1、1本科毕业论文系列开题报告生物技术三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达一、选题的背景与意义三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），隶属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。由X器窦腺复合体合成和分泌的蜕皮抑制激素被认为是甲壳动物十足目中涉及蜕皮控制的激素。现在普遍接受的一个说法，蜕皮抑制激素抑制Y器中蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。近些年来，甲壳动物中有很多物种的MIH序列已经被测定凡纳对虾、刀额新对虾、日本对虾、黄道
2、蟹。对甲壳动物蜕皮周期中眼柄内编码的MIH进行NORTHEM印迹，发现MIH的MRNA水平在蜕皮前期逐渐降低，最低点出现在蜕皮晚前期，在蜕皮后水平突然升高，在蜕皮间期持续升高，从而说明了MIH的生理功能。当前，国内外都有对蟹类MIH基因研究的报道，LEE等已经在蟹类中将MIH基因克隆出来；王在照等采用RTPCR技术已经可以得到中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）MIH基因的CDNA片断；宋霞等运用RTPCR和3RACE技术克隆了中华绒螯蟹MIH基因的CDNA片断。朱冬发等对三疣梭子蟹三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析。不过很少看到关于MIH基因在组织中表达的文章。作为在
3、蟹类蜕皮中扮演重要角色的MIH，我们需要对其合成及作用机制有一个透彻的了解。三疣梭子蟹遇到的性早熟的问题会给很多养殖户早成了重大的经济损失。所以研究清楚性早熟的机理然后解决这个问题刻不容缓。虽然目前我们已经知道MIH是作用于Y器然后抑制蜕皮激素的分泌，但是并没有一个明确的对它的机制的了解。对三疣梭子蟹MIH基因的组织表达的研究，旨在为进一步阐明蟹类蜕皮机制、解决生产实践中遇到的性早熟和蜕皮未遂问题打下基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、对三疣梭子蟹以下器官中蜕皮抑制激素基因的表达进行研究X器窦腺复合体、胸2腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器2、对三疣梭子蟹上述器官蜕皮抑
4、制激素基因的表达量进行研究拟解决的问题三疣梭子蟹实验器官中蜕皮抑制激素基因定性、定量的表达情况三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1、实验材料在宁波宁海长街得水育苗场购得三疣梭子蟹。选取生长旺盛体重在4080G之间，头胸甲宽为812CM之间的三疣梭子蟹，然后取分别取出X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器，取出后迅速转移到液氮中保存。2、总RNA提取（1）超低温冷冻总RNA提取样品，称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，期间不断加入液氮直至研磨成粉状；（2）想研钵中加入适量总RNAREAGANT将粉末状的样品覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，要用研钵继续研磨至透明状；（3）将
5、匀浆液移至离心管中，室温静置50MIN；（4）在4，12000转的条件下离心5MIN；（5）小心吸取上清液，移入新离心管中；（6）将上述离心液加入200L氯仿，震荡，待充分乳化至乳白状，静置5MIN；（7）在4，12000转的条件下离心15MIN；（8）吸取上清液300L400L移至新的离心管中；（9）向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在1530静置10MIN；（10）在4，12000转的条件下离心10MIN；（11）弃上清液，缓慢沿管壁加入75乙醇1000L，轻轻上下颠倒洗涤，离心管壁，在4，12000转的条件下离心5MIN，后弃乙醇，干燥25MIN；（12）加入适量RNASE
6、FREEH2O（大约2050L）3、第一链CDNA合成每个MRNA样品取10G，5PRIMESCRIPTBUFFER2L，PRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI05L，OLIGO（DT）PRIMER（50MOL/L）05L，RANDOM6MERS（100MOL/L）05L，用RNASEFREEDH2O补足10L。具体操作参照PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书。4、荧光定量PCR荧光定量PCR在MASTERCYCLEREPREALPLEXREALTIMEPCREPPENDORF上完成，25LPCR的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQII2缓冲液125L，正向和反
7、向引物10MOL/L各05L3（参见表1），CDNA模板1L，DH2O105L。程序采用三步法为9530S1个循环，随后进行40个循环，每一循环包括，955S，5530S，6830S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9530S，55S，9515S1个循环从55上升到95的过程耗时20MIN。实验结果采用仪器自带程序读取。表1内参基因与目的基因的引物序列基因引物序列预期产物大小BP18SRRNA5TTGGTGGAGCGATTTGTCTGG35AGAAGAAGCTGCGAACTGGAC3350ACTIN5CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGAC
8、AGATTCCATACCC3350MIH5GACGCTTTTCAGATCCGGCC35GCCTGTGCCAGTCGTCAGAGG3110（二）技术路线四、研究的总体安排与进度201010毕业论文选题201010201011进行文献查阅和资料收集201011201012完成任务书、开题报告、综述，进行开题答辩提取需要实验的各个器官利用PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书合成CDNA。提取其中的MRNA荧光PCR检测部分组织蜕皮抑制激素基因的表达量设计引物42011120112完成两篇外文文献的翻译2011220114进行论文实验，然后再把实验的数据整理，完成毕业论文20115进行
9、毕业答辩五、主要参考文献1SIUMINGCHAN,XIAOGUANGCHEN,PEILIGUPCRCLONINGANDEXPRESSIONOFTHEMOLTINHIBITINGHORMONEGENEFORTHECRABJGENE,1998,22423332WEIQUNLU,GEOFFREYW,LISAAO,ETALCHARACTERIZATIONOFCDNAENCODINGMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHECRAB,CANCERPAGURUSEXPRESSIONOFMIHINNONXORGANTISSUESJGENE,2001,27814931593梅英综,刘长安,龚建平定量
10、PCR的研究进展J国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,25123274邱高峰,张爱萍,楼允东等锯缘青蟹蜕皮抑制激素CDNA的分子克隆及其表达分析J水产学报,2003,2732072125朱冬发,沈建明,杨济芬,等三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析J动物学报,2008,546111211186王在照,焦传珍,张晓军等中国对虾蜕皮抑制激素全长CDNA的克隆及序列分析J遗传学报,2003,3021281347宋霞,周开亚,马长艳中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1ERSMIH1基因组DNA的分子克隆和序列分析J动物学报,2004,50183908蔡刚,李闻捷,沈茜实时定量PCR应用中的问题及
11、优化方案XJ国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,246,3303329张蓓,沈立松审校实时荧光定量PCR的研究进展及其应用J国外医学临床生物化学与检验学分册,2003,24632732910欧阳松应,杨冬,欧阳红生等实时荧光定量PCR技术及其应用J生命的化学,2004,241747611应雪萍,杨万喜,许捷中华绒螯蟹不同生理阶段复肢的结构变化及粘液腺的发育特征J,2004,25325626212郭慧芝,付建平,昌鸣先等中华绒螯蟹铁蛋白基因的克隆及表达分析,水产学报,2010,3469059125毕业论文文献综述生物技术甲壳动物中X器窦腺复合体的研究进展摘要X器窦腺（XORGANSINU
12、SGLAND，XOSG）复合体是甲壳动物中一个重要的器官，结构和功能上类似脊椎动物的下丘脑神经垂体系统。它分泌的蜕皮抑制激素（MIH）和Y器分泌的蜕皮激素相互拮抗来调控甲壳动物的蜕皮，而且分泌的高糖激素（CHH）和性腺发育抑制激素（GIH）对代谢、色素反应、渗透压调等也有一定的调控作用。本文对甲壳动物中XOSG复合体及其分泌激素的研究作一个简单的总结。关键字X器窦腺复合体；蜕皮周期；中华绒螯蟹；锯缘青蟹；克氏原螯虾引言随着各种虾蟹类在市场上需求的扩大和人们对虾蟹的过度捕捞，现有的人工养殖也不能完全满足市场的需求。另一方面，人工养殖的甲壳类动物普遍存在性早熟的问题。所以如何提高一些虾蟹幼苗的产量
13、和防止性早熟问题是我们急需解决的问题。在甲壳动物中，因为实验仪器、技术的改进，对神经内分泌调控及其功能的研究越来越多，但是仍然不能有效的解决养殖中普遍存在的性早熟和蜕皮未遂等难题1。进一步的研究发现，这些问题可能与甲壳动物的蜕皮机制密切相关。2当然，作为甲壳动物神经分泌系统中的一员，XOSG复合体所起的作用不容忽视，所以对XOSG复合体的研究也越来越多。眼柄中XO神经分泌细胞轴突末端的突出部分即为XOSG复合体，它由X器官和窦腺两部分构成。1、甲壳动物XOSG复合体的简介HANSTRUM首次研究发现了XOSG复合体，这个内分泌器官主要是由X器和窦腺两部分组成，X器位置在视端髓的外侧，由成群的神
14、经分泌细胞的核周体聚集而成；窦腺位置在视内髓和视端髓交接处的背面，X器发出的轴突形成的产物。它由窦腺壁和中央血窦腔组成，其中窦腺壁由X器神经分泌细胞轴突的末梢及神经胶质细胞交织而成。26作为甲壳动物中重要的神经内分泌器官，XOSG复合体类似于哺乳动物下丘脑一垂体系统。它能够合成和分泌CHH、MIH、GIH等多种神经多肽激素，这些激素组成了一个新的多肽类家族，生成的激素调控甲壳动物一系列生理功能。这些激素由X器等生成，然后通过神经轴索进入到窦腺，接着在特定的条件下释放到血液中去。2、甲壳动物XOSG复合体分泌激素的简介ZELONY通过研究发现了眼柄在蟹的蜕皮周期中发生作用，它可以使蜕皮间期缩短从
15、而6促进蜕皮，然后他们推测眼柄中肯定存在一种蜕皮抑制因子。在眼柄切除后，不仅仅使蜕皮周期缩短，同样产生了一些其他的生理生化反应，比如对生长和性腺发育产生影响。56所以我们可以推测在蟹的眼柄中肯定存在多种激素来调节它的生理生化反应。虽然眼柄中的X器、Y器、大颚器都可以分泌一定的激素来影响蟹的生长发育，本文只对其中X器分泌的激素做一个介绍。作为窦腺中最丰富的激素，CHH在代谢过程特别是血糖调控中起着非常大的作用。目前对很多甲壳动物的CHH进行了氨基酸序列测定，包括普通滨蟹、克氏原螯虾、美洲龙虾、泥污鲸螯虾等。发现甲壳动物CHH的氨基酸序列有比较高的保守性，比较不同的CHH还可以发现它们氨基酸同源性
16、序列的比例均高于55，我们也可以发现CHH有以下的特征1氨基酸残基数目相同72或73；2CYS残基在肽链上的位置比较保守性；3肽链核心部位存在保守氨基酸序列。7不过研究还发现CHH有结构的多型性和功能的多样性。MIH被认为是甲壳动物十足目中涉及蜕皮控制的激素。现在普遍接受的一个说法，蜕皮抑制激素抑制Y器中蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。近些年来，甲壳动物中有很多物种的MIH序列已经被测定凡纳对虾、刀额新对虾、日本对虾、黄道蟹。对甲壳动物蜕皮周期中眼柄内编码的MIH进行NORTHEM印迹，发现MIH的MRNA水平在蜕皮前期逐渐降低，最低点出现在蜕皮晚前期，在蜕皮后水平突然升高，在蜕皮间期持续升高，从
17、而说明了MIH的生理功能。22另一方面，鉴于迄今对CHH和MIH不同功能的认知，CHH好像包括短期的调控和对不同环境刺激的频繁释放的反应，MIH分泌模式和应对相应刺激的分泌仍然不是很清楚。MIH被认为在长期调控过程中活跃，例如，在蜕皮周期的生长期。3、甲壳动物蜕皮周期的简介因为MIH等激素在甲壳动物的蜕皮周期中起反应，所以关于蜕皮周期也需要有一定的认知。在甲壳动物个体发育过程中，存在蜕去旧的外骨骼并长出新的外骨骼的过程，即为蜕皮。蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节。蜕皮周期可分为蜕皮、蜕皮后、蜕皮间期和蜕皮前期；对于甲壳动物,根据
18、DRACH和TCHERNIGOVTZEFF的标准可把蜕皮周期进一步划分为蜕壳前期D期，D0D4、蜕壳期MOLTSTAGE，即E期、软壳期A期、薄壳期B期、硬壳期C期，C1C45个时相。16影响蜕皮的因素不只是眼柄中各个器官分泌的激素。例如环境因子，温度、盐度、PH值、光照期、生存空间都可能是影响蜕皮的因素。食物的摄入自然也会影响到蜕皮，例如维7生素C影响甲壳类外壳的生成和硬化,原因可能是维生素C参与胶原蛋白的合成。4、X器官神经分泌细胞的细胞学研究神经内分泌活动是甲壳动物调节各种生理活动的重要方式之一13。在甲壳动物神经内分泌系统中，X器官窦腺复合体占有十分重要的地位，它所产生的激素对多种重要
19、的生理活动均有调控作用14。这一系统形态结构特征的研究是认识其活动规律的重要基础。锯缘青蟹眼柄X器官神经分泌细跑有2种类型，即B、C型；每种类型还可分为4亚型。各种类型的神经分泌细胞多集群的方式分布在视神经终髓基部一定的位置。超微结构的观察进一步表明2种类型细胞的特征有明显的差别。C型细胞具有十分发达的粗面内质网，内质网聚集成群，使胞质呈斑块状。B型细胞缺乏发达的内质。B细胞产生小的分泌颗粒，C型细胞可产生大型和中型分泌颗粒。在轴穿中，可以观察到5种类型的分泌颗粒15。4、展望对于甲壳动物XOSG复合体来讲，结构和一般功能的研究已经基本完成，目前需要研究的就是其分泌激素的调控机制以及一些激素、
20、器官在蜕皮等时候的动态变化。对于眼柄神经内分泌系统的研究，尤其是分泌细胞功能的研究也需要进一步深入进行，这将有助于对整个眼柄神经激素的形成、演变等问题有一个较为全面的认识。随着现代生物技术的不断发展，甲壳动物MIH的调控机制将会得到不断地验证与完善。针对甲壳动物更多的物种进行研究对于完善整个调控机制是至关重要的。近些年来，由于生物化学和分子生物学技术的成功应用，甲壳动物神经内分泌学的研究取得了很大进展。但目前其研究对象主要局限于几种模式动物，例如，普通滨蟹、美洲龙虾、泥污鲸螯虾和原螫虾等，而对其它动物研究较少。直到如今在生产上仍然采用传统的方法如切除眼柄、注射脊椎动物激素等调节一些经济种类的生
21、殖活动，所以我们应该扩大实验物种和实验方法。例如可以使用神经肽多克隆或单克隆抗体和分子生物学探针等。而且大多数激素在细胞内分子水平上的调控机制尚未完全清楚，如内分泌激素在细胞内的受体、与靶器官的作用模式、对靶器官合成通路上的酶的调控、在血淋巴中的半衰期、在不同的环境条件下及生活周期的不同阶段，释放激素的精确含量等。当然，对蟹类XOSG复合体及其分泌激素的研究的进展必然会给我们带来巨大的现实意义和经济价值。参考文献1刘昌杰,侯艳丽,王纬等虾池养殖三疣梭子蟹当年性早熟初报J齐鲁渔业,1996,16619202姚俊杰,赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究进展J水利渔业,2006,26681083刘学军,
22、刘志军虾蟹脱壳促长素的应用J河北保定地区水产研究所,1994,11894赵景霞,孙金生,张子怡中华绒螫蟹眼柄端髓X器官神经分泌细胞钙激活钾通道研究J水产学报,20077,3144174225赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用J广东饲料,2006,15132356殷海成眼柄切除对克氏原螯虾蜕皮、生长、性腺发育的影响J安徽农业科学,2007,3516481848197王在照,相建海甲壳动物CHH家族神经激素结构和功能研究进展J水产学报,2001,2521751808宋霞,周开亚甲壳类的眼柄神经激素J动物学杂志,2011,35439439赵维信,陆剑锋中华绒螯蟹大颚器激素生物合成与性早熟的关系
23、J水产学报,2003,27428929410杨济芬,朱冬发,沈建明等甲壳动物高血糖激素家族生理功能研究进展J动物学杂志,2009,44115115811元一舟,朱冬发,杨济芬等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志,2010,45216517012刘智俊,吴旭干,成永旭等三疣梭子蟹卵巢发育期间Y器官组织学变化J上海海洋大学学报,2010,331432013黄辉洋,李少菁,叶海辉等锯缘青蟹视神经节免疫细胞化学研究J海洋学报,2005,27112512914特纳CD,JT贝格纳尔普通内分泌学M,北京科学版社,197615上官步敏,李少菁锯缘青蟹X器官神经分细胞的细胞学研究J海洋学报,1
24、994LL,16611612116朱小明,李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报,2001,25437938417赵维信,陆剑峰中华绒螯蟹Y器官在蜕皮周期中的超微结构J中国水产科学,2004,111747118殷海成,张训蒲,龚世园克氏原螯虾X器官一窦腺复合体的组织学观察J安徽农业科学,2OO7,35133931393219上官步敏,李少蔷锯缘青蟹窦腺显微和超微结构研究J动物学报,199512,41434134620叶海辉,李少菁,黄辉洋等锯缘青蟹大颚器的显微和超微结构J海洋学报,2005,271120124921黄辉洋,李少菁,叶海辉等锯缘青蟹前脑神经分泌细胞的超微结构J2003,11719
25、22褚衍亮,姜乃澄,王玥甲壳动物神经肽的结构和功能J东海海洋,2002,1424823宋霞,周开亚,马长艳中华绒熬蟹蜕皮抑制激素1ERSM1H1GST融合白在大肠杆菌中的表达J中国水产科学2004,1838924DRACHP,CTCHERNIGOVTZEFFSURLAMTHODEDEDETERMINATIONDESSTADESDINTERMUEETSONAPPLICATIONGNRALEAUXCRUSTACSVIEMILIEU,1967,1859561025ZBYANG,YLZHAO,NLIETALEFFECTOFWATERBORNECOPPERONTHEMICROSTRUCTURESANDU
26、LTRASTRUCTUREOFTHEXORGANSINUSGLANDCOMPLEXINERIOCHEIRSINENSISJBULLENVIRONCONTAMTOXICOL,2008,80687326HANSTRUMBNEUOUNTERSUCHUNGENUBERSINNESORGANEUNDNERVENSYSTEMDERCRUSTACEANIZEITSCHRIFTTURMORPHOTOGIEUNDDERTIEREOEKOLOGIE,1931,238023610本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮抑制激素基因的组织表达11目录1引言132材料与方法1421实验材料1422实验试剂和引物1423主
27、要仪器1424总RNA的提取1425第一链CDNA合成1526荧光定量PCR1627相对定量处理163结果与分析1631实验结果16311获得总RNA结果16312荧光定量PCR处理结果17313相对定量法处理结果1932讨论214展望23致谢错误未定义书签。参考文献2312摘要甲壳动物的蜕皮过程主要是由两种激素相互拮抗而进行调控的，分别是由Y器分泌的蜕皮类固醇激素和由X器窦腺复合体分泌的蜕皮抑制激素（MIH），其中MIH抑制Y器中蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。MIH是其中一个重要激素，和血糖过多激素（CHH）、性腺抑制激素（GIH）组成了一个新的甲壳动物的神经肽家族，本文通过荧光定量PCR对三
28、疣梭子蟹MIH基因的组织表达进行研究，然后用相对定量法进行分析，结果发现MIH在X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器中都能表达，但是和X器窦腺复合体相比，其他组织MIH的表达量极低。关键词三疣梭子蟹；蜕皮抑制激素；甲壳动物；X器窦腺复合体。ABSTRACTTHEPROCESSOFECDYSISOFCRUSTACEANSISANANTAGONISTICINTERACTIONBYTWOHORMONETHEYWEREECDYSONEORIGINATESFROMTHEYORGANANDTHEMOLTINGINHIBITIONHORMONEMIHORIGINATESFROMXORGAN/
29、SINUSGLANDXO/SGCOMPLEX,RESPECTIVELYAMONGTHEMMIHINHIBITSTHESYNTHESISOFECDYSTEROIDSBYYORGANSMIHISANIMPORTANTHORMONE,TOGETHERWITHCRUSTACEANHYPERGLYCEMICHORMONECHHANDGONADINHIBITINGHORMONEGIH,THEYCONSTITUTEANOVELFAMILYOFRELATEDPEPTIDESTHISARTICLEISTOSTUDYTHETISSUEEXPRESSIONOFMOLTINHIBITINGHORMONEGENEFRO
30、MPORTUNUSTRITUBERCULATUSTHROUGHFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR,USINGTHECOMPARATIVEDELTADELTACTTOANALYSISITASARESULT,ITFOUNDTHATMIHCANEXPRESSINALLORGANS,LIKEXORGAN/SINUSGLAND,THORACICGANGLIA,OVARY,TESTIS,GUT,BRAIN,YORGANHOWEVER,COMPARINGTOXORGAN/SINUSGLAND,THEEXPRESSIONLEVELINOTHERORGANSISEXTREMELYLOWKEY
31、WORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUS；MOLTINHIBITINGHORMONE；CRUSTACEAN；XORGANSINUSGLANDCOMPLEX。131引言三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），属于甲壳纲梭子蟹科，是我国沿海地区的一种重要经济蟹类。因为它的生长迅速，再加上养殖利润丰厚，它已经渐渐成为中国沿海地区一种重要的养殖品种。三疣梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天它会移居到1030米的深海中，它喜欢穴居在泥沙底部。近年来，随着各种虾蟹类在市场上需求的扩大和人们对虾蟹的过度捕捞，现有三疣梭子蟹的人工养殖也不能完全满足市场的需求。另一方面
32、，人工养殖的三疣梭子蟹会出现抱卵过早1、蜕皮未遂2等问题。这些问题增加了三疣梭子蟹的养殖风险，制约了三疣梭子蟹市场的扩大。在甲壳动物中，因为实验仪器、技术的改进，对神经内分泌调控及其功能的研究越来越多，但是仍然不能有效的解决养殖中普遍存在的性早熟和蜕皮未遂等难题。进一步的研究发现，这些问题可能与甲壳动物的蜕皮机制密切相关。2所以研究清楚蜕皮机制对解决三疣梭子蟹存在的问题具有很重要的意义。ZELONY通过研究发现了眼柄在蟹的蜕皮周期中发生作用，它可以使蜕皮间期缩短从而促进蜕皮，然后他们推测眼柄中肯定存在一种蜕皮抑制因子。在眼柄切除后，不仅仅使蜕皮周期缩短，同样产生了一些其他的生理生化反应，比如对
33、生长和性腺发育产生影响。17,18所以我们可以推测在蟹的眼柄中肯定存在多种激素来调节它的生理生化反应。眼柄中的X器、Y器、大颚器都可以分泌一定的激素来影响蟹的生长发育。由X器窦腺复合体合成和分泌的MIH蜕皮抑制激素被认为是甲壳动物中涉及蜕皮控制的一个重要激素。现在的一个普遍接受的看法是甲壳动物的蜕皮过程主要是由两种激素相互拮抗而进行调控的，分别是由Y器分泌的蜕皮类固醇激素和由X器窦腺复合体分泌的MIH，而且MIH抑制Y器中蜕皮激素的合成从而抑制蜕皮。WATSON在2001年通过研究证明了这个观点。所以MIH在甲壳动物的蜕皮中起着非常重要的作用。MIH的合成部位是甲壳动物的眼柄中的X器官，然后运
34、送到窦腺中贮存并且由窦腺释放。近年来，通过从对MIH的研究可以发现，切除甲壳类动物眼柄就能有效的促进蜕壳和性腺的早期发育，而对上述手术后的动物重新注入眼柄分泌物或者MIH后，会使蜕皮激素浓度降低，同时推迟蜕皮。19近些年来，甲壳动物十足目中有很多物种的MIH序列已经被测定，例如凡纳对虾、刀额新对虾、日本对虾、黄道蟹等。对甲壳动物在蜕皮周期时在眼柄内编码产生的MIH进行NORTHEM印迹，我们可以发现编码MIH的MRNA水平在蜕皮前期逐渐降低，最低点出现在蜕皮晚前期，在蜕皮后水平突然升高，在蜕皮间期持续升高，从而说明了MIH的生理功能。12现在甲壳类动物蜕皮的发生与MIH之间的关系还没有取得共识
35、，MIH基因表达调控机理还没有得到阐明。所以研究更多的甲壳动物MIH是非常必要的。当前，国内外都有对蟹类MIH基因研究的报道，王在照等利用RTPCR得到鹰爪虾（TRACHYPENAEUSCURVIROSTRIS）MIH片段4，并对中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）蜕皮抑制激素基因的CDNA片段进行克隆和序列分析10；他们运用还采用CDNA末端快速扩增RACE方法，首次得到中国对虾蜕皮抑制激素的全长CDNA；宋霞等运用反向PCR技术得到了中华绒螯蟹的蜕皮抑制激素1基因组DNA序列5；邱高峰等用RTPCR技术首次扩增获得锯缘青蟹SCYLLASERRATA编码MIH成熟肽的全长CDNA
36、序列及部分信号肽序列6；朱冬发等对三疣梭子蟹蜕皮抑制激素的CDNA进行克隆与序列分析7；LEE等人对可口美青蟹蜕皮周期中MIH的MRNA水平和蜕皮激素浓度的变化进行观察和分析11。虽然有对三疣梭子蟹MIH有一定的报道，但是相关的研究还是很少的。本研究通过对三疣梭子蟹MIH基因在不同组织中表达的分析，为今后更深入地研究MIH的功能奠定基础。在对MIH基因在不同物种的不同组织中的表达研究发现，在眼柄中MIH基因的表达量14较高，而且在一些甲壳动物的脑中也可以发现MIH基因少量表达13，然后在精巢、卵巢、肝胰腺和肌肉等组织中发现没有表达14、15。除了这些器官的研究，LU等用巢式PCR对食用黄道蟹（
37、CANCERPAGURUS）中其他器官的MIH基因的组织表达进行研究，发现在视神经、腹神经索和胸部或腹部的神经节都有MIH基因的表达16。本实验通过PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书上的方法获得X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器中MIH基因的CDNA的一条链，然后用荧光定量PCR法测定窦各个实验器官中的RNA含量，即MIH基因的表达量。以X器窦腺复合体的数据作为对照组，然后用2CT方法进行相对定量。最后用图表定量的说明各个器官中MIH基因的表达情况。2材料与方法21实验材料在宁波宁海长街得水育苗场购得三疣梭子蟹。选取生长旺盛体重在4080G之间，头胸甲宽为8
38、12CM之间的三疣梭子蟹，然后取分别取出X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢、肠、脑、Y器组织，取出后迅速转移到液氮中保存。22实验试剂和引物DEPC（RNASEFREE），TRIZOL，购自SANGON公司加拿大；SYBRPREMIXEXTAQII，PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT，DNASEI（RNASEFREE），引物合成是由上海英骏生物技术有限公司INVITROGEN完成；从TAKARA公司日本购得试剂盒。23主要仪器（1）T1THERMOCYCLERPCR自动系列化分析仪德国BIOMETRA公司；（2）MICROMAX常温离心机；美国THERMO公司；（3）REVCD
39、13863V型超低温冰箱美国REVCD公司；（4）HZ9211K恒温振荡器太仓市科教器材厂；（5）DYY8B型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；（6）BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机美国SORVALL公司；（7）吉尔森可调精密移液器PEPETMAN法国GILSON公司；（8）TL988型实时荧光定量PCR仪；24总RNA的提取（1）超低温冷冻总RNA提取样品，称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，期间不断加入液氮直至研磨成粉状；（2）向研钵中加入适量MRNAREAGANT将粉末状的样品覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，要用研钵继续研磨至透明状；（3）将匀浆液移至离心管中，室温静置50
40、MIN；（4）在4，12000转的条件下离心5MIN；（5）小心吸取上清液，移入新离心管中；（6）将上述离心液加入200L氯仿，震荡，待充分乳化至乳白状，静置5MIN；（7）在4，12000转的条件下离心15MIN；（8）吸取上清液300L400L移至新的离心管中；（9）向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在1530静置10MIN；（10）在4，12000转的条件下离心10MIN；15（11）弃上清液，缓慢沿管壁加入75乙醇1000L，轻轻上下颠倒洗涤，离心管壁，在4，12000转的条件下离心5MIN，后弃乙醇，干燥25MIN；（12）加入适量RNASEFREEH2O（大约2050
41、L）25第一链CDNA合成（1）基因组DNA的除去反应试剂使用量5GDNAERASERBUFFER20LGDNAERASER10LTOTALRNA1RNASEFREEDH2OUPTO10L42下2MIN（或者室温5MIN2）4保存（2）反转录反应在冰上进行反应物的配置。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数1的量配制MASTERMIX，然后再分装到每个反应管中3。试剂使用量5PRIMESCRIPTBUFFER2（FORREALTIME）40LPRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI10LRTPRIMERMIX410L251的反应液100LRNASEFREEDH2OUPT
42、O20L537下15MIN685下5SEC47下保存1在20L的反应体系中可以使用的最大TOTALRNA是1G。2如果反应在室温下进行时时，可以将时间延长至30分钟。3不配制MASTERMIX，把添加剂加入的反应液中时，要先加入RNASEFREEDH2O和5PRIMESCRIPTBUFFER2FORREALTIME，将它们混合后再加入RTPRIMERMIX、PRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI，然后轻轻混匀混合液进行反转录反应。4使用RTPRIMERMIX可以高效合成CDNA。可以根据不同的实验目的，选择性的使用RTPRIMERMIX，也可以选择OLIGODTPRIMER或GENES
43、PECIFICPRIMER进行反转录反应，引物使用量如下OLIGODTPRIMER5016PMOL20L反应体系；GENESPECIFICPRIMER5PMOL20L反应体系。5根据不同的需求相应的扩大反应体系。6在使用GENESPECIFICPRIMER时，建议将反转录反应条件设置为42下转录15MIN。如果在PCR反应中有非特异性片段扩增时，可以将温度升到50，这样会对反转录有一定的改善。7合成的CDNA需要长时间保存时，请于20保存。26荧光定量PCR在MASTERCYCLEREPREALPLEXREALTIMEPCREPPENDORF上完成荧光定量PCR，总共25LPCR的反应体系，里
44、面包含SYBRPREMIXEXTAQII2缓冲液125L，正向和反向引物10MOL/L各05L（参见表1），DH2O105L，CDNA模板1L。步骤是现在为95保持30S，进行一个循环，随后进行40个循环，每一循环包括955S，5530S，6830S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9530S，55S，9515S1个循环，从55上升到95的过程耗时20MIN。实验结果采用仪器自带程序读取。表1内参基因与目的基因的引物序列TABLE1PRIMERSEQUENCESFORINTERNALCONTROLGENESANDTARGETEDGENES基因引物序列预期产物大小
45、BP18SRRNA5TTGGTGGAGCGATTTGTCTGG35AGAAGAAGCTGCGAACTGGAC3350ACTIN5CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGACAGATTCCATACCC3350MIH5GACGCTTTTCAGATCCGGCC35GCCTGTGCCAGTCGTCAGAGG311027相对定量处理我们采用2CT方法做相对定量，CTCT目的基因CT管家基因实验组CT目的基因CT管家基因对照组，计算实验组目的基因的相对表达量。把18SRRNA作为内参基因。每个样品平均分析两次取平均值。把X器窦腺复合体的实验数据作为对照组的实验数据。然后根据数据作柱状分析
46、图。3结果与分析31实验结果311获得总RNA结果在本次实验中我们进行GENOMICDNA污染的去除，因为此方法可以有效的获得MIH总RNA，（见图1）,总RNA浓度为7681158NG/L,OD260/280值为180205。17图1总RNA凝胶电泳图FIG1RESULTOFTOTALRNAAFTERELECTROPHORESISIN1AGROSEGEL图中电泳条下面的数字代表不同的组织，我们选取了四个组织的总RNA跑带，分别是X器窦腺复合体、胸腹神经节、精巢、卵巢。根据图1我们可以看出凝胶电泳跑出的条带较清晰，降解较低。然后我们测其OD260/280值来确定其适宜性。凝胶电泳测得总RNA含
47、量和OD260/280值见下表。表2总RNA含量和OD260/280值TABLE2THECONTENTOFTOTALRNAANDOD260/280VALUES总RNA总RNA含量（NG/L）纯度（OD260/280）11158180287419839262024768205由表2可以看出，总RNA含量达标，而且纯度也比较高，所以所提取的总RNA满足实验条件，可以进行下面的实验。312荧光定量PCR处理结果本实验采用相对标准曲线进行定量分析，以18S和ACTIN为内参基因，对MIH基因在三疣梭子蟹不同组织中的相对表达进行了研究，各组样品在荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，最后得到了反映核酸扩增
48、过程的S形荧光定量动力学曲线。见图3。28S18S58S123418图3扩增曲线动力学分析FIG3THEANALYSISOFAMPLIFICATIONPLOT图3表示不同实验组织和内参基因在荧光定量PCR中达到阈值所需要的循环数，自左向右分别表示Y器、精巢、脑、肠、卵巢、X器窦腺复合体、胸腹神经节、ACTIN基因、18S基因。达到阈值所需要的循环数越多，CT值越小。图4溶解曲线FIG4FUSIONCURVE从图4可以看出荧光定量动力学曲线基线平整，扩增曲线比较理想。各基因样品熔解曲线都会有一个比较整齐的峰值，基线平整，熔解温度较均一，峰的形状也比较锐利。说明产物扩增具有特异性。从图4中分离出M
49、IH的溶解曲线，见图5。从图5中看出熔解曲线的峰值比较完整，而且熔解度为875左右。19图5MIH基因的溶解曲线FIG5FUSIONCURVEOFMIHGENE313相对定量法处理结果表3相对定量处理结果（18S为内参基因）PROCESSINGRESULTSOFCOMPARATIVEDELTADELTACTREFERENCEGENEIS18S组织CT目的基因（MIH）CT管家基因（18S）CT2CTX器窦腺复合体283012990001胸腹神经节2682771380071793647精巢34259829120001797242卵巢297480463900119239肠32008508190003424241脑33449578560002649618Y器36238831209000022937620MIH基因MRNA的相对表达量（18S为内参基因）0020406081121234567图6MIH基因MRNA在各个实验器官中的相对表达量（18S为内参基因）FIG6COMPARATIVEEXPRESSIONLEVELOFMIHGENEIN
