隙及墨囊腔中。在具有分泌黑色素功能的B型细胞中可见黑色素颗粒储存在囊泡中，囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大，泡内黑色素逐渐增多。囊泡可能通过胞吐的形式排出细胞外，黑色素排出后以颗粒的形式游离于细胞间隙中，形成墨汁。有关乌贼的墨汁，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等病症。乌贼墨对非特异性免疫及特异性免疫功能均有影响。一方面能提高巨噬细胞活性,发挥非特异性免疫作用,抑制肿瘤生长另一方面,能作为免疫佐剂,促进抗体产生
23、,提高特异性免疫功能,特别是体液免疫；在抗癌药物所致白细胞数低下时乌贼墨具有明显升白作用。6展望PEROXIREDOXIN4是新近发现的抗氧化酶家族成员中的一个亚类，在生物体内对活性氧族的清除中发挥重要作用。随着研究的深入，该蛋白家族的生理、生化功能已清楚地呈现在人们面前，且其个别成员新的生理作用也不断被发现。是否还存在该家族的新成员呢目前，人类基因组计划的完成为回答此问题提供了便利。此外如果能深入的了解PEROXIREDOXIN4在生物体内所扮演的角色，调整和发挥其对人们生产和生活有利的一面，将有利于发掘和利用生物这一资源宝库以造福人类。PEROXIREDOXINS在多种肿瘤细胞中均具有较高
24、表达，可能是肿瘤的一种潜在的标志物20；PRXS可以帮助寄生性原虫在有氧环境下生存而致病，为药物设计提供了新的思路，此外，其还参与宿主与寄生性原虫之间的相互作用，在某些寄生性原虫2125的诊断起作用，有很好的应用前景；PRXS免疫动物后能否产生保护作用，又为我们提供新的研究课题。参考文献1章波,向渝梅,白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展J生理科学进展,2004,3543523552RHEESG,KANGSW,CHANGTS,ETALPEROXIREDOXIN,ANOVELFAMILYOFPEROXIDASEJIUBMBLIFE,2001,52235413史河秀,王世鄂2CYS
25、PEROXIREDOXINS的研究进展J解剖学研究,2007,2953803834MIZUSAWAH,ISHII,T,BANNAISPEROXIREDOXINIMACROPHAGE23KDASTRESSPROTEINISHIGHLYANDWIDELYEXPREASEDINTHERATNERVOUSSYSTEMJNEUROSCILETT,2000,283457605IMMENSCHUHS,BAUMGARTVOGTE,TANM,ETALDIFFERENTIALCELLUARANDSUBCELLULARLOCALIZATIONOFHEMEBLINDINGPROTEIN23/PEROXIREDOXIN
26、IANDHEMEOXYGENASELINRATLIVERJJHISTOCHEMCYTOCHEM,2003,518162116316张成林,李建远抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN6研究进展J医学研究杂志,2010,3961211247王蔚,刘芸等过氧化物氧化还原蛋白家族的功能与调节机制J生命的化学,2010,241841888JANGHH,LEEKO,CHIYH,ETALTWOENZYMESINONE,TWOYEASTPEROXIREDOXINSDISPLAYOXIDATIVESTRESSDEPENDENTSWITHINGFROMAPEROXIDASETOAMOLECULARCHAPERON
27、EFUNCTIONJCELL,2004,11756256359JANGHH,KIMSY,PARKSK,ETALPHOSPHORYLATIONANDCONCOMITANTSTRUCTURALCHANGESINHUMAN2CYSPEROXIREDOXINISOTYPEIDIFFERENTIALLYREGULATEITSPEROXIDASEANDMOLECULARCHANPERONEFUNCTIONSJFEBSLETT,2006,580235135510LEEW,CHUIKS,RIDDELLJ,ETALHUMEMPEROXIREDOXIN1AND2ARENOTDUPLICATIVEPROTEINST
28、HEUNIQUEPRESENCEOFCYS83INPRX1UNDERSCORESTHESTRUCTURALANDTUMCTIONALDIFFERENCESBETWEENPRX1ANDPRX2JBIOLCHEM,2007,2824220112202211WOOHA,CHAEHZ,HWANGSC,ETALREVERSINGTHEINACTIVATIONOFPEROXIREDOXINSCAUSEDBYCYSTEINESULFINICACIDFORMATIONJSCIENC,2003,300665365612YOYD,CHUNGYM,PARKJK,ETALSYNERGISTICEFFECTOFPERO
29、XIREDOXINIIANTISENSEONCISPLATININDUCEDCELLDEATHJEXPMOLMED,2002,34427327313CHENMF,CHENWC,WUCT,ETALP53STATUSISAMAJORDETERMINANTOFEFFECTSOFDECREASINGPEROXIREDOXINIEXPRESSIONONTUMORGROWTHANDRESPONSEOFLUNGCANCERCELLSTOTREATMENTJINTJRADIATONCOLBIOLPHYS,2006,6651461146314ZHANGB,WANGY,LIUK,ETALADENOVIRUSMED
30、IATEDTRANSFEROFSIRNAAGAINSTPEROXIDOXINIENHANCESTHERADIOSENSITIVITYOFHUMANINTESTINALCANCERJBIOCHEMPHARMACOL,2008,75366066215王春琳,樊晓旭,余红卫等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构动物学报,2008,54236637216李星颉,戴建寿,唐志跃曼氏无针乌贼怀卵量及生殖力J浙江水产学院学报,1985,411717郭新,范广钻,郏国生浙江近海曼氏无针乌贼食性的初步分析J浙江水产学院学报,1985,4214514618林福申我国的曼氏无针乌贼资源J海洋信息,1991,4
31、5252619吴耀泉,唐质灿黄河口及莱州湾哈曼氏无针乌贼的群体组成和洄游分布J水产学报,1990,14214915220章波,粟永萍,艾国平PEROXIREDOXIN蛋白家族与电离辐射J中华放射医学与防护杂志,2005,251959721舒勍,程训佳PEROXIREDOXIN与寄生虫J中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2002,20211511822刘转转,王海龙,马广源等刚地弓形虫PEROXIREDOXIN基因的克隆与表达与免疫原性分析J中国人兽共患病学报,2009,4433433823章波,许雪青等小鼠PEROXIREDOXIN基因家族的生物信息学分析J第三军医大学学报,2005,2798478
32、5024林育涛寄生性原虫中PEROXIREDOXIN的研究进展J国际医学寄生虫病杂志,2006,3523323625张庆利,李富花,张继泉等中国对明虾过氧化物还原酶基因在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定J中国生物工程杂志,2008,2824752本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼过氧化物还原酶PEROXIREDOXIN4基因的克隆目录中英文摘要1引言12材料和方法321试剂和仪器3211试剂3212仪器322试验方法3221曼氏无针乌贼总RNA的提取3222PRX4基因全长的克隆4223曼氏无针乌贼3RACE末端扩增4224感受态细胞的制备6225感受态细胞的连接6226感受态细胞的
33、转化63结果与讨论731曼氏无针乌贼总RNA的提取及3RACE扩展曼氏无针乌贼PRX4基因3末端7311曼氏无针乌贼总RNA的提取73123RACE扩展曼氏无针乌贼PRX4基因3末端732SMPRX4基因的核苷酸序列分析833SMPRX4基因的同源性分析和进化分析84讨论与总结1341讨论1342总结13致谢14参考文献15摘要曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是我国四大海产渔业之一，作为主要经济鱼种是浙江沿海传统捕捞对象。但由于过度捕捞，乌贼的资源锐减，已形不成鱼讯，目前仅作为兼捕对象。因此，对曼氏无针乌贼进行生化分子机制的研究工作显得尤为迫切。本研究采用大规模EST测序方法，结合末端快速扩增（R
34、APIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE）技术从曼氏无针乌贼肝脏中克隆到过氧化物还原酶4（PROXIREDOXIN4，SMPRX4）基因的CDNA序列全长；曼氏无针乌贼PRX4基因的CDNA序列全长为1023BP，5UTR（UNTRANSLATEDREGION，UTR）为45BP，3UTR为243BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAMEORF）为735BP，编码245个氨基酸，SMPRX4的预测分子量为273KDA，理论等电点为699。MRNA3端具有多聚腺甘酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）TAAAAA和POLYA尾巴。关键词曼氏无针乌
35、贼；过氧化物还原酶4；EST测序；基因克隆；ABSTRACTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNEISANIMPORTANTECONOMICFISHERYRESOURCES,ONCEISONEOFCHINASFOURMAJORMARINEFISHERY,ASTHEMAINECONOMICFINGERLINGISZHEJIANGCOASTALTRADITIONALFISHINGOBJECTBUTDUETOOVERFISHING,THESQUIDSRESOURCESDOWNSHARPLY,DONOTFORMFISINGSEASONALREADY,CURRENTLYONLYASA
36、NDCATCHINGOBJECTSOFORBIOCHEMICALMOLECULARMECHANISMOFRESEARCHWORKAPPEARMOREIMPORTANTANDURGENTABOUTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNETHISSTUDYADOPTSEXTENSIVEESTSEQUENCINGMETHODS,RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDSTECHNOLOGYFROMSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNESLIVERCLONEPROXIREDOXIN4GENESCDNASEQUENCEFULLLENGTH,PRX4GE
37、NESFOR1023BPCDNASEQUENCELENGTH,5UTR（UNTRANSLATEDREGION，UTR）FOR45BP,3UTRFOR243BP,OPENREADINGFRAMEORF）FOR735BP,CODING245AMINOACIDSMRNA3ENDHASPOLYADENYLATIONSIGNALTAAAAAANDPOLYATAILKEYWORDSSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE；PEROXIREDOXIN4；ESTSEQUENCING；GENECLONING；1引言曼氏无针乌贼SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE（以下简称
38、乌贼），俗称墨鱼，属软体动物门（MOLLUSCA）、头足纲（CEPHALOPODA）、二腮亚纲（DIBRANCHIA）、十腕目（DECAPODA）、乌贼超科（SEPIACEA）、乌贼科（SEPIIDAE）、无针乌贼属（SEPIELLA），是沿海广温广布种，广泛分布于我国渤海、黄海、东海、南海以及日本东京湾、富山湾以西、韩国、马来群岛、菲律宾群岛、苏联远东海和印度洋海域。我国曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是浙江渔场四大渔业之一，作为主要经济鱼种被捕捞，浙江省历史最高年产量（1957年）达到67万吨。但由于过度捕捞，资源遭到很大破坏，渔汛消失，80年代后期，特别是90年代以来，种质资源明显衰减，产量
39、急剧下降，目前仅作为兼捕对象。关于曼氏无针乌贼形态构造，生态生理以及渔业资源等方面的研究已有零星报道，80年代，唐逸民和李星颉等人进行了乌贼增殖及繁殖保护工作作了一些调查研究的工作。在繁殖方面，国外学者ROPERV等（1996）观察了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的交配现象，YOUNGRE等（1985）研究了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的卵与幼体，WATANABE1998研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的胚胎发育，NIGMATULLINCM（1995）研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的年龄、生长和繁殖生物学等。乌
40、贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成的最后一步需要在过氧化物酶的催化下完成。过氧化物还原酶（PEROXIREDOXIN，PRX）是广泛存在于各类生物体中的一种重要的抗氧化酶，它是生物体应对活性氧族侵害机制中具有重要作用的蛋白。PEROXIREDOXINS蛋白广泛存在于各类生物体中，并且在细胞中的表达量很高，是大肠杆菌中十大丰富表达的蛋白之一（FISHERABETAL，1999），是真核细胞生物表达量位居前三的蛋白（SHICHIH，1990）。尽管第一个PRX蛋白是在酵母上得鉴定，但相继而来的其他PRX亚型及其特性是在哺乳动物中得到发现的。在哺乳动物中一共发现六种PRX蛋白，分别命名为PRX，PRX
41、，PRX，PRX，PRX，PRX（见表11）。PRX家族蛋白最初根据所含有保守半胱氨酸的数目，分为两个亚型家族，即2CYS型和1CYS型，前者仅在52位上有一个高度保守的CYS，后者则在52和172位上分别有一个高度保守的CYS。PRX属于1CYS，其他成员属于2CYS。然而根据各个成员之间的同源性和保守CYS的不同，现在更趋向于将六种PRX蛋白分为3种类型（CHANGTSETAL，2002）典型2CYS型，非典型2CYS型和1CYS型。典型的2CYS型包括PRXPRX，除了N端保守的CYS残基之外，C端还有一个保守的CYS残基，称为典型2CYS型PRX蛋白；PRX除了具有一个N端保守的CYS
42、残基之外，还有两个保守性较低的CYS残基，称为非典型性2CYS型PRX蛋白（LEYENSG，2003）；PRX仅在N末端具有一个保守的CYS残基，称为1CYS型PRX蛋白。哺乳动物中六种亚型的PRX蛋白的同源性比较结果表明，2CYS型PRX蛋白之间同源性相对较高；1CYS型PRX蛋白与2CYS型蛋白的同源性约为40，同源性较低；非典型2CYS型PRX蛋白与家族中其他五种类型的PRX蛋白没有显著相似性，同源性约为10左右。高等生物中的同源基因在低等真核生物中仍具有功能，这表明PRX蛋白家族在进化上具有很高的保守性（TIENNETAL，2003）。表11哺乳动物的六种亚型PRX蛋白TABLE11S
43、IXSUBCLASSESOFPEROXIREDOXINSFROMMAMMALSPRXSUBTYPESPRXPRXPRXPRXPRXPRXPREVIOUSNOMENCLATURETPXANKEFAMSP23OSF3HBP23PAGTPXBNKEFBPRPCALPROMOTINTORINBAND8TSAAOP1SP22MER5AOE372TRANKAOEB166PMP20AOPPORF06LTW4AOP2POLYPEPTIDELENGTH199AA198AA256AA271AA214AA224AAHUMANCHROMOSOMALLOCATION1Q34113Q1210Q25Q2610Q221311
44、Q131Q232CELLLARLOCATIONCYTOSOL，NUCLEUSCYTOSOL，MEMBRANEMITOCHONDRIANCYTOSOL，GOLGI，SECRETEDMITOCHONDRIAN，PEROXISOME，CYTOSOLCYTOSOLGENEBANKAAA50464AAA50465BAA08389AAB95175AAF03750BAA034961引言曼氏无针乌贼是一种具有强抵抗力，不易受病菌侵害的水产经济动物，并且曼氏无针乌贼卵也具有一定的抗菌能力，在适当的温度下能在恶劣的外环境中存活。为了探明PEROXIREDOXIN4基因在曼氏无针乌贼成体以及胚胎发育过程中是否具有一
45、定的作用，本研究拟对PRX4基因CDNA序列全长进行克隆并进行简要分析，为今后研究其跟黑色素形成之间的关系以及PEROXIREDOXIN蛋白在曼氏无针乌贼抗氧化系统中的作用打下分子基础。这不仅在学术上有重要意义，还将对提升曼氏无针乌贼的药用价值、经济价值和曼氏无针乌贼大规模养殖发展起促进作用。曼氏无针乌贼是我国重要的水产经济动物，但近年来疾病的频发给养殖业造成了巨大的经济损失。由于免疫学方面的基础研究较少，面对日益严重的病害问题以及病因的多样性，目前尚无有效的疾病防治措施来保证曼氏无针乌贼健康养殖和可持续发展。在对曼氏无针乌贼的病原和环境因子进行研究的同时，从机体本身入手，研究其免疫防御机制，
46、对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有重要意义。PEROXIREDOXIN4在细胞内主要起抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用；参与细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。在生物养殖、生物工程、生物制药、生理活动调控、疾病防治、研究寄生性原虫疫苗等方面展示出广阔的应用前景。而关于曼氏无针乌贼的PEROXIREDOXIN4的作用目前尚不明确，更没有人做过关于它的研究。所以对曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN4进行克隆与表达，研究它的特殊生物学功能具有重大的意义。本研究的主要内容是通过克隆得到曼氏无针乌贼PEROXIRE
47、DOXIN4的CDNA全长序列并进行简要分析。2材料和方法21试剂和仪器211试剂TRIZOLREGANT、3FLIRACECORESETVER20、TAKARALATAQ、琼脂糖凝胶、胶回收试剂盒、普通TAQ酶、核算MARKER、PCR产物克隆载体PMD18TVECTOR、DNTPS均购自大连宝生物（TAKARA）公司LB培养基、DEPC水购自上海捷瑞生物有限公司，氨芐青霉素购自上海生工其他试剂均为国产分析纯试剂。LB液体培养基25G培养基粉末溶解于1L纯水中，高压灭菌。含氨芐青霉素的LB培养及平板1L的培养基中加入15G琼脂，高压灭菌，冷却至50时加入终浓度为100G/ML的氨芐青霉素，倒
48、平板。当培养基凝固后，贮存于4备用。212仪器磁力搅拌棒GAYGENE,STIRRER1DB离心机BAYGENE,BGQSPINM脱色摇床TS1000紫外分光光度计752S凝胶成像系统BIORAD,UNIVERSALHOODII恒温水槽DK8D变频摇床BHWR100B液氮罐YDS3普通冰箱HAIR,BCD153TF无菌接种箱WJZJX水平电泳仪ABYGENE,BGSUBMIDI便携式电子精密天平SARTORIUS,TE612L超低温冰箱DW86L388电热恒温鼓风干燥箱DHG9053A实时荧光定量PCR仪器RTCYCLER236PCR仪TECHNE,TC512超净工作台YJ875垂直板电泳仪B
49、AYGENE,VERMINI冷冻离心机THERMO,AULFUGEPRIMOR蒸馏水器SZ93分析天平METTLER,EL104高压灭菌锅LDZX30KBS超声波细胞破碎仪酸度计FE20K微量可调移液器EPPENDORF超微量分光光度计NANODROPND20022试验方法221曼氏无针乌贼总RNA的提取成体曼氏无针乌贼采自浙江省宁海县得水育苗场。选取胴长810CM的乌贼新鲜个体，更有利于实验结果的准确性，然后用高温灭菌的手术剪快速解剖，剪取得到1CM3左右体积的肝脏，解剖中尽量做到无菌无尘，将得到的肝脏置于事先准备好的加入1MLSAMPLEPROTECTOR的15ML离心管中，此离心管室温可保持24H，长期保持则需置于20冰箱中。剪取肝脏组织1020管，用于PRX4基因全长的克隆实验。用TRIZOLREGANT试剂（购自TAKARA）提取曼氏无针乌贼总RNA。提取RNA过程中所有枪头和离心管均用DEPC处理，研钵、镊子、剪刀等非塑料制品高温180干燥灭菌处理。曼氏无针乌贼总RNA提取具体操作步骤如下（1）取1CM3左右体积的肝脏组织，用吸水纸吸取液体，置于研钵中加入液氮研磨成粉末。趁液氮未挥发光时，将粉末转移到15MLRNASEF
