1、本科毕业论文系列开题报告生物技术三疣梭子蟹蜕皮周期中甲基法尼酯浓度的变化一、选题的背景与意义三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。1987，LEROUX首次在甲壳动物中提出了大颚器MANDIBULARORGAN，M0这个概念，主要描述的是组织结构中类似于昆虫咽侧体的一个内分泌腺它主要的分泌产物是甲基法尼酯METHYLFARNESOATE，MF，可以调节甲壳动物中蜕皮、生长
2、发育等活动。而且大颚器也被证明是甲壳动物中唯一合成MF的内分泌器官。目前国内外都有人对甲壳动物中一些蟹类的超微结构做了研究。叶海辉等采用组织切片和电镜技术，对锯缘青蟹大颚器的形态结构进行了观察；赵维信等也对克氏原螯虾大颚器的超微结构进行了研究；赵维信等人同样对克氏原螯虾大颚器在卵巢发育周期中的组织结构变化做了研究；杜育哲等人用透射电镜对中华绒螯蟹大颚器的超微结构及眼柄切除后M0的变化进行了研究。对三疣梭子蟹大颚器的显微结构和超微结构的研究国内也有出现，秦昆、康现江对三疣梭子蟹大颚器显微及超微结构做了研究。作为一种经济类的蟹类，三疣梭子蟹同样会遇到目前蟹类中普遍存在的性早熟的问题，这就给很多养殖
3、户早成了重大的经济损失。所以研究清楚性早熟的机理然后解决这个问题刻不容缓。LAUFER很早以前就提出过大颚器的分泌物甲基法尼酯具有促性腺激素的作用，所以研究三疣梭子蟹中大颚器在蜕皮周期中的变化来确定其对性早熟有没有影响及影响的强弱。可以进一步的研究三疣梭子蟹性早熟的机制，以便尽早的解决该问题。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1三疣梭子蟹蜕皮周期中甲基法尼酯浓度的变化拟解决的问题2甲基法尼酯浓度的测定三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1、实验材料三疣梭子蟹在宁波宁海长街得水育苗场购得。2、三疣梭子蟹蜕皮周期中甲基法尼酯浓度的变化（1）大颚器的提取用解剖器材获取三疣梭子蟹中不
4、同蜕皮时期（蜕皮后期、蜕皮间期、蜕皮前期、蜕皮期四个大期）游泳足基部抽取血淋巴，加入含有1000L乙腈和1000L09NACL及10L内标（十二烷酸甲酯）的15ML的玻璃离心管内，超声波清洗5MIN,涡旋震荡2MIN，加入1ML正己烷，涡旋震荡2MIN，3000R/MIN离心10MIN，吸取上层正己烷（含有甲基法尼酯）于已作记号的4ML干净色谱瓶中，下层重复提一次，合并正己烷在冰箱下层20保存一周（2）一周内将正己烷旋转蒸发，蒸发后加100L色谱正己烷定容，进行气相色谱质谱分析（3）根据样品中甲基法尼酯特征离子响应强度与内标十二烷酸甲酯的特征离子响应强度比值，由标准曲线方程求得样品中甲基法尼酯
5、的含量。（4）根据统计学原理，绘制图表加入1ML正己烷，涡旋震荡2MIN15ML的玻璃离心管内，超声波清洗5MIN，涡旋震荡2MIN加100L色谱正己烷定容，进行气相色谱质谱分析计算获得甲基法尼酯的含量获取血淋巴1000L乙腈1000L09NACL10L内标3000R/MIN离心10MIN吸取上层正己烷，于已作记号的4ML干净色谱瓶中下层重复提一次，合并正己烷在冰箱下层20保存一周四、研究的总体安排与进度201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集201011201012完成任务书、开题报告、综述，进行开题答辩2011120112完成两篇外文文献的翻译20112201
6、14进行论文实验，然后再把实验的数据整理，完成毕业论文20115进行毕业答辩五、主要参考文献1LAUFERH,BORSTD,BAKERFC,ETA1IDENTIFICATIONOFAJUVENILEHORMONELIKECOMPOUNDINACRUSTACEANJSCIENCE,1987,23547852022052LAUFERH,SAGIA,AHLJBS,ETA1METHYLFARNESOATEAPPEARSTOBECRUSTACEANREPRODUCTIVEHORMONEJINVERTEBRAREPRODDEV,1992,2217203RIDDIFORDLMCELLULARANDMOLEC
7、ULARACTIONSOFJUVENILEHORMONEGENERALCONSIDERATIONANDPREMETRAMORPHICACTIONSJADVINSECTPHYSIOL,1994,242132734赵维信,陆剑锋中华绒螯蟹大颚器激素生物合成与性早熟的关系J水产学报,2003,2742892945杜育哲,顾景龄,吕宪禹,等中华绒螯蟹大颚器分泌物的HPLC分析J水产科学,2004,23610136袁春营,崔青曼,赵艳珍,等中华绒螯蟹大颚器对卵巢发育的影响J大连水产学院学报,2007,2221491527叶海辉,李少菁,黄辉洋,等锯缘青蟹大颚器的显微和超微结构J海洋学报,2005,271
8、1201248TOBESS,YOUNGDA,KHOOHWPRODUCTIONOFMETHYLFARNESOATEBYTHEMANDIBULARORGANSOFTHEMUDCRABSCYLLASERRATAVALIDATIONOFARADIOCHEMICALASSAYJGENCOMPENDOCRINO1,1989,733423539LEROUXADESCRIPTIONDORGANESMANDIBULAIRESMOMVENAUXCHEZLESCRUSTACESDECAPODESJCRHEBDACDSCISERDSCINAT,1968,2661414141710赵维信,李胜克氏原螯虾大颚器的超微结构
9、研究J水产学报,1998,22430330811上官步敏,刘正琮,李少菁锯缘青蟹卵巢发育的组织学观察J水产学报1991,152961012陆剑锋,万全,丁凤琴,等克氏原螯虾大颚器促性腺发育作用研究J安徽农业科学,2009,3731130113313赵维信,李胜克氏原螯虾大颚器的超微结构研究J水产学报，1998，22（4）30330814李胜,赵维信克氏原螯虾大颚器在卵巢发育周期中的组织结构变化J上海水产大学学报,1999,81121815赵维信,白桦克氏原螯虾大颚器合成甲基法尼酯的研究J水产学报,2001,25319319616张列士,徐琴英自然及养殖水体河蟹性成熟和性早熟的研究J水产科技情报
10、,2001,28310611117黄辉洋,叶海辉,李少菁,等锯缘青蟹大颚器对卵巢发育的调节作用J台湾海峡,2003,22329529818赵维信,陆剑峰早熟和正常中华绒螫蟹大颚器官发育及超微结构J上海水产大学学报,2004,1315819杜育哲,顾景龄,郭世宜,等中华绒螯蟹超微结构的研究J南开大学学报,2OO0,33210711020叶海辉,李少菁,王桂忠十足目甲壳动物促雄性腺研究概述J动物学杂志,2001,361434721陆剑锋,赵维信十足目甲壳动物生殖激素对卵巢的作用及其调控J上海水产大学学报,2001,10216617122赵维信,贾江,安苗外源激素和服柄提取物对梦氏沼虾卵母细胞的离体
11、诱导作用J上海水产大学学报,1996,5422122523罗永婷,袁维佳,马勇杰,等锯缘青蟹复眼的形态和超微结构J动物学研究,2003,24322022624陆剑锋,白桦孕酮对克氏原螯虾大颚器激素生物合成的体外调控J中国水产科学,2006,13347147425赵维信,白桦,陆剑锋克氏原螫虾大颚器生物合成甲基法尼酯的调控J水产学报,2002,26增1726蔡生力,赵维信,李德尚,等中国对虾肝胰腺、卵巢及血淋巴中的孕酮和雌二醇含量的生殖周期变化J水产学报,2001,25430431027黄辉洋,李少菁锯缘青蟹大颚器发育的组织学研究J研究报告,2003,272495228李胜，赵维信甲壳动物的大颚
12、器和甲基法尼酯J。上海水产大学学报，2000,9（3）233129陆剑锋，常国亮，吴旭干,等甲壳动物大颚器及其合成甲基法尼酯的放射化学测定法J。水产科学，2009,28（2）3243毕业论文文献综述生物技术甲壳动物蜕皮周期中大颚器及甲基法尼酯的研究现状摘要作为虾蟹类中一个重要的器官，大颚器MANDIBULARORGAN，MO在虾蟹的生长发育中起着不可忽视的作用，它的分泌产物甲基法尼酯METHYLFARNESOATE，MF可以调节甲壳动物中蜕皮、生长发育等活动。本文主要对中华绒螯蟹、锯缘青蟹以及克氏原鳌虾的大额器研究现状和最新进展做一个总结，以及探讨甲基法尼酯浓度的变化和蜕皮周期的关系。关键字大
13、颚器，中华绒螯蟹，锯缘青蟹，克氏原螯虾，甲基法尼酯1987，LEROUX1首次提出了甲壳动物中大颚器这个概念，主要描述的是甲壳动物组织结构中类似于昆虫咽侧体的一个内分泌腺同年，LAUFER实验室首次从血淋巴和大颚器培养液中分离纯化到了甲基法尼酯这种保幼激素（JH）的前体物质，并且证实了大额器是甲壳动物唯一合成和分泌甲基法尼酯的内分泌器官2。甲壳纲和昆虫纲是节肢动物门中最为重要的两个纲，两种节肢动物的近缘关系决定它们的生理生化特征和形态结构非常相似。近年来甲壳动物内分泌学的蓬勃发展，很大程度上得到了昆虫内分泌学所取得的成就的帮助。昆虫的咽侧体合成和分泌保幼激素来调控变态和生殖3。同时，保幼激素的
14、合成受一对生理作用相反的神经激素，促咽侧体激素和抑咽侧体激素的调控。从内分泌学的观点而言，甲壳动物的大颚器相当于昆虫的CA，MO合成和分泌甲基法尼酯，一种JH的前体物质，也具有相似的功能。1、中华绒螯蟹中大颚器的研究中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSISMILNEEDWARDS）是一种经济型蟹类，广泛分布于我国南北沿海各地湖泊中。但是中华绒螯蟹却有一个弱点制约着它的人工养殖，那就是性早熟和蜕皮过早导致蟹个体变小而影响经济效益。所以很多的科研工作者开始探索性早熟的机理，以便提高其经济效益。LAUFER很早以前就提出过甲基法尼酯具有促性腺激素的作用4，所以现在有很多的关注放在了大颚器上。赵
15、维信等人在此方面做了很多研究，发现大颚器的发育在早熟的中华绒螯蟹和正常蟹中有明显的差异5。他们分别观察了早熟和正常生长发育的中华绒螯蟹大颚器的超微结构，用来了解发育过程中大颚器的变化。结果发现早熟蟹的大颚器比正常发育蟹的发育要提早，不过探究早熟蟹发育不及正常蟹的原因，可能是早熟蟹中的卵黄发生过程比较缓慢，要比正常蟹滞后约一个月才能到达次级卵黄发生末期。当然，大颚器的变化最后是通过其分泌的激素来影响中华绒螯蟹的生长发育。赵维信等人通过放射性元素示踪法对中华绒螯蟹中的甲基法尼酯进行了研究，通过早熟蟹和正常蟹的对比发现，早熟蟹甲基法尼酯达到峰值要比正常蟹提前很多，不过正常蟹类的峰值要超过早熟蟹的峰值
16、，这种现象也是比较符合大颚器在蟹类发育过程中的变化的。我们也可以从中发现甲基法尼酯是刺激卵巢或精巢发育成熟是导致性早熟的内分泌因素5。袁春营等用埋植和注射这种方法研究中华绒螯蟹大颚器在卵巢发育中的作用，更进一步证明了大颚器在卵巢发育中起了极大的促进作用6。2、锯缘青蟹中大颚器的研究锯缘青蟹（SCYLLASERRATA）肉质鲜美，营养丰富，其雌蟹更是有有“海上人参”之称。盛产于温暖的浅海中，主要分布在中国广东、广西、福建和台湾的沿海等地，江浙一带特别多。在锯缘青蟹中，大颚器也能够分泌甲基法尼酯7。叶海辉等在锯缘青蟹大颚器这一方面做了大量的研究8。他们采用组织切片和电镜技术，对锯缘青蟹大颚器的形态
17、结构进行了观察，惊奇的发现在卵巢成熟时，各种细胞器变化变得很强烈，而且可以根据细胞器的强烈变化变化推断出青蟹大颚器的合成与分泌能力不断增强。锯缘青蟹大颚器腺细胞超微结构的变化为甲基法尼酯是否参与了卵巢发育提供了形态学证。很多文献和实验中已经证实，大颚器作为一种内分泌腺能够促进甲壳动物卵巢的发育，大颚器分泌的激素甲基法尼酯还具有启动和加速卵黄发生的功能。这个与昆虫的保幼激素的作用有一定的相似性，昆虫的保幼激素的功能是调控卵细胞表面对卵黄蛋白原的摄入，促进卵巢卵黄蛋白的合成，促进卵巢滤泡细胞和腹壁细胞释放蜕皮激素，而蜕皮激素能够促进脂肪体合成卵黄蛋白。1克氏原鳌虾大颚器合成甲基法尼酯的研究在克氏原
18、螯虾的卵巢发育周期中，MO的MF合成速率呈现周期性变化，随着卵巢的发育，MO合成的MF逐渐增多，赵维信和李胜发现卵黄发生期的克氏原螫虾MO提取物对卵母细胞直径增大和卵巢总RNA含量增多的作用最显著9。对罗氏沼虾卵黄发生前的卵巢离体培养，发现MF能促进卵巢总蛋白的合成；同时，也发现了MF还能促进卵巢总DNA和总RNA的合成。这些都说明MF的合成与分泌和雌性甲壳动物的卵巢发育有密切关系。离体培养时，次级卵黄发生期的MF合成速率在各个发育时期中最高；到成熟期时，MF的合成速率逐渐下降，这结果与LAUFER等对雌性尖头蟹MO离体分泌MF含量变化的研究结果相吻合，LAUFER等发现MO分泌的MF含量在卵
19、黄发生时最高，并在卵巢完全发育后逐渐降低。李胜和赵维信在对克氏原螫虾MO的研究中发现在卵巢发育周期中，MO的组织结构呈现周期性变化10，次级卵黄发生期的大颚器细胞直径最大，而成熟期的大颚器细胞直径减小。由此可知，克氏原螯虾的MO合成与分泌MF的活动与卵黄发生有一定的关系，与昆虫的保幼激素类似，甲壳动物通过MO台成和分泌MF对生殖进行调控11。4、甲基法尼酯的生理功能目前有很多关于甲基法尼酯的研究，也不断发现甲基法尼酯有着很多重要的生理功能。1甲基法尼酯调控蛋白质的代谢，实验过程中，摘除美洲龙鳌虾雌虾双侧大额器后，在一天左右的时间后，血淋巴中蛋白质的总含量降低。这个说明大额器对甲壳动物肝胰腺的蛋
20、白质的合成可能有促进作用。甲基法尼酯能够促进侧向地蟹皮肤组织内的蛋白质的合成。甲基法尼酯可能与DNA、RNA和蛋白质的很成有关12。2甲基法尼酯能够诱导变态，MF对甲壳动物的变态也有调控作用。对美洲龙螯虾浮游幼体进行试验，将其持续暴露在含MF的海水中，发现美洲龙鳌虾幼体的变态明显推迟13。在变态过程中，血淋巴中MF滴度明显升高。MF可能通过PKC信号传导系统来作用，从而诱导变态14。3甲基法尼酯促进部分甲壳动物的蜕皮，在甲壳动物的蜕皮周期中，Y器与蜕皮关系非常紧密。对离体培养的真蟹的Y器进行处理，将其与甲基法尼酯和大颚器共同培养发现Y器的蜕皮酮的分泌得到了促进。同时在观察罗氏沼虾的蜕皮周期，发
21、现血淋巴中的甲基法尼酯和蜕皮激素滴定呈现周期性变化，而且甲基法尼酯的高峰期出现的时间稍微早些，这意味着甲基法尼酯可能有调控蜕皮激素合成的作用，或者是Y器的大颚器激素的合成的调控是类似的154甲基法尼酯在一定程度上影响卵巢的发育，分别取卵巢处于卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期、成熟期、恢复期五个不同发育时期的雌性克氏原螯虾MO，测定了MF的合成速率，各个时期的MF合成速率的1617。可以得出，在卵巢发育周期中，MO台成速率呈周期性变化。卵巢发育各个时期中MF台成速率依次为次级卵黄发生期初级卵黄发生期成熟期卵黄发生前期恢复期，其中次级卵黄发生期的MF合成速率最高，恢复期的MF合成速率最
22、低。经方差分析，各个发育时期之间有显著性差异P初级卵黄发生期成熟期卵黄发生前期恢复期，其中次级卵黄发生期的甲基法尼酯的合成速率最高，恢复期的甲基法尼酯的合成速率最低。对结果进行方差分析，各个发育时期之间有显著性差异P005，并且次级卵黄发生期和初级卵黄发生期的甲基法尼酯合成速率与其他各时期之间的差异极显著P00114。13本文研究的意义和内容由于近些年人类对虾蟹的捕捞过度，三疣梭子蟹的自然资源也正日益减少，为满足市场需求和对环境资源的保护，沿海很多地方已开展了人工养殖。人工养殖的三疣梭子蟹与其它的甲壳类动物一样，普遍存在早熟，蜕皮过频，蜕皮未遂等问题，导致梭子蟹的产量大幅度下降。国内外研究者对
23、三疣梭子蟹内分泌系统研究已趋于热点，但是还不能有效的解决三疣梭子蟹养殖中普遍出现的难题。因此研究三疣梭子蟹蜕皮周期的机制以及影响蜕皮周期的因素就显得尤为重要。本次实验通过气相色谱质谱分析的方法，测定三疣梭子蟹蜕皮周期中的甲基法尼酯浓度的变化，以探究甲基法尼酯对三疣梭子蟹蜕皮周期是否有影响。2材料和方法21实验材料、仪器和试剂211材料三疣梭子蟹是从海中捕捞后暂养在宁波宁海长街得水育苗场的养殖池中的。样本选择体宽在911CM之间，体重在4565G之间，放养在相同条件下的育苗池中，海水盐度、水温以及水体溶解氧浓度、喂食量等保持相同，并保证池内的三疣梭子蟹都能够正常生长，从而减少因为不同环境条件而造
24、成的误差。本实验的实验用水为宁海县长街得水产苗种场蟹苗池海水，该海水取自自然海区，经过几天的沉淀池沉淀和两次砂滤池过滤。海水进入育苗池用增氧泵进行水体增氧，保证水体的溶解氧充足。实验样本均是未经过生殖蜕皮的生长状况良好的三疣梭子蟹。212仪器和设备ANKETGL16C离心机上海安亭科学仪器厂ALC2103电子天平ACCULAB有限公司3SB4200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司GSMS气相色谱质谱联用仪上海智岩科学仪器有限公司其他设备1ML注射器，试管，试管架，烧杯若干213实验试剂双蒸水，甲醇，NACL，乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），正己烷，色谱正己烷，内标（十二烷酸甲酯）
25、（图5）图5十二烷酸甲酯C15H30O222测定方法221三疣梭子蟹蜕皮周期的测定三疣梭子蟹蜕皮周期是根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距与旧表皮厚度的比值（R值）结合甲壳硬度、解剖后新壳的生长状况、蜕皮缝的开裂状况等形态学特征进行划分的，R趾节新旧表皮基线间距（D）/旧表皮厚度（C）（56）/（234）图1）。每个蜕皮阶段的R值都是在不同水平的，据此，蜕皮可以分为蜕壳前期（即D期，D0D4、蜕壳期（即E期、蜕皮后期（即A/B期、蜕皮间期15。图1蜕皮中游泳足趾节末端结构观察注1刚毛2旧壳上表皮3管状结构4旧壳外表皮5旧壳内表皮6新壳刚毛7新壳上表皮和外表皮8色素层222气相色谱质谱联用仪甲基法
26、尼酯在300C左右能汽化，考虑用GCMS进行分析，因为GCMS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。气相色谱的流动向为惰性气体，气相色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。图6气相色谱质谱联用仪组成框图23实验方法在对三疣梭子蟹的暂养阶段中，每天对样品进
27、行称重，观察，拍照并根据R值来判断蜕皮周期，从梭子蟹的游泳足基部抽取1000L血淋巴。实验需要很纯的血淋巴样品，所以选择从游泳足基部抽取，而且取材方便。加入含有1000L乙腈和1000L09NACL及10L内标（十二烷酸甲酯）于15ML的玻璃离心管内，涡旋震荡2MIN，让实验材料充分混合在乙腈中，再经过超声波清洗5MIN，清洗干净待测物表面的细微杂质。加入1ML正己烷，涡旋震荡2MIN，3000R/MIN离心10MIN，吸取上层正己烷（含有甲基法尼酯）放置于编号的4ML色谱瓶中，下层重复提取一次，混合正己烷20保存。将实验材料充分提取溶解在正己烷中，得到比较纯的甲基法尼酯。一周内将正己烷旋转蒸
28、发，蒸发后加100L正己烷定容，进行气相色谱质谱分析。根据样品中甲基法尼酯特征离子响应强度与内标十二烷酸甲酯的特征离子响应强度比值，由标准曲线方程求出样品中甲基法尼酯的含量。24数据处理采用SPSS130软件中的单因素ANOVA分析工具对实验数据进行方差分析及显著性差异分析。3结果和分析31蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯浓度变化由表1可知，在三疣梭子蟹蜕皮前期的血淋巴中甲基法尼酯的浓度很高，平均值从D0到D4时期分别处于13323NGML1、13375NGML1、12884NGML1、12500NGML1、17100NGML1的水平。在蜕皮后期浓度平均值只有1895NGML1，蜕皮间期的浓度平均
29、值也只有2341NGML1，这两个阶段的甲基法尼酯的浓度比蜕皮前期的浓度低了很多。根据以往的研究发现，对虾蟹做切除眼柄处理后，大颚器合成甲基法尼酯能力和血淋巴中甲基法尼酯滴度都显著提高16。相反，当给美洲龙螯虾注射眼柄X器窦腺提取物后，会发现大颚器合成甲基法尼酯的能力和血淋巴中甲基法尼酯的滴度都显著下降17。这两种实验确切的证实了大颚器抑制激素的存在。原因分析如下1三疣梭子蟹在蜕皮前期时处于一个新壳和旧壳的替换时期，身体很硬，含水量低，所以此阶段的甲基法尼酯的浓度特别高。而在蜕皮后期和前期，各个部位非常柔软，体内充满水，导致甲基法尼酯浓度很低。2在三疣梭子蟹的蜕皮后A/B期和蜕皮间期，可能存在
30、大颚器抑制激素分泌逐渐增加，导致了大颚器合成甲基法尼酯的能力下降18。表1蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯浓度（单位NG/ML）蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕皮D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期组1152218481332311473151771010116530组2305522481462914459135481492617720组3110829281201814194109261247217050均值189523411332313375132171250017100标准差102565461130551652821447241265966注组1、组2、组3为三组平行实验的结果。三疣梭子蟹在
31、被抽取血淋巴后无法再被利用，所以每个蜕皮阶段用于取材的三疣梭子蟹不是同一个。图7蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯的浓度图7中可以直观的看到，甲基法尼酯的浓度在三疣梭子蟹的整个蜕皮周期中呈现出有规律性的变化。蜕皮后A/B期和蜕皮间期甲基法尼酯含量很低，在蜕皮到蜕皮前D0D4期的时候的浓度突然升高很多，这和三疣梭子蟹蜕皮周期中身体由硬到软，不断吸水的生理变化是相符合的，但是只是单纯的因为物理变化，图中的甲基法尼酯的浓度不会变化如此剧烈，一定在生理方面也发生了变化，同样也说明了甲基法尼酯在三疣梭子蟹蜕皮周期中的调控作用。32采用SPSS对实验数据进行方差分析表2方差分析表离差平方和自由度均方F比显著组间
32、6302646061050441044389000组内331302214236644总数6633948220对实验数据进行方差分析，由表2可以明确的看出来，组间的差异性非常显著，随着三疣梭子蟹蜕皮期的进行，甲基法尼酯的浓度也随之发生了很大的变化。这也就意味着，甲基法尼酯在三疣梭子蟹中能起到影响三疣梭子蟹蜕皮周期，或者能够调控蜕皮激素合成分泌的作用。表3显著性差异比较表蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕前D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕前D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期注表示数据之间有显著差异（P005）表3是对每个蜕皮阶段甲基法尼酯的浓度的差异性做的比
33、较，由表可知，蜕皮后A/B期和蜕皮间期浓度的变化没有显著的差异，波动性差异不大，同样蜕皮前D0、D1、D2、D3的浓度变化也没有显著的差异，蜕皮后A/B期和蜕皮间期的浓度变化和蜕皮前期D0、D1、D2、D3浓度变化有显著差异，但是蜕皮前D4期是个特殊的时期，虽然每组数据都发生了变化，但是D4期的变化幅度大小和其他蜕皮时期都不一样，有显著差异。分析原因可能是1，每个作为样本的三疣梭子蟹，我们只是在某个蜕皮阶段抽取它的血淋巴，然后再解剖看一下新壳的生长状况，便不再利用此样本，所以每个蜕皮阶段提取的血淋巴和测出的甲基法尼酯的浓度并非来自同一个三疣梭子蟹，我们只能在取材和养殖时尽量做到条件相似，最大化
34、的减小误差。所以在获取三疣梭子蟹血淋巴时，样本在培养中由于自身或者其他原因发生变化，导致样本之间数据出现差异的情况，是我们无法避免的。2，三疣梭子蟹蜕皮前D4期，已经是蜕皮前期的最后一个阶段，此时的三疣梭子蟹头胸甲腹面和螯足长节背面蜕壳缝完全裂开，新壳柔软清晰可见，分泌完成，可完全脱离旧壳，开始吸水。整个蜕皮前D4阶段，三疣梭子蟹反应比较平稳，这也可能导致三组平行试验中D4时期的浓度变化差异不大。4讨论本次实验结果说明，甲基法尼酯的浓度随着三疣梭子蟹的蜕皮而不断变化，同样也证实了甲基法尼酯在三疣梭子蟹蜕皮周期中有调控作用。结论和目前对甲壳动物大颚器分泌的甲基法尼酯对蜕皮周期的影响的研究成果比较
35、接近。对龙鳌虾幼体进行处理，在其培养液中加入甲基法泥酯，用放射免疫法检测幼体蜕皮酮的变化，在培养后的48H，幼体的蜕皮酮含量相对没有加入甲基法尼酯的对照组有了明显的提高19。采用甲基法尼酯对蜘蛛蟹Y器进行离体培养，结果表明，与没有加入甲基法尼酯的对照组相比，实验组在处理后的24H后Y器分泌到培养基中的蜕皮酮明显增加，而且随MF的剂量和培养时间的增加而增加20。甲壳动物蜕皮周期除了甲基法尼酯的调控以外，也同样受到多种激素共同起作用。甲壳动物成体眼柄内的神经内分泌器官X器官XO窦腺SG复合体是甲壳动物神经内分泌的主要调控中心，其分泌物能抑制甲壳动物蜕皮，称为蜕皮抑制激素MIH；切除眼柄将使甲壳动物
36、缩短蜕皮周期，加快蜕皮。由于幼体蜕皮频繁和蜕皮周期短以小时或天计，人们认为XOSG复合体在幼体期不发挥作用，至少要到后期幼体蟹类的大眼幼体，虾类的仔虾才发挥作用，迄今还没有关于幼体XOSG复合体详细的组织学证据，也没有从幼体眼柄中直接分离纯化出MIH。但眼柄切除实验、注射SG提取物和免疫细胞化学的研究结果表明，幼体的蜕皮存在与成体蜕皮具有一样的激素调节机制2122。除了MIH外，能量对甲壳的发育起着十分重要的作用，还有很多影响因素。温度在甲壳动物的蜕皮周期中起着十分重要的作用，不仅仅对于蜕皮周期的长短以及蜕皮的启动有影响，甚至还有影响到幼体期的发育期数，当外界温度超过30时，长臂虾没有第四幼体
37、，也就是所说的后期幼体，而在低温1720时候，长臂虾幼体的发育被延长，这也是在暂养三疣梭子蟹时养殖池里面的水温要保持一致的原因，避免三疣梭子蟹蜕皮受到温度的影响。5结论本次实验中，在三疣梭子蟹蜕皮各阶段中，血淋巴中甲基法尼酯的浓度发生了很大的变化，在蜕皮前期甲基法尼酯的浓度含量很高，随着蜕皮周期的进行，在蜕皮后期和蜕皮间期，甲基法尼酯的浓度发生很大变化，远远低于蜕皮前期，平均值处于20NG/ML左右的水平。从方差分析的结果来看，蜕皮后期和蜕皮间期的变化并无差异，同样在蜕皮前期的几个阶段中，除了D4期有些不同，其他时期的变化也无差异。总体来看，甲基法尼酯浓度在三疣梭子蟹的蜕皮周期中不断发生变化，
38、二者相互关联着，也说明了甲基法尼酯在一定程度上影响着三疣梭子蟹的蜕皮周期。参考文献1迟大利,高焕,沈颂东三疣梭子蟹分子生物学研究进展J水产养殖,2008,433362LONGMUIRESETALDEVELOPMENT,MOULTSTAGINGANDECDYSISINTNEBANANAPRAWNPENAEUSMERGUIENSIJMARINEBIOLOGY,1983,771831903LAUFERH,BORSTD,BAKERFC,ETA1IDENTIFICATIONOFAJUVENILEHORMONELIKECOMPOUNDINACRUSTACEANJSCIENCE,1987,235478202
39、2054ANTONIOR,CHAVESEFFECTSOFSINUSGLANDEXTRACTONMANDIBULARORGANSIZEANDMETHYLFARNESOATESYNTHESISINTHECRAWFISHJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTA,2001,1283273335SHENGLI,JONA,KENNETHC,ETALMETHYLFARNESOATESYNTHESISINTHELOBSTERMANDIBULARORGANTHEROLESOFHMGCOAREDUCTASEANDFARNESOICACIDOMETHYLTRANSFER
40、ASEJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTA,2010,15549556陆剑锋,常国亮,吴旭干,等甲壳动物大颚器及其合成甲基法尼酯的放射化学测定法J水产科学,2009,28232437SOROKAY,MILNERY,LAUFERH,ETALAPROTEINSYNTHESISINTHEOVARYOFMACROBRACHIUMROSENBERGIIDURINGTHEREPRODUCTIVECYCLEEFFECTSOFMETHYLFARNESOATEMFJAMZOOL,1993,331231318BORSTDW,LAUFERH,LANDAUM,ETAL
41、METHYLFARNESOATEANDITSROLEINCRUSTACEANREPRODUCTIONANDDEVELOPMENTJINSECTBIOCHEM,1987,17112311279杜育哲,顾景龄,吕宪禹,等中华绒螯蟹大颚器分泌物的HPLC分析J水产科学,2004,236101310陆剑锋,万全,丁凤琴,等克氏原螯虾大颚器促性腺发育作用研究J安徽农业科学,2009,3731130113311赵维信,白桦克氏原螯虾大颚器合成甲基法尼酯的研究J水产学报,2001,25319319612黄辉洋,叶海辉,李少菁,等锯缘青蟹大颚器对卵巢发育的调节作用J台湾海峡,2003,22329529813袁
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43、ULATIONOFSECRETIONINAJUVENILECRUSTACEANJINSECTBIOCHEM,1987,171129113117TSUKIMURAB,BORSTDWREGULATIONOFMETHYLFARNESOATEINTHEHEMOLYMPHANDMANDIBULARORGANOFTHELOBSTER,HOMARUSAMERICANUSJJEXPZOOL,1992,26542743118亓一舟,朱冬发,杨济芬,等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志,2010,45216517019CHANGESPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHANGE
44、SDURINGTHEMOLTCYCLEINDECAPODCRUSTACEASANOVERVIEWJJEXPMARBIOLECOL,1995,19311420CHANGES,BRUCEMJREGULATIONOFCRUSTACEANMOLTINGAMULTIHORMONALSYSTEMJAMZOOL,1993,17181882621VANNOSTRANDWE,SCHMAIERAHEXPRESSIONPURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFTHEKUNITZTYPEPROTEINASEINHIBITORDOMAINOFTHEAMYLOIDBPROTEINPRECURSORLIKEPROTIEN2JBIOCHIMBIOPHYSACTA,120916517022朱小明,李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报,2001,2541119
