1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境三疣梭子蟹养殖塘弧菌群落结构研究一、选题的背景与意义三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）是我国海产经济蟹类，其肉质鲜美、营养丰富、经济价值高，在国内外享有盛名。近年来，由于养殖规模的不断扩大、养殖密度不断提高、养殖环境的污染等损害了三疣梭子蟹免疫防御系统，导致自身的抗病力下降，对病害的易感性增加，疾病频繁发生，例如近几年由弧菌引起的“乳化病”给三疣梭子蟹养殖业带来了重大经济损失（陈萍等，2009）。目前，有关“乳化病”的病原鉴定、病理和组织生理变化的研究国内已有不少报道刘淇等2007；王国良等2006，施慧等2005；许文军等2
2、003，但目前对于疾病爆发与水体环境微生物群落的关系研究较少，倪纯治等（1995）有研究过弧菌数量与虾病的关系。弧菌与疾病爆发的关系一般认为是由于水体中某特定种类的弧菌大量繁殖而引发疾病，水产品的弧菌检测也多是针对某特定弧菌而建立的，因而，养殖水体的弧菌数量常常被看做疾病爆发的重要征兆之一，但是，弧菌种类繁多，致病性菌株只占一小部分，大部分是非致病菌，因此，相较于弧菌数量，弧菌群落的结构组成可能与疾病爆发更为相关。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题我们拟选取两个代表性的三疣梭子蟹养殖塘，其中一个塘中梭子蟹发生类似“牛奶病”的疾病，其典型症状为三疣梭子蟹沿岸爬上，活动力差呼吸困难、行动迟缓，打
3、开蟹盖，盖内可见大量乳白色液体，发病蟹死亡率为100，造成梭子蟹连续不断死亡，称为病害塘，另一个塘，没有明显的梭子蟹死亡迹象，称为健康塘。然后基于细菌计数、菌落特征和16SRDNA基因序列比对对这两个三疣梭子蟹养殖塘的养殖水体中的弧菌群落组成进行比较研究，以期揭示养殖塘弧菌群落结构变化与三疣梭子蟹疾病发生的关系。三、研究的方法与技术路线研究方法先进行一些简单的预实验，了解基本情况，然后设计好实验方案。之后采集样品，涂布计数，分离纯化保种，菌落观察，然后提DNA，做DGGE，挑选出条带不同的菌株，做PCR，测序，鉴定弧菌的分类地位，最后分析数据，撰写论文。技术路线四、研究的总体安排与进度总体安排
4、12010年6月及之前，进行预实验，熟悉各项实验操作方法，设计实验方案22010年79月，完成实验过程，得到实验数据，做好总结32010年12月，开题报告42011年24月，分析数据，撰写论文52011年5月，论文答辩进度因为要考研，所以毕业论文的实验完成得较早，在2009年暑期就已经完成实验，得采样稀释涂布菌落计数分离纯化菌落观察涂布时平板可适度干燥些，可以放置一天后使用可事先把要挑取的单菌落标记好保种扩繁提DNA20UL体系PCRDGGE50UL体系PCR测序数据对比，弧菌鉴定分析数据，撰写论文涂布在培养基上的弧菌不易存活，因此实验做好在短期内完成将菌液在摇床上培养过夜，提二天上午提DNA
5、，菌液培养时间不宜过久到了数据，且做好了总结。明年开学后就开始分析数据，撰写论文。五、主要参考文献1闫茂仓,陈少波,单乐州,等海水养殖动物致病弧菌的研究进展水产科学,2009,2884754812王国良，金珊，陈寅儿等三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究海洋研究进展,2006,2445265313倪纯治,林燕顺,叶德赞,等海水养虾池的几种致病弧菌生态台湾海峡,1995,14173794国家海洋局海洋调查规范M北京海洋出版社,19755金珊,王国良,薛良义等海水网箱养殖水域异养细菌和弧菌的数量动态J海洋渔业,1999,2141541566张德民,黄志勇等紫色非硫细菌RHODOCISTA属一新
6、分离株的鉴定及其系统学研究微生物学报,2000,4114207温丹,张德民,初航网箱养殖海区底泥产芽孢细菌多样性J海洋与湖沼,2009,4056156218钱丽君，张德民，徐小红等应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性水产学报，2007，31（2）2042109王保坤,余俊红,李筠,等花鲈弧菌病病原菌哈维氏弧菌的分离与鉴定中国水产科学,2002,91525510张晓君，房海，等致病性哈氏弧菌生物学及分子特征中国兽医学报2009，29（9）11201124毕业论文文献综述海洋生物资源与环境海水养殖动物弧菌病研究进展摘要随着水产养殖的发展，水产品频频发生弧菌病。弧菌（VIBRIO）是海洋
7、中常见的条件致病菌，致病菌有包括溶藻弧菌（VALGINOLYTICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、霍乱弧菌VCHOLERAE在内的10多个种类，目前，关于弧菌病的病原鉴定，病理和组织生理变化，药物防治等方面的研究报道已有很多，研究得也比较透彻，不过关于弧菌病与环境中弧菌群落结构的关系研究相对较少，加大对环境中弧菌群落结构的了解有利于建立新的病害防治方法。关键词弧菌病致病菌种类病症防治方法群落结构近年来，随着水产养殖业的不断发展，水产品养殖密度的不断提高，养殖水体的不断恶化，导致水产品病害频繁发生，对海水养殖产业和环境造成了严重的威胁1，
8、楠田2,LIGHTNER3,林克冰45,郑国兴6,李卢7等学者进行了大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA，对虾PENAEUSCHINENSI，文蛤MERETRIXMERETRIXLINNAEUS，三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS等海水养殖动物的病害研究，发现很多病症的主要致病菌均为弧菌。弧菌主要分布在海洋环境中，是海水养殖产品的主要病原菌之一，因此，该类疾病一直备受国内外研究工作者的关注。国外早在20世纪初就有学者8对海水鱼类弧菌病进行研究，自20世纪60年代后相继出现了多种致病性弧菌的研究和报道912。目前，我国海水养殖业迎来了又一次的养殖高潮，但是由弧菌引起
9、的死亡时有报道1314,是该行业发展的重要限制性因素。据相关报道，溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、哈维氏弧菌（VHARVEYI）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、霍乱弧菌（VCHOLERAE）等10多种弧菌可以引起海水养殖动物发病1519，养殖对象出现皮肤溃烂，烂尾，出血等症状。1致病弧菌种类及其感染症状11溶藻弧菌溶藻弧菌是G菌，通常在固体培养基上以单极生鞭毛运动14,在TCBS培养基上呈黄色菌落。溶藻弧菌能引起南美白对虾、文蛤、牙鲆、大黄鱼等多种海水养殖品种的发病。被感染的大黄鱼发病初期体色变深，充血发炎，胸鳍和腹鳍基部会出血，肛门红肿；随着疾病的发展，发病部位开始
10、溃烂，严重的造成肌肉烂穿或吻部断裂，尾部烂掉。解剖发现内脏器官病变明显，腹部膨胀，肝脏肿大，肾脏充血，有时肠内有黄绿色粘液。出现出血症后，一般17天便死亡，常为急性死亡20。另外，近年来随着养殖规模的不断扩大，三疣梭子蟹中有一种称为肌肉乳化病的病害，其发病率越开越高。发病初期梭子蟹上浮并沿岸爬行，活动力减弱，打开外壳发现鳃腔和体腔的浑浊物质增多，肝胰腺有弥散现象。随着病情的加重，外壳发黄，变软，肌肉糜化，血淋巴变为乳白色，折断步足后流出大量白色体液，患病严重时肌肉可全部液化，如牛奶一般，因此又称为牛奶病。从出现病症到死亡历时约一周，流行时间以初夏、秋季为主，911月份为发病高峰期。21对患有典
11、型溶藻弧菌病的养殖大黄鱼进行细胞病理研究，在此基础上对该病的治病机理和致病原因进行了探讨，认为溶藻弧菌对大黄鱼致病的传播不是经口，而是由体表伤口进入机体。该菌在体表病灶处大量繁殖，产生毒素，使体表出血溃烂，病原菌进入血管，随血液循环至全身，造成全身组织严重损害，最终导致鱼体的死亡22。研究表明，溶藻弧菌对环丙沙星，磺胺TMP，呋喃妥因等较为敏感。可以用来防治大黄鱼由溶藻弧菌引发的疾病20。12哈维氏弧菌从病鱼中分离的哈维氏弧菌端生单鞭毛，在营养琼脂上菌落圆形灰色，在TCBS培养基上菌落呈黄色。哈维氏弧菌感染病鱼的主要症状为皮下出血，肛门发红，头颅两侧、尾鳍末端以及体侧出现红斑，并逐渐发生溃烂；
12、解剖发现病鱼肝肾肿大，肠壁充血并有黄绿色粘液从肛门溢出。一般从体表出现出血症状后，16天死亡，为急性感染，流行时间以夏季高温期为主，89月份为高峰期13。2002年青岛市郊南海区网箱养殖花鲈幼鱼发病，病鱼体表发白，游动迟缓，尾部严重溃烂，经鉴定致病菌为哈维氏弧菌18。哈维氏弧菌也是条件致病菌，通过口或伤口感染，致使伤口肌肉溃烂化脓以及内脏器官的严重病变而导致鱼的死亡。对感染哈维氏弧菌的高体鰤的组织病理研究表明，病鱼的肝脏严重病变，肾小管病变导致尿毒症，骨骼肌纤维与心肌纤维损伤坏死，皮肤溃烂产生慢性出血等23。磺胺类药物可以控制高体鰤的哈维氏弧菌23,在免疫方面。刘国勇等24用3种不同的方法制备
13、灭活的哈维氏弧菌菌苗，实验证明以福尔马林灭活菌苗的免疫原性最强。13副溶血弧菌副溶血弧菌为G菌，弧状，极生单鞭毛。感染了副溶血弧菌的大黄鱼出现下颌与各鳍充血，腹部点状或片状出血，肛门红肿，然后呼吸困难，行动迟缓，最后死亡25该症状与溶藻弧菌的感染症状相似；倪纯治等26把溶藻弧菌和副溶血弧菌的菌悬液加到对虾水族箱中，进行浸染试验，使水中弧菌浓度到达80106个DM3和50108个DM3,经72小时后出现红脚现象，96小时后开始出现死亡，此时病虾肌肉浊白。用试验分离的副溶血弧菌弧菌进行动物攻毒试验，发现小鼠回肠肠液积蓄，甚至出现血性腹水25。副溶血弧菌的致病机理可能是鱼体免疫机能下降时，鱼体易感染
14、寄生虫，后伴随副溶血弧菌继发感染，出现肠炎症状，最后出现出血性败血症，导致鱼体死亡。14霍乱弧菌霍乱弧菌是G菌，弧形或逗点状，菌体一端有单根鞭毛或菌毛，有嗜甲壳类海产品的特性27,能分泌甲壳酶，分解甲壳作为营养而长期存活。霍乱弧菌也可通过食用未煮熟的染病水产品而受感染，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛穿过粘膜，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后在局部产生霍乱肠毒素，使患者出现上吐下泻等症状。邓志爱28等对霍乱弧菌耐药性进行了连续六年全面的监测研究，结果表明，对霍乱弧菌活性最高且历年鳍活性不减的是阿米卡星、头孢呋辛、氧氟沙星和头孢曲松，敏感率均为100，是防治霍乱的首选药物。2小结近年来，我国
15、水产养殖规模不断扩大，海水养殖动物弧菌病的发生率越来越高。目前对于弧菌病的研究，主要集中在病原鉴定，病理和组织生理变化，耐药性等方面，对于疾病爆发与水体弧菌群落的关系研究较少，倪纯治26等有研究过弧菌数量与虾病的关系。但是弧菌种类繁多，其中致病菌只占一小部分，大部分为非致病菌，仅研究水体中弧菌的数量与病害的关系是不够的，相对于数量，弧菌群落的结构组成可能与疾病爆发更为相关，尤其是致病菌的群落结构尤为重要。目前，水产养殖上主要还是利用抗生素来防治弧菌病。长期对水产品使用抗生素，水产品中的抗生素残留量会通过食用水产品进入人体，影响人体健康，防止抗生素的滥用已是全社会的共识，也是弧菌病研究的重要课题
16、，寻找其他有效的防治方法来代替抗生素已十分迫切。研究养殖环境中的弧菌群落结构能为弧菌病的预防提供一点作用。如果能弄清水体弧菌尤其是致病菌的群落结构，了解其与弧菌病爆发的关系，这样我们可以通过检测水体中弧菌群落的变化，预测其可能发生的病变，并提前做好预防的准备，不必等到养殖动物发生病害后才能观察到。因此随着对弧菌病致病菌种的不断鉴定，对其病理的不断了解，人们可以开始将研究重心转移到病害防治方面，如何能有效预防疾病的发生，如何减少抗生素的使用，如果能解决这些问题，将会进一步推动我国海水养殖业健康可持续发展。参考文献1闫茂仓,陈少波,单乐州,等海水养殖动物致病弧菌的研究进展水产科学,2009,288
17、4754812卡伯仲等编著虾类的疾病与防治北京海洋出版社,19823LIGHTNERDVSOMEPOTENTIALLYSERIOUSDISEASEPROBLEMSINTHECULTUREOFPENAEDSHRIMPINTHENORTHAMERICAPROCEEDINGSOFTHE3RDUSJAPANMEETINGONAQUACULTUREATTOKYO,JAPANOCTOBER1516197575974林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究J海洋科学,1999,458625林克冰,周宸海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌J宁波大学学报,1999,12增刊16196郑国兴,李何,黄宁宇
18、,等文蛤病原菌溶藻弧菌的分离与性状及病文蛤组织的电镜观察水产学报,1991,15285947李卢三疣梭子蟹的常见病及其防治水产科技情报,2005,3262692708BERGMAN,AMDIEROTENBEULENKRANKHEITDESALESBERKBAYERBIOVERSUCHSSTR,1909210549SMITH,IWADISEASEOFFINNOCKDUETOVIBRIOANGUILLARUMJGENMICROBIOL19612424725210HORNE,MT,RICHARDS,RH,ROBERTS,RJETALPERACUTEVIBRIOSISINJUVENILETURBOTS
19、COPHTHALMUSMAXIMUSJFISHBIOL19771135536111EGIDIUSE,ANDERSEN,K,CLAUSEN,EETALCOLDWATERVIBRIOSISOR“HITRADISEASE”INNORWEGIANSALMONIDFARMINGJFISHDIS1981435335412LIU,PC,LEE,KK,ANDCHEN,SNSUSCEPTIBILITYOFDIFFERENTISOLATESOFVIBRIOHARVRYITOANTIBIOTICSMICROBIOS,19979136836917518013王国良,金珊海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究黄渤海
20、海洋,2000,183858914黄志坚,何建国鲑鱼石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病菌中山大学学报自然科学版,2002,415646715COLWELL,RR,ANDGRIMES,DJVIBRIODISEASESOFMARINEFISHPOPULATIONSHELGOLANDMEERESUNRERS,19843736528716EGIDIUS,EVIBIOSISPATHOGENICITYANDPATHOLOGYAREVIEWAQUACULTURE,198767152817AUSTIN,B,STOBI,M,ROBERTSON,PAETA1VIBRIOALGINOLYTICUSTHECAUSEOFG
21、ILLDISEASELEADINGTOPROGRESSIVELOWLEVELMORTALITIESAMONGJUVENILETURBOT,SCOPHTHALMUSMAXIMUSLINASCOTTISHAQUARIUMJFISHDIS19931627728018王保坤,余俊红,李筠,等花鲈弧菌病病原菌哈维氏弧菌的分离与鉴定中国水产科学,2002,91525519陈月琴一起副溶血弧菌食物中毒浙江预防医学,2001,1343320金珊,蔡完其,王国良,等养殖大黄鱼细菌性疾病的病原研究浙江海洋学院学报,2002,21322523021王国良,金珊,陈寅儿,等三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究海洋
22、研究进展,2006,24452653122金珊,蔡完其,於宏,等大黄鱼溶藻弧菌病细胞病理变化的初步研究海洋科学,2003,272596223吴后波,潘金培海水网箱养殖高体鰤弧菌病病理学研究水产学报,1999,23220620924刘国勇,毛芝娟,陈超然,等不同方法灭活的哈维氏弧菌菌苗对异育银鲫的免疫原性比较华中农业大学学报,2002,21213914225徐斌福,林能锋,杨金先,等大黄鱼副溶血弧菌的分离、鉴定及致病力分析福建农业学报,2002,17317417726倪纯治,林燕顺,叶德赞,等海水养虾池的几种致病弧菌生态台湾海峡,1995,141737927吴景文,胡茂红,熊志伟我国水体、水（海
23、）产品霍乱监测研究进展现代预防医学,2009,36112137213928邓志爱,莫自耀,李效权,等霍乱弧菌耐药性连续六年监测研究J实用预防医学,2005,124778779本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹养殖塘弧菌群落结构研究目录前言21材料与方法311样品采集312培养基错误未定义书签。13仪器设备错误未定义书签。14弧菌的分离、纯化错误未定义书签。15弧菌基因组DNA的提取及16SRDNA基因的PCR扩增错误未定义书签。16弧菌16SRDNA序列的测定及系统发育学分析错误未定义书签。2结果错误未定义书签。21弧菌数量比较错误未定义书签。22弧菌群落结构多样性5221弧菌菌落类型多样性比
24、较5222弧菌种属分布多样性比较63讨论831养殖水体弧菌群落结构与病害的关系832菌落类型与种属分布的联系833弧菌的培养特性及其对实验的影响94展望10致谢8参考文献9摘要采用平板计数、菌落形态观察和16SRDNA序列比对的方法，对健康和发病的三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）养殖水体的弧菌VIBRIO数量和群落结构进行了比较研究。共分离得到42株弧菌，可分为5个菌落类型（C1C5），6个种。健康塘养殖水体的弧菌数量为185235102CFU/ML，菌落主要分布在C1、C2和C4这3个类型，分布比较均匀，VALGINOLYTICUS有6株，为第一优势种，种属分布也
25、比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌数量为06519102CFU/ML，菌落类型主要集中在C1类型，优势种为VALGINOLYTICUS，与健康塘相比，病害塘养殖水体中的弧菌菌落类型和种属分布均比较集中。这些结果似乎表明三疣梭子蟹发病与群落结构（比如弧菌的多样性、致病性弧菌的绝度优势地位）有直接关系，但与弧菌数量的关系无法从该实验得到。关键词三疣梭子蟹；养殖水体；弧菌；群落结构；16SRDNAABSTRACTWECOMPARETHENUMBERANDTHECOMMUNITYSTRUCTUREOFTHEVIBRIOINTHEHEALTHYANDDISEASEDREARINGWATERBYPLATECO
26、UNT,COLONYCATEGORYAND16SRDNASEQUENCEALIGNMENTMETHODSTHEREARE42VIBRIOSTRAINSISOLATEDFROMTHEREARINGWATERTHEYCANBEDIVIDEDINTOFIVEGROUPSC1C5BYCOLONYCATEGORY,AND6SPECIESBYSEQUENCINGINTHEHEATHYPOND,THENUMBEROFTHEISOLATEDVIBRIOIS185235102CFU/ML,MAINLYCONTRIBUTEDINTHEC1,C2ANDC4GROUPS,VALGINOLYTICUSISTHEFIRS
27、TDOMINANTSPECIESWITH6STRAINS,SPECIESISEVENLYDISTRIBUTEDWHILEINTHEDISEASEDPOND,THENUMBEROFTHEISOLATEDVIBRIOIS06519102CFU/ML,MAINLYCONTRIBUTEDINTHEC1GROUP,THEDOMINANTSPECIESISVALGINOLYTICUSONLYTHESPECIESDISTRIBUTIONISMORECONCENTRATEDINTHEDISEASEDPONDTHANINTHEHEALTHYPONDTHESERESULTSSEEMTOINDICATETHATTH
28、EREARESOMERELATIONSWITHTHECOMMUNITYSTRUCTURE（SUCHASTHEVIBRIODIVERSITYANDTHEDOMINANTBACTERIA）ANDTHEDISEASE,BUTWECANNOTKNOWTHERELATIONWITHTHEVIBRIOQUANTITYANDTHEDISEASEFROMTHISSTUDYKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGWATERVIBRIOCOMMUNITYSTRUCTURE16SRDNASEQUENCE前言三疣梭子蟹是我国重要的海产经济蟹类，具有较高的经济价值。近年来，由于养殖规
29、模的不断扩大、养殖密度的不断提高、养殖环境的污染，导致三疣梭子蟹的抗病力下降，容易感染病原体，使得疾病频繁发生，例如近几年由弧菌引起的“乳化病”给三疣梭子蟹养殖业带来了重大经济损失1。国外早在20世纪初就有学者2对海水鱼类弧菌病进行研究，自20世纪60年代后相继对多种弧菌属的致病菌有较丰富的研究和报道36。在三疣梭子蟹大规模养殖的过程中，由弧菌引起的死亡时有报道78,是该行业发展的重要限制性因素。因此研究环境中弧菌群落结构及数目规律，对水产养殖、食品生产等与人类生活及健康密切相关的领域具有重要指导意义。弧菌属于弧菌科VIBRIONACEAE弧菌属，是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽胞的
30、短杆状细菌,其中有的弧菌有一定的弯曲,欠柔软,有的弯曲不明显。根据伯杰氏细菌鉴定手册第9版收录的弧菌属的细菌有37种以上。弧菌科细菌广泛分布于半咸水、河口、海洋的水体、沉积物中以及海洋生物的体表和肠道中。目前，有关弧菌相关疾病的病原鉴定、病理和组织生理变化的研究国内已有不少报道如刘淇9，王国良10，施慧11，许文军12，JANGSEUKI13等分别对上述弧菌相关方面进行了研究，但是目前由弧菌引发的疾病与水体中弧菌群落结构的关系研究较少，有报道（倪纯治等14）过弧菌数量与虾体弧菌相关疾病的关系，养殖水体的弧菌数量常常被看做疾病爆发的重要征兆之一。沿海浮游细菌的基因型容易变异，因此基因类型比较丰富
31、15，弧菌主要分布在沿海水域中，也有这个特点。弧菌种类繁多，致病性菌株只占一小部分（据相关报道，溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、哈维氏弧菌（VHARVEYI）等10多种弧菌可以引起海水养殖动物发病1617，特别是夏季，一些弧菌暴发性增长，使养殖对象出现皮肤溃烂，烂尾，出血等症状），大部分是非致病菌，这些非致病菌在水体净化中还起着非常重要的作用，因此，相较于弧菌数量，弧菌群落的结构组成可能与疾病爆发更为相关。随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR和测序技术的发展，使人们能够利用16SRDNA序列来鉴定环境中弧菌菌种，来研究环境中的弧菌群落结构。从环境中分离纯化弧菌，提取各弧菌菌株的DNA，
32、对细菌的16SRDNA区进行扩增测序，最后通过一些生物信息学的方法鉴定该弧菌的系统发育地位。我们选取两个代表性的三疣梭子蟹养殖塘，其中一个塘中梭子蟹发生类似“牛奶病”的疾病，梭子蟹连续不断死亡，称为病害塘；另一个塘，没有明显的梭子蟹死亡迹象，称为健康塘。我们基于细菌计数、菌落特征和16SRDNA基因序列比对对这两个三疣梭子蟹养殖塘的养殖水体中的弧菌群落组成进行了比较研究，以期进一步揭示弧菌群落结构变化与三疣梭子蟹疾病发生的关系。1材料与方法11样品采集2010年7月24日9301200，宁波鄞州区瞻岐镇三疣梭子蟹养殖场，阴雨，气温2531，水温28，我们按照海洋调查规范第6部分海洋生物调查（G
33、B/T1276362007）18的要求选取健康不发病的养殖塘和发病严重的养殖塘各两个，养殖塘面积为56亩，养殖密度为2000只/亩，于水深80CM左右处采取水样。采样前，开动水车30MIN，以使水体充分混匀。样品采集后均放在装有冰袋的密封泡沫箱中，并于6H内进行实验。12培养基TCBS琼脂的成分（G/L）19酵母浸出粉50G，蔗糖200G，蛋白胨200G，枸橼酸铁10G，枸橼酸钠100G，BTB004G，硫代硫酸钠100G，琼脂粉130G，牛胆粉80G。PH860413仪器设备本实验所用到的实验仪器有EPPENDORF离心机，BIORADPCR仪，变性凝胶电泳仪，琼脂糖凝胶电泳，RXZ智能型人
34、工气候箱，SPDJ系列水平净化工作台，20保存的冰箱，水浴锅，摇床。14弧菌的分离、纯化三疣梭子蟹养殖塘水体的弧菌计数、分离和纯化均采用TCBS培养基。采集的水样用无菌生理盐水稀释成3个梯度（101、102、103），每个稀释度设3个平行,取100L稀释液涂布TCBS培养基平板，30恒温培养箱内连续培养24D，记录各平板菌落数，并推算出原样品的弧菌浓度，随机挑取部分单菌落划线分离纯化3次，得到纯化菌株用于后续实验，记录其形态特征，如颜色、质地、表面形态等。15弧菌基因组DNA的提取及16SRDNA基因的PCR扩增参照张德民等的方法20提取弧菌基因组DNA，并加以改进菌株培养至对数生长后期离心收
35、集菌体，用TE洗涤细胞，重悬于TE中，加溶菌酶02MG/ML，37水浴处理530MIN，加SDS至终浓度为2，60水浴处理560MIN，酚/氯仿/异戊醇抽提，氯仿/异戊醇再抽提，乙醇沉淀，溶于去离子水中。采用细菌通用性引物对27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1541R（ACGGCTACCTTGTTACGACT）21扩增细菌16SRDNA约1400BP的片段，并用于测序。采用50LPCR反应体系，其组成为021G基因组DNA，4MOLL1引物，200MOLL1DNTPS，5L10BUFFER，1UDNA聚合酶，补双蒸水到50L。PCR扩增程序为94预变性5MIN；前10个循环为
36、941MIN，6560LMIN，7230S其中每个循环后复性温度下降05；后18个循环为941MIN，601MIN，7230S；最后72延伸5MIN。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，用细菌级琼脂糖粉和TAE按比例混合，加热溶解摇匀后加入少量EB，趁未凝固时倒入模具，插入齿梳，凝固后形成15W/V琼脂糖凝胶（含有05G/ML溴化乙锭）的胶版，将PCR产物和6XBUFFER各取3UL混合，点样，100V下电泳20MIN，在FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统下成像，观察PCR产物的条带，确定PCR是否成功。16弧菌16SRDNA序列的测定及系统发育学分析引物对27F1512RPCR扩增的1
37、6SRDNA产物用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒纯化，送上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将所得序列提交到GENBANK数据库中，登录号为GU132526，GU132530，GU132535等。用BLAST程序进行同源性比对，下载相关序列用MEGA40软件，再选择其他几株已知类别的代表弧菌，构建系统发育树。2结果21弧菌数量比较对三疣梭子蟹健康塘和病害塘养殖水体中的弧菌进行菌落计数（表1），计算出其弧菌浓度，从表中可知，健康塘水体弧菌数量为185235102CFU/ML，弧菌的平均数量为21102CFU/ML；病害塘水体弧菌数量为065190102CFU/ML，弧菌的平均数量为1
38、3102CFU/ML。从以上数据可以看出，病害塘养殖水体弧菌的样本1与健康塘在同一数量级上，比健康塘养殖水体的数量略少；病害塘养殖水体弧菌的样本2比健康塘少一个数量级，数量几乎少了一半；从平均数来看，病害塘养殖水体的弧菌平均数量13102CFU/ML与健康塘养殖水体的弧菌数量21102在同一数量级上，且病害塘的弧菌数量比健康塘的弧菌数量仅略少一些。表1三疣梭子蟹养殖水体的弧菌数量（CFU/ML）TAB1THENUMBEROFVIBRIOINTHEREARINGWATER（CFU/ML）样本SAMPLE健康塘HEATHYPOND病害塘DISEASEDPOND样本1SAMPLE1235102190
39、102样本2SAMPLE2185102650101平均值AVERAGE211021310222弧菌群落结构多样性221弧菌菌落类型多样性比较我们从三疣梭子蟹养殖健康塘和病害塘的养殖水体中共分离弧菌42株，其中健康塘水样与病害塘水样各21株，首先对其进行划线纯化，经35天培养后，记录其菌落形态并统计归类。根据弧菌菌落特征的差异（如表面形态、形态、质地、颜色等）将弧菌菌落初步划分为5个类型（C1C5）（见表2）。从整体上来看，其中C1类型为最优势类型，共有18株菌，占分离菌株总数的429，在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有6、12株菌；其次是C2类型，共有12株菌，占分离菌株总数的286，在
40、健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有7、5株菌；第三是C4类型，共10株，占分离菌株总数的238，在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有6、4株菌；另外，C2和C5类型的菌株较少，均只有1株菌，均占分离菌株总数的24，仅分布于健康塘养殖水体中。分别从健康塘和病害塘养殖塘水体的数据可以看出，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体均有21株弧菌，健康塘养殖水体的弧菌菌落分布在5个类型中，其中C2（凸起、奶油、圆、墨绿）有7株菌，为第一优势类型；其次，C1（凸起、奶油、圆、橙黄）和C4（平展、奶油、圆、橙黄）均有6株，为第二优势类型，且仅比第一优势类型相差一株；另外，C3（凸起、蜡状、圆、墨绿）和C5（
41、平展、蜡状、圆、橙黄）各一株。病害塘养殖水体的弧菌菌落类型仅分布在3个类型中，比健康塘少了两个，其中C1（凸起、奶油、圆、橙黄）有12株，为第一优势类型，且数量上占有绝对优势；其次，C2（凸起、奶油、圆、墨绿）有5株，为第二优势类型，与第一优势菌相差7株；另外，C4（平展、奶油、圆、橙黄）有4株。首先，从健康塘和病害塘的弧菌菌落类型多样性比较可知，健康塘水体的弧菌分布在5个类型中，较病害塘的弧菌分布要广，健康塘的弧菌主要集中分布在C1、C2和C4这3个类型，第一优势类型为C2，分布比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌分布在3个类型中，主要集中分布在C1类型，C1类型占了病害塘养殖水体分离菌的571，
42、占了病害塘弧菌的一半多，较另外两个弧菌菌种具有明显的优势，从这一点可知病害塘养殖水体的弧菌分布相对比较集中，与健康塘养殖水体不同。另外，两者也有共同之处，健康塘和病害塘养殖水体的共有类型有3个，分别为C1、C2和C4。从各群落类型的数量可以看出，健康塘养殖水体的这3个类型集中了905的弧菌数量，病害塘养殖水体则集中了全部的弧菌数量，从这一点来看具有相似性。表2三疣梭子蟹养殖水体的弧菌菌落类型分布TAB2THECOLONYCATEGORYOFTHEVIBRIOINTHEREARINGWATER菌落类型COLONYBASEDGROUPS表面形态SURFACESHAPE质地TEXTURE形态SHAP
43、E颜色CULOUR健康塘HEATHYPOND病害塘DISEASEDPOND总数TOTALC1凸起奶油圆橙黄61218C2凸起奶油圆墨绿7512C3凸起蜡状圆墨绿101C4平展奶油圆橙黄6410C5平展蜡状圆橙黄101总数TOTAL212142222弧菌种属分布多样性比较我们对分离的弧菌进行16SRDNA鉴定，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体共分离了42株弧菌，实验过程中死亡5株，DNA提取失败2株，未鉴定成功2株，实际鉴定33株，16SRDNA序列BLAST比对表明33株弧菌归属于6个种（98的序列相似性作为种的划分标准）（表3），取该6个种类的代表性菌株和其他6株非代表性菌株的序列构建系统发育
44、树（图1），比较弧菌种属在各养殖水体中的分布。从整体上看，在这6个种类中，VALGINOLYTICUS为最优势种，共有15株菌，占测序弧菌总数的445，将近一半，其中健康塘养殖水体和病害塘养殖水体分别有6、9株菌；第二优势种为VHARVEYI，共有7株菌，占测序弧菌总数的212，其中健康塘养殖水体和病害塘养殖水体分别为3、4株菌；第三优势种为VCAMPBELLII和VNATRIEGENS，均有4株菌，均占测序弧菌总数的121，其中VCAMPBELLII在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中分别有3、1株菌，VNATRIEGENS在健康塘养殖水体和病害塘养殖水体中则均为两株；其余两种菌VNEPTUN
45、IUS和VXUII的数量相对较少，仅分布在个别样品中，为12株。分别从健康塘和病害塘养殖水体的数据可以看出，健康塘养殖水体的弧菌共有16株，5个种，其中VALGINOLYTICUS有6株，为第一优势种，VHARVEYI有4株，为第二优势种，VCAMPBELLII有3株，为第三优势种，其余的两个种有12株菌，数量上分布比较均匀；病害塘养殖水体的弧菌共有17株，6个种，其中VALGINOLYTICUS有9株，为第一优势种，VHARVEYI有3株，为第二优势种，其余4种菌各有12株，数量分布上相对与健康塘来说比较集中，VALGINOLYTICUS的数量超过病害塘测序弧菌的一半，占有绝对优势。从健康塘
46、和病害塘养殖水体的弧菌种属多样性比较来看，健康塘养殖水体和病害塘养殖水体的差异不是很大，有5个种（VALGINOLYTICUS、VCAMPBELLII、VHARVEYI、VNATRIEGENS和VNEPTUNIUS）为两者所共有，其中VALGINOLYTICUS为健康塘养殖水体和病害塘养殖水体的共有优势种，分别有6、9株菌，占各自塘的测序弧菌总数的比例为375、529，第二优势菌都为VHARVEYI，其余3个种在两塘中的数量差异也很小。但是健康塘和病害塘养殖水体的弧菌种属分布也有不同之处，病害塘弧菌的分布中第一优势菌为占了一半多的菌种，其数量占有绝对优势，分布比较集中，而健康塘的弧菌分布相对比
47、较均匀，这一现象与菌落的类型分布特点相似。另外，有1株菌VXUII仅在病害塘养殖水体出现。表3三疣梭子蟹养殖水体弧菌种属分布TAB3THESPECIESDISTRIBUTIONOFTHEVIBRIOINTHEREARINGWATER相近种属名称SIMILARSPECIES代表菌株REPRESENTATIVESTRAINS相近种16SRDNA序列16SRDNASEQUENCESOFSIMILARSPECIES16SRDNA相似性16SRDNASIMILARITY健康塘HEATHYPOND病害塘DISEASEDPOND总数TOTALVALGINOLYTICUSZHS4X746909966915VC
48、AMPBELLIIZDS4X56575993314VHARVEYID1X7X74706998437VNATRIEGENSH2X7X74714100224VNEPTUNIUSZHS26AJ316171995112VXUIIXHS27AJ316181988011总数TOTAL161733图1三疣梭子蟹养殖水体代表菌株及部分其他非代表弧菌的系统发育学分析FIG1THEPHYLOGENETICANALYSISOFTHEVIBRIOINTHEREARINGWATERANDSOMEOTHERS注包含的菌株为本实验从养殖塘分离鉴定的弧菌各菌种的代表菌株，其余为部分其他非代表性弧菌菌株和标准菌株。3讨论弧菌是
49、海水环境中的常在菌群，广泛分布在自然海区，是一种条件致病菌，当养殖动物受伤、体弱、抗病力降低和环境条件恶化时，环境中的部分致病性弧菌就会乘虚而入，引起蟹、虾等各种水产动物的疾病，严重时甚至死亡。本文从弧菌的菌落计数出发，通过菌落特征的观察和弧菌种属多样性序比较，对三疣梭子蟹养殖健康塘和病害塘水体的弧菌群落结构进行了比较研究，意在通过两者的比较，找出养殖塘弧菌群落结构与发病的关系。31养殖水体弧菌群落结构与病害的关系研究证明，大部分病原体在致病前都是处在一种代谢繁殖不活跃或十分不活跃状态，疾病的爆发，是因为病原体数量激剧增加、病原体的致病力大大加强22，本文也证实了这一情况。VALGINOLYTICUS为致病性弧菌23，在三疣梭子蟹健康塘和病害塘的养殖水体中都存在，并且在病害塘中数量有较多的增加，成为绝对优势菌种，这可能是引发三疣梭子蟹疾病的原因之一，另外，菌落分布的结果也有类似现象，病害塘的弧菌种类减少，并且C1（凸起、奶油、圆、橙黄）数量较健康塘大大增加，成为了绝对优势类型。总而言之，就是说在正常情况下，养殖水体中弧菌的种类分布比较均匀，各致病性和非致病性弧菌之间可能存在某种平衡，当这个平衡被打破时，某种或某些致病性弧菌大量繁殖，这些致病性弧菌就比较容易侵入蟹体内，导致疾病的发生。弧菌可分为致病性弧菌和非致病
