1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆一、选题的背景与意义肉毒碱棕榈酰转移酶（CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASES,CPT,EC2312）是脂肪酸的氧化中主要的限制酶，丙二酸单酰辅酶A是其主要抑制剂。该酶系统由两种类型组成肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT）和肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT）。线粒体内细胞质一侧的脂酰COA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到COA上，重新形成脂酰COA,
2、成为氧化的底物。而鲈鱼LATEOLABRAXJAPOMCUS肉质坚实，洁白细嫩，肉味鲜美，营养特别丰富，是人类优质的蛋白质来源，也是我国水产从业人员捕捞、养殖的主要高档水产品种，经济价值很高,在我国渔业经济中占重要地位。目前大量的对肉毒碱棕榈酰转移酶的研究主要集中在哺乳动物如人、大鼠方面等上。国内黄其春等（2008）报道，猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶I基因片段克隆及序列分析。他们的研究旨在对肉毒碱棕榈酰转移酶转运机制和该酶对细胞代谢的影响及缺乏此酶对机体的影响等，但在鱼类方面研究较少，只是在鱼的肝脏和肌肉中测出有CPT的活性（FROYLAND1998等）。本研究通过对鲈鱼CPT基因的克隆来，来研
3、究CPT对鲈鱼鱼体的影响，主要是包括鱼体生长发育方面（水温适应），鱼肉口感方面及对人类身体的影响等做理论依据，为鲈鱼的最优养殖做指导二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究通过提取鲈鱼肝脏中总RNA，并逆转录成CDNA，将所得到CDNA的进行PCR克隆从而得到该基因的核心序列，最后通过RACE技术拉出全长，得出该基因全长序列。为以后CPTI基因分析、深入研究营养物质如甜菜碱等对鲈鱼肝脏、肌肉组织CPTIMRNA表达的影响及阐明其分解脂类物质的分子基础等做铺垫，从而进一步从分子水平研究肉毒碱棕榈酰转移酶在鱼体中的作用，为最后通过基因工程技术改变CPTI的活性，并将其应用于生产。拟解决问题有实验
4、前鲈鱼培养条件确定，PCR引物设计合理性，PCR克隆最优条件的确定及等。三、研究的方法与技术路线1RNA的提取及逆转录表达总RNA在鲈鱼的肝脏中是通过TRIZOL试剂盒说明书提取出来将鲈鱼肝剪碎后放入研钵中倒入液氮进行研磨，加入1MLTRIZOL试剂呈液态后转移到经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的EPPENDORF管中在1530室温中放置5MIN，加入200UL氯仿手摇匀5S并放置23MIN，在41200R/MIN离心5MIN，取上层水相转至新的EP管中，加入05ML异丙醇，室温放10MIN，在41200R/MIN离心10MIN，弃上清，沉淀用现配的75乙醇洗涤后室温干燥，干燥后用30UL的无
5、酶水溶解即得总RNA提取液。取两个干净的05MLEP管，依次加入RNA05UL，OLIGODT引物50UMOL/L1UL，5BUFFER5UL，DNTP10MMOL/L1UL，MMLV逆转录酶200U/UL1UL，加DEPC处理水至总体积为25UL以上均冰上操作，离心后，置于42水浴60MIN，65水浴10MIN。得到CDNA产物，置于20储存。2设计PCR引物在GENBANK中找出人（HUMAN），小鼠（MUSMUSCULUS），虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS，大西洋鲷SPARUSAURATA，牛（BOSTAURUS），鸡（GALLUSGALLUS），食蟹猴（MACACAFASCI
6、CULARIS），斑马鱼（DANIORERIO），绵羊（OVISARIES），野猪（SUSSCROFA）及大西洋鲑鱼（SALMOSALAR）肝中的CPT的CDNA序列，通过BIOEDIT软件进行同源性对比，找出同源性较好的片段，然后通过PRIMER5软件设计出CPT的上游引物和下游引物，然后将此引物在NCBI数据库中进行BLSAT下，选出最优的几对引物进行PCR实验。3PCR及其产物处理聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR反应包含变性，退火，延伸三步骤。将反应管在50UL体系（5ULBUFFER，1ULCDNA模版，1UL各DNTP,1UL上游引物,1UL下游引
7、物，05ULTAQDNA聚合酶，灭菌蒸馏水375UL）中进行PCR反应。此反应条件为94预变性5MIN；接着30个循环941MIN,5245（前8个循环降落）1MIN,722MIN；最后72延伸2MIN。然后将PCR产物混合在1浓度的琼脂糖凝胶电泳进行，加入适量溴乙啶（ETHIDIUMBROMIDE,EB）染料对PCR产物进行染色，将电泳标本放置在紫外线下观察，通过MARK比较来找出目标片段，通过切胶回收来获得PCR产物，最后进行测序，获得核心片段。4RACEPCRCCDNA末端快速扩增（5AND3RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RCAE）技术，目的是为了鲈鱼CPT基
8、因的3RACE扩增和5RACE扩增。RACE扩增RACE操作按照SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT说明书进行，设计克隆CPT基因的3RACE引物LYCPT3F3和5RACE引物LYCPT5R3，分别以3CPTCDNA和5CPTCDNA为模板，以试剂盒提供的通用引物UPM进行3RACE和5RACEPCR反应。PCR条件如下9430S，723MIN，5个循环9430S，7030S，723MIN，5个循环9430S，6830S，723MIN，25个循环最后72延伸8MIN以第1轮PCR产物稀释50倍作为模板，设计巢氏引物3RACE引物LYCPT3F4和5RACE引物LYC
9、PT5R4，和试剂盒提供的引物NESTUPM分别进行第2轮PCR扩增PCR反应条件如下预变性943MIN9430S，683S，723MIN，30个循环最后72延伸10MIN。将3RACE和5RACE产物纯化、克隆后送测序，并分析结果5结果通过将3RACE和5RACE产物用VECTORNTISUITE7软件进行连接得出基因的全长，为以后的进一步分析做基础。四、研究的总体安排与进度2010年12月实验前准备1查询中英文资料、文献2设计实验方案3准备实验中所需的仪器和材料2011年13月进行实验1RNA的提取及逆转录2PCR及PCR其产物处理3CPT1核心片段的鉴定4通过RACE拉出全长2011年4
10、月撰写论文1实验数据整理、分析2完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月准备答辩1完成论文正稿2准备毕业答辩五、主要参考文献1EATON,SCONTROLOFMITOCHONDRIALBOXIDATIONFLUXPROGLIPIDRESJ2002,41,1972392FRASER,F,CORSTORPHINE,CG,ZAMMIT,VA,TOPOLOGYOFCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIINTHEMITOCHONDRIALOUTERMEMBRANEBIOCHEMJ1997323,7117183BRITTON,CH,MACKEY,DW,ESSER,VETALFINE
11、CHROMOSOMEMAPPINGOFTHEGENESFORHUMANLIVERANDMUSCLECARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEICPT1AANDCPT1BJ1997GENOMICS40,2092114GUDERLEY,H,JOHNSTON,IAPLASTICITYOFFISHMUSCLEMITOCHONDRIAWITHTHERMALACCLIMATIONJ1996EXPBIOL199,131113175SMALL,GM,BURDETT,KANDCONNOCK,MJASENSITIVESPECTROPHOTOMETRICASSAYFORPEROXISOMALACYL
12、COAOXIDASE,BIOCHEMJ1985227,2052106PONSR,CARROZZOR,TEINI,ETALDEDCIENTMUSCLECARNITINETRANSPORTINPRIMARYCARNITINEDECIENCYJ1997PEDIATRRES425835877MOYES,CD,BUCK,LT,HOCHACHKA,PW,SUAREZ,RKOXIDATIVEPROPERTIESOFCARPREDANDWHITEMUSCLEJ1989EXPBIOL143,3213318EGGINTON,SEFFECTOFTEMPERATUREONTHEOPTIMALSUBSTRATEFORO
13、XIDATIONJ1996FISHBIOL49,7537589SARGENT,JR,BELL,MV,TOCHER,DRTHELIPIDSINHALVER,JED,FISHNUTRITIONACADEMICPRESSINC,PP198915321810HENDERSON,RJFATTYACIDMETABOLISMINFRESHWATERFISHWITHPARTICULARREFERENCETOPOLYUNSATURATEDFATTYACIDS,ARCHANIMJ1996NUTR49,52211MIYASAKI,T,SATO,M,YOSHINAKA,R,SAKAGUCHI,MEFFECTOFVIT
14、AMINCONLIPIDANDCARNITINEMETABOLISMINRAINBOWTROUTFISHJ1995SCI61,50150612HARPAZ,S,LCARNITINEANDITSATTRIBUTEDFUNCTIONSINFISHCULTUREANDNUTRITIONAREVIEWJAQUACULTURE249200532113黄其春,许梓荣,李卫芬等猪肝脏和肌肉肉碱脂酰转移酶I基因片段克隆及序列分析J龙岩学院学报,200826卷314GUTIERESA,S,DAMONB,M,PANSERATA,S,KAUSHIKA,S,MEDALEA,F,ETALCLONINGANDTISSUE
15、DISTRIBUTIONOFACARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIGENEINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTB,135200313915115FROYLAND,L,MADSEN,L,ECKHOFF,KM,LIE,O,BERGE,RKCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEI,CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEII,ANDACYLCOAOXIDASEACTIVITIESINATLANTICSALMONSALMOSALAR
16、J1998LIPIDS33,92393016CHOMCZINSKI,F,SACCHI,MSINGLESTEPMETHODOFRNAISOLATIONBYGUANIDIUMTHIOCYANATEPHENOLCHLOROFORMEXTRACTIONJANALBIOCHEM1987162,15615917HIGGINS,D,SHARP,PFASTANDSENSITIVEMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTSONAMICROCOMPUTER1989CABIOS5,15115318BARNES,WMPCRAMPLIFICATIONOFUPTO35KBDNAWITHHIGHFIDELITYA
17、NDHIGHYIELDFROMBACTERIOPHAGETEMPLATESJPROCNATLACADSCI1994USA912216222019BORSON,ND,SATO,WLREVERSETRANSCRIPTIONPCRCPTILIVERRACETECHNOLOGY目录前言11材料和方法211实验材料、试剂和仪器设备2111实验材料2112实验试剂212实验方法3121总RNA提取3122CDNA合成3123PCR及凝胶电泳4124PCR产物回收4125感受态细胞的制备5126目的片段与载体的连接，测序6127RACE扩增62实验结果及分析721总RNA提取结果722鲈鱼CPTI基因CDN
18、A的克隆83讨论12致谢14参考文献14附录16前言随着天然自然资源的日益枯竭，许多水产品都是通过养殖来获得的，我国的水产业发展非常迅速，连续多年位居世界水产品总产量第一、水产养殖产量世界第一的大国之位。而鱼类养殖占水产养殖很大的一部分比例。鲈鱼LATEOLABRAXJAPOMCUS肉质坚实，洁白细嫩，肉味鲜美，营养特别丰富，是人类优质的蛋白质来源，也是我国水产从业人员捕捞、养殖的主要高档水产品种，经济价值很高。不过在人们养殖技术还未完善，会出现很多效益上的问题。并且在通过养殖获得大量的蛋白质时也出现了很多的问题，养殖鲈鱼群体出现了经济性的衰退现象，如生长缓慢、性成熟提早、肉质变差等，尤其是鱼
19、体脂肪含量越来越高，这不仅影响鲈鱼的肉质和风味，而且大大降低了饲料转化率，严重影响到鲈鱼的产量、销售和商品价格，成为严重制约鲈鱼养殖业发展的因素。肉毒碱棕榈酰转移酶（CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASES,CPT,EC2312）是脂肪酸的氧化中主要的限制酶，丙二酸单酰辅酶A是其主要抑制剂。该酶系统由两种类型组成肉毒碱棕榈酰转移酶I（CPTI）和肉毒碱棕榈酰转移酶II（CPTII）1。线粒体内细胞质一侧的脂酰COA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶I催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转
20、移酶II的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到COA上，重新形成脂酰COA,成为氧化的底物。鱼体中的脂质组成是鱼体膳食脂肪沉积平衡的结果，即是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态的结果。脂肪分解产生的脂肪酸可转化成甘油三脂、膜磷脂或进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入线粒体内进行氧化2。在哺乳动物中，CPTI在肝（LA）和肌肉（MB）中至少被分为两个亚型3LCPTI或者CPTIA和MCPTI或者CPTIB，并且在肝和肌肉CPTI的基因表达首次被研究。在人体中，这两种形式都是由两个不同的基因编码。在肾，肺，脾，肠，卵巢和胰腺中
21、LCPTI作为主要（或者唯一的表达），而在睾丸中MCPTI则占主导地位4。这两个亚型有明显不同的动力学性质，特别是它们的KM值（在大鼠中MCPTI500MM,LCPTI30MM），还有对丙二酰辅酶A抑制敏感性也不同，麦加里等发现在肌肉中（IC50003UM）CPTI对丙二酰辅酶A抑制敏感性大约是肝中（IC5027UM）的100倍5。丙二酰辅酶A是CPTI可逆抑制剂，它是乙酰辅酶A合成脂肪酸的第一步，通过乙酰辅酶A羧化酶产生。因此它提供了一个相互控制的两个相反的路径脂肪酸合成和脂肪酸氧化的简单机制。丙二酰辅酶A对CPTI抑制作用在脂肪酸氧化生理调节起重要的作用6。到目前为止，可用的关于鱼体组织中
22、的CPTI活性的数据很少。STEPHANIEGUTIERES7发现在鳟鱼中CPTI活性的顺序是红肌肠肾肝白肌，在脂肪组织中未检测到活性，这个结果表明在这些有CPTI基因表达的组织中有严谨的组织转录控制系统。这结果与FROYLAND等人所得的相一致，他们测量了大西洋鲑鱼的肌肉和肝脏中的CPTI活性。CPTI活性的顺序是红肌肾肝肝白肌。他们还用丙二酰COA做对照，证明他们测量的CPTI活性分布是正确的。埃金顿也研究了虹鳟鱼和大西洋鲑鱼在不同基质中的CPT最大活性8。这个鳟鱼和鲑鱼的CPTI活性顺序与现在研究发现的是一致的。肪的沉积是能量贮存的主要方式，鱼体中的脂质组成是鱼体膳食脂肪沉积平衡的结果9
23、，即是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态的结果。脂肪分解产生的脂肪酸可转化成甘油三脂、膜磷脂或进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入线粒体内进行氧化10。而CPTI催化长链脂酰COA与肉碱合成脂酰肉碱，是脂肪酸氧化过程中的一种限速酶，因此抑制或者激活CPTI能控制脂肪酸氧化进行与否，最终导致鱼体中脂肪的积累情况11。可以说CPTI对鱼类多种代谢过程都有重要的调节作用，它不仅参与脂类代谢的某些酶的代谢，还会影响某些脂肪细胞
24、的生长、分化甚至凋谢。在鱼体中脂肪的含量和组成是影响鱼肉口味的主要因素12。一直以来，国内外学者主要是对哺乳动物的CPTI基因进行研究如黄其春13研究了猪的CPTI基因，而相对于鱼类中CPTI基因的研究则较少，已知的有STEPHANIEGUTIERES14克隆了虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）CPTI基因和LIVARFROYLAND15克隆出了大西洋鲑鱼（SALMOSALAR）CPTI基因,由于CPTI在鱼类脂肪代谢中发挥了重要作用，因而成为用来研究脂肪细胞分化和脂肪代谢调节的重要基因。而国内目前还没有鱼类CPTI基因克隆的相关报道。与哺乳动物不同的是，对低脊椎动物脂肪酸的运输系统
25、仍然不清楚。CPTI的活性在鱼中被检测只存在于肝脏和肌肉中16。本实验通过RTPCR获得鲈鱼肝CPTI基因核心片段，测序后，该片段大小1023KB，使用CDNA末端快速扩增（5AND3RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RCAE）技术克隆出鲈鱼CPTI3末端序列其大小为1292BP，但遗憾的是未成功克隆出鲈鱼CPTI5末端序列。本课题对今后深入研究脂肪代谢的相关因素，改善鱼类的肉质和口味都有重要的意义，也能为将来研究CPTI基因的功能打下了必不可少的基础，最终为鲈鱼的最优养殖做指导。1材料和方法11实验材料、试剂和引物111实验材料实验所用材料鲈鱼的肝脏组织。由宁波大学曹
26、光标科技楼303，钱云霞教授实验室提供。试验鲈鱼购自宁波水产大世界，体重约为500G。主要仪器设备DK8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）LX100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）T1THERMOCYCLERPCR自动系列化分析仪（德国BIOMETRA公司）GIS2008凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）WD9403D型紫外分析仪（北京六一仪器厂）5415D型台式高速离心机（EPPENDORF公司）BIOFUGESTRATAS大型冷冻离心机（HERAEUS公司）DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）112实验试剂1总RNA提取所用试剂TRIZOLREAGE
27、NTINVITROGEN公司、氯仿（常熟市杨园化工厂）、异丙醇（上海试剂四厂）、DEPC处理灭菌水1ML焦碳酸二乙酯（DEPC）（BIOBASICINC公司）加1000ML纯水配成01的水溶液，配制好后放置过夜，121高压灭菌25MIN，备用、75乙醇取75ML的无水乙醇（杭州长征化工厂）加以DEPC处理灭菌水定容到100ML，置4保存备用。2CDNA合成所用试剂DNTPMIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、MMLV逆转录酶（PROMEGA公司）、OLIGODT（上海生工生物工程技术服务有限公司）、二硫苏糖醇（DTT）（杭州昊天生物技术有限公司）。3PCR及P
28、CR产物回收所用试剂TAQDNA聚合酶（5U/L）、10BUFFER100MMOL/LTRISCL，PH83；200MMOL/LKCL、MG225MMOL/L（TAKARA公司）、DNTPMIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、引物由上海基康生物技术有限公司合成、琼脂糖（上海生工生物工程技术服务有限公司）、凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术研究所）。4感受态细胞的制备所用试剂01MOL/LCACL2称取分子量为147的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用、甘油（上海生工）、LB培养基950ML蒸
29、馏水中加入5G酵母提取物（OXOID公司），10G胰蛋白胨（OXOID公司），5GNACL。调整PH值至70定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入15G琼脂，高压灭菌后备用、氨苄青霉素（上海生工）。5RACE扩增所用试剂琼脂糖（上海生工生物工程技术服务有限公司）、TAQDNA聚合酶（5U/L）、10BUFFER100MMOL/LTRISCL，PH83；200MMOL/LKCL、MG225MMOL/L（TAKARA公司）、DNTPMIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、引物由上海基康生物技术有限公司合成、凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术
30、研究所）、SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKITCLONTECH公司。12实验方法121总RNA提取鲈鱼肝脏总RNA的提取方法参照TRIZOLREAGENT试剂说明书取液氮冻存鲈50100MG，放入液氮中陶瓷研钵研磨。加入TRIZOL1ML后转移到15MLDEPC水处（01DEPC水浸泡过夜后高压灭菌）的离心管中，室温放置5MIN。然后加入氯仿02ML，盖紧，手摇混匀15S，室温放置23MIN。接着4，12000G离心15MIN。取上清（约06ML），转移到15MLDEPC水处理的离心管中。加异丙醇05ML，混匀，室温下10MIN。接着4，10000G离心10MIN然后
31、弃上清，加1ML75乙醇洗涤。接着4，7500G离心5MIN。弃上清，室温干燥510MIN。最后用DEPC处理灭菌纯水2040L溶解，70OC保存。RNA提取成功的关键是尽量减少RNA酶的污染，因为RNA酶含有肽链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，而且变性后可迅速折叠，具有很高的稳定性。RNASE存在广泛，环境中灰尘，各种实验器皿和试剂，人体的汗液和及唾液中均存在RNA酶。目前，尚无令RNA酶失活的简易办法。所以要成功提取RNA在实验操作中应该注意1组织离体后迅速用液氮冷冻。2实验中所用金属器具，研钵等均要在200OC下干热灭菌4H以上。3实验中所用离心管，枪头皆为经DEPC水浸泡
32、处理并灭菌。4实验中所用溶液均要用经DEPC处理的灭菌水配制。5实验过程中要戴一次性手套、口罩，并注意更换。6提取环境要干净无菌，最好在专用的超净工作台上操作。122CDNA合成CDNA合成按照TAKARA1STSTRANDCDNASYTHENSISKIT进行16将上述总RNA样品在65OC变性5MIN，迅速置冰上备用。取15MLDEPC水处理的离心管中，并依次加入下列成分RNA样品2L，5BUFFER4L，DNTPMIXTURE各10MMOL/ML1L，OLIGODT50MOL/L1L，MMLV逆转录酶1L，DTT01MOL/L2L，加DEPC处理水至总体积为20L混匀。在室温放置10MIN
33、后，42OC水浴1小时，冰浴2MIN。所得产物即为CDNA，置于20OC保存。逆转录过程中的操作依然要十分小心，实验中所用离心管，枪头均要用01DEPC水处理，以防止RNA酶污染。在20L逆转录体系中模板总RNA的用量不要超过11G，过多则会影响逆转录的效率。123PCR从GENBANK中读取SPARUSAURATADQ866821，ONCORHYNCHUSMYKISSAJ6060761，BOSTAURUSNM_0010343492，GALLUSGALLUSNM_0010128981，MACACAFASCICULARIS（AB1687751），HUMAN（U668281），DANIORERIO
34、（NM_0010059401），OVISARIES（NM_0010092591），MUS（NM_0099482），SUSSCROFA（AY1810621），的CPTI基因CDNA序列通过BIOEDIT进行比对17，在PRIMER5辅助下进行引物设计，并在NCBI数据库中通过BLAST进行同源性比对。得出PCR扩增引物如（表1）所示，由INVITROGEN公司合成。表1鲈鱼CPTIPCR扩增核心片段的引物序列TAB1SEQUENCESOFPRIMERSUSEDINAMPLIFYINGCPTIPARTIALCDNASEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPOMCUS引物名称引物序列53（R
35、A/G，YC/T，HA/T/C，DG/A/T）CPTIFGGGCHACHAAYTAYGTGAGTGAYCPTIRTGAAGGCATCDGGRCTGGT聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION,PCR反应包含变性，退火，延伸三步骤18。PCR反应体系见表2表2PCR反应体系TAB2THECOMPONENTSOFPCRREACTION反应液成份体积50L10BUFFER100MMOL/LTRISCL,PH83；200MMOL/LKCL5L模板CDNA（012G）1LDNTPS各10MMOL/L4L正向引物CPTI1410F10MMOL/L1L反向引物CPTI1410R10MMO
36、L/L1LTAQDNA聚合酶5U/L05L灭菌双蒸水375LPCR反应条件94预变性5MIN；33个循环94变性1MIN；45退火1MIN；72延伸2MIN；72最后延伸10MIN；4保存产物以01琼脂糖凝胶电泳，因目的条带不够清晰，所以将1次PCR产物进行切胶纯化，以纯化产物为模板相同条件进行2次PCR。124PCR产物回收及凝胶电泳目的片段的回收使用碧云天生物技术研究所生产的DNA胶回收试剂盒琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后在紫外分析仪上用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入15ML离心管中，用1ML枪头捣碎。判定DNA片段的位置时使用长波长紫外光，紫外光
37、下照射的时间应尽可能短；每100L/100MG琼脂糖凝胶的比例加入EXTRACTIONBUFFER溶液，置于5060水浴中10MIN至胶全融，期间，需VORTEX或颠倒混匀34次，以加速溶解；将融化的胶溶液转移至DNA纯化柱中，室温放置1MIN。13000RPM离心1MIN，弃去接液管中废液；取下DNA纯化柱，加上700L溶液，室内放置1MIN；16000RMP离心1MIN，洗去杂质，倒弃收集管内的液体；向DNA纯化柱内加入500L溶液,于16000RPM离心1MIN，进一步去杂，并弃去接液管中废液；再16000RPM离心1MIN，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发；取下DNA纯化柱置于15M
38、L离心管上，加入30L溶液至管内柱面上放置1MIN；16000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于20备用；用1的琼脂糖凝胶电泳检测回收产物；125感受态细胞的制备目前常用的感受态细胞制备方法有CACL2和RBCLKCL法，RBCLKCL法制备的感受态细胞转化效率较高，但CACL2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于70保存半年，因此CACL2法为使用更广泛。DH5A感受态细胞的制备主要参照精编分子生物学实验指南过程如下取DH5A单菌落，接种于15MLLB培养液中，于37摇床培
39、养过夜（250R/MIN）；往一个250ML的烧瓶中加入100MLLB培养液，再加入4ML过夜培养液；37恒温振荡器250R/MIN培养至OD590为0375；这一步的目的是使细菌快速生长（对数早期或中期）；将培养液分装到2个50ML预冷无菌的离心管中，于冰上放置10MIN，然后于4，4000R/MIN离心10MIN。倒掉上清液，倒置吸水纸上1MIN左右，晾干；细胞沉淀用10ML预冷的01MOL/LCACL2溶液重悬，于4，4000R/MIN离心10MIN。倒掉上清液，倒置吸水纸上1MIN左右，晾干；重复步骤5一次；用2ML预冷的CACL2溶液重悬细胞，分装到加有甘油的15ML无菌离心管中，每
40、管加200L左右，立即冻存于70；实验中应该注意1细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。2试剂的质量所用的试剂，如CACL2等均需是最高纯度的GR或AR，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。3防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等要高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。126目的片段与载体的连接，测序PCR回
41、收产物与质粒连接的反应体系（10L）吸取PCR产物45L，加PMD18T载体05L，加LIGATIONSOLUTION混匀，4连接过夜；200L感受态细胞室温解冻后置于冰上；取50L感受态细胞，加入5L连接物，轻轻摇匀，冰上放置20MIN；42水浴90S（热激），冰上冷却23MIN；加入800LLB（AMP）培养基，（37预热先）；混匀，37振荡培养45MIN，（1H），（前25MIN转数150左右，后20MIN剧烈振荡200以上），然后离心145000RMP30S去上清；取200L上述培养物（摇匀后再取，涂到AMP的LB平板上）；将涂布好的平板置于37恒温振荡器中140R/MIN过夜培养（过
42、夜时间过长，也会产生卫星菌落）；挑选菌落于3MLLB培养基中（含AMP），68H；8000RMP5MIN离心或10000RMP2MIN收集菌体；小量培养后提取质粒DNA，进行酶切鉴定后送上海INVITROGEN公司进行双向重复测序。127RACE扩增RACEPCR扩增按照CLONTECH公司的SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT的说明书进行。取1G鲈鱼肝脏总RNA按说明书分别合成3READYCDNA和5READYCDNA，具体反应条件如下19A3READYCDNA经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。在DEPC水处理的离心管中配制5L下列混合液RNA1G3RACEP
43、RIMERA1LRNASEFREEDH2O补足到5L上述混合液置PCR仪上702MIN，将产物取出来后，冰上急冷2MIN。轻微离心，收集液体于离心管底部。在DEPC水处理的离心管中配制下列混合液上述经变性、退火的混合液5L5FIRSTSTRANDBUFFER2LDTT20MM05LDNTPMIX10MM1LMMLVREVERSETRANSCRIPTASE1L混匀，置PCR仪上4290MIN。向上述反应液加入200LTRICINEEDTABUFFER。混匀，置PCR仪上727MIN。B5READYCDNA经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。在DEPC水处理的离心管中配制5L下列混合液RNA1
44、G5RACEPRIMERA1LSMARTIIAOLIGO1LRNASEFREEDH2O补足到5L上述混合液置PCR仪上702MIN，冰上急冷2MIN。轻微离心，收集液体于离心管底部。在DEPC水处理的离心管中配制下列混合液上述经变性、退火的混合液5L5FIRSTSTRANDBUFFER2LDTT20MM05LDNTPMIX10MM1LMMLVREVERSETRANSCRIPTASE1L混匀，置PCR仪上4290MIN。向上述反应液加入200LTRICINEEDTABUFFER。混匀，置PCR仪上727MIN。分别得到鲈鱼肝脏3READYCDNA和5READYCDNA各200L，20保存。据获得
45、的核心片段序列，设计特异性引物LYCPT3F3和LYCPT5R3（表3），分别以3READYCDNA和5READYCDNA为模板，以及试剂盒提供的通用引物UPM进行3RACE和5RACEPCR反应。第2轮PCR的引物为LYCPT3F4和LYCPT5R4（表3），和试剂盒提供的引物NESTUPM分别进行PCR扩增，PCR扩增条件如下9430S，722MIN，5个循环；9430S，7030S，722MIN，5个循环9430S，6830S，722MIN，25个循环；最后72延伸6MIN。PCR产物的回收、克隆和测序方法同124和126。表3鲈鱼CPTIRACE的引物TAB3SEQUENCESOFPR
46、IMERSUSEDINCPTI3RACEAMPLIFYINGOFLATEOLABRAXJAPOMCUS引物名称引物序列53LYCPT3F3ACACTGGATGATGAGCCGCAGGGTTALYCPT3F4AGTGGCAGATTCCAAAGGAGTGTCAAGALYCPT5R3TTGAGTTCTCCTTGCTGGGGTTCTGALYCPT5R4CCATCTGAGTGGAACACATAGGAACGG2实验结果及分析21总RNA提取结果通过TRIZOL法提取了鲈鱼肝脏组织总RNA，经1琼脂糖凝胶电泳后结果见图1，图中5S、18S和28S三条条带清晰可见，说明RNA样品具有良好完整性。图1RNA琼脂
47、糖凝胶电泳图FIG1THEAGAROSEGELELECTROPHORESISRESULTOFRNA22鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆以鲈肝脏CDNA为模板，利用兼并引物CPTIF和CPTIR扩增得到目标片段，产物经1琼脂糖电泳显示特异的目的条带，大小在1016KB左右（见图2中的RTPCR，根据电泳检测图MARKER比较），与预期大小相符，PCR产物经切胶回收、连接转化、挑克隆检测，送上海INVITROGEN生物有限公司测序。测序结果如图3所示，后经BLAST同源性检索，得出此片段分别与金头鲷（SPARUSAURATA）的CPTI基因有89的同源性，与虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS
48、）有77的同源性，并且与哺乳动物如牛（BOSTAURUS）、鸡（GALLUSGALLUS）、食蟹猴（MACACAFASCICULARIS）、猿（HOMOSAPIENS）等有67的同源性，与其他动物如小鼠（MUS）及羊（OVISARIES）的CPTI基因有60以上的同源性，最终确认为鲈鱼CPTI的核心序列20。图2鲈鱼肝脏CPTI基因PCR扩增结果FIG2THEPCRRESULTOFCPTIGENEINLATEOLABRAXJAPOMCUSLIVER根据该核心序列，按照RACE试剂盒要求分别设计3、5RACE特异引物进行PCR反应扩增其末端序列，在实验之前我们预测1P产物片段3预计片段1078B
49、P以上，5预计片段1100BP以上；2P产物片度3预计片段780BP以上，5预计片段900BP以上。实际实验中我们成功获得了3末端序列，其大小约为1300BP（见图2中的RACE3，根据电泳检测图MARKER比较）。测序结果如图4所示，大小为1292BP。使用BIOEDIT软件通过与核心片段比对，我们发现核心具有153个碱基与3末端序列重叠，通过BLSAT同源性检索，说明此3RACE产物即是我们所需要的末端序列。我们将核心和3末端序列连接得出其序列长度为2162BP见图（5），将此序列进行BLAST同源性比对，结果如表4。通过跟同源性最好的金头鲷（SPARUSAURATA）氨基酸翻译比对表明，此序列
