1、本科毕业论文系列开题报告生物工程利用液相色谱质谱联用技术分析研究地木耳中抗紫外成分一、选题的背景与意义地木耳是一种具有良好的食用、药用和环境生态学价值的陆生蓝藻。由于野生资源限制及不同种质差别，地木耳的人工培养技术远未完善。以宁波产野生地木耳为研究对象,采用结合了色谱法高分离性和质谱法高鉴别特点的液相色谱质谱联用技术，分析研究其中的抗紫外成分。目前国内外对地木耳的化学成分、生物活性和开发利用等研究处于起步阶段，对地木耳营养成分进行了些研究，但是研究结果差别较大；对地木耳的化学成分未进行系统研究，其活性成分及生物活性有待深人研究；有关化学成分的分离纯化、分析结构鉴定、活性测定等研究不够；地木耳功
2、能食品、药品的研究开发不足地木耳营养丰富，富含人体必须的氨基酸，含多种微量元素和维生素。因此，地木耳已成为人们的席上珍馐，利用地木耳可以生产健康饮品、食品同时地木耳也可人药，对某些疾病有独到的疗效。地木耳中粗蛋白质及糖含量中等，含有一定的营养成分，并含有多种的微量元素，尤其是元素锌的含量较高作为人和动物的食物制品，不仅可获得蛋白质的营养成分，同时可补充微量元素锌，是一种营养价值较高可供开发利用的藻类。因此，它是一种很有经济效益和理论价值的微生物。目前，已有越来越多的人把地木耳作为一种野生蔬菜进行开发，其前景十分广阔。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题21研究的基本内容211以宁波产野生地木耳
3、为研究对象，探究适合地木耳的环境条件并培养212采用结合了色谱法高分离性和质谱法高鉴别特点的液相色谱质谱联用技术，分析研究其中的抗紫外成分213开发适合研究地木耳性质与营养含量的液质方法22拟出现的问题221培养方式的不恰当导致抗紫外成分不明显222提取方法的筛选223液质开发技术难题三、地木耳的培养、分离以及条件31培养（不同的培养方法）311材料清洗与灭菌选新鲜、质感好的地木耳，除净杂草和附着物，洗净。移入超净工作台，用75的酒精浸泡40多秒钟，再用消毒棉棒沾上10的洗洁精全面擦洗，超纯水冲洗多次，直至把洗洁精洗净为止，再放入灭菌的培养液中漂洗三次。然后于紫外灯下照射20分钟左右。312光
4、照、温度条件的设置利用最适培养基BG11，就光照和温度对地木耳培养的影响进行了研究。实验中设置25EM2S1和50EM2S1两组光照强度，每组再分别设置25、30和35三个不同的温度，培养过程中光暗周期是12H/12H。313摇动对培养地木耳的影响由于地木耳在液体培养中不宜长期生长，故本实验设置摇动培养，观察摇动与否对悬浮培养地木耳的时间限制。培养方法用250ML的三角瓶装液量200ML放于转速为35R/MIN的摇床上培养，每瓶放入干燥地木耳025G，于2525EM2S1BG11C培养液中培养。定期测定培养过程中培养液溶氧值的变化，测定周期是12H。32提取方法萃取聚集尽可能多的地木耳（1KG
5、），晒干，用80乙醇水溶液加热，回流3H过滤重复提取，直至提取液无色，旋转蒸发浓缩，得到水溶性提取物将其置于分液漏斗，加入两倍体积石油醚萃取，直至萃取液无色，收集石油醚萃取物旋转蒸发，得到石油醚相提取物用两倍体积乙酸乙酯对水溶性提取物萃取分离，直至萃取液无色旋转浓缩，得到乙酸乙酯提取物所剩睡相旋转浓缩，得到水溶性提取物33色谱质谱条件C18色谱柱HYPERSILGOLD（10021MM,17M）；进样量10L，柱温30，流动相为01三氟乙酸水溶液和乙腈，流速03ML/MIN，洗脱梯度为08MIN,10B50B815MIN,50B80B1520MIN,80B90B2025MIN,90B100B。
6、采用电喷雾电离源正离子电离模式，雾化气采用氮气，喷雾电压28KV，鞘气流量30L/MIN，辅助气流量10L/MIN，离子传输毛细管温度300，扫描采用选择反应监测（SRM）模式。碰撞能量见表2，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。技术路线34液质方法开发分离定性定量有紫外和质谱法两种，选用质谱法（三重四极杆质谱）定量包括回收率，精密度，LOD,LOQ选用LCMS/MS法的MRM方式检测地木耳中紫外线成分，灵敏度高,不须经过复杂的富集萃取过程，实验效率明显提高。采用了LC分离技术，利用石油醚/乙酸已酯为流动相，采用三重四极杆质谱的
7、多离子反应监测（MRM）方式，经碰撞能量优化试验，确定特征子离子，可获得极高的检测灵敏度，方法检出定量限（LOQ）均低于1G/L的限量5倍以上，满足了低含量样品的检测要求。方法学验证表明，本方法精密度高，回收率稳定。四、研究的总体安排与进度201011201012毕业论文选题201012201101进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方案。201101201103开题，进行地木耳的采集与提取与检测，201103201105数据和材料整理、分析，完成2篇外文翻译，论文撰写201105201106提交并答辩。五、参考文献1尹显贵液相色谱质谱/串联质谱联用技术及其在药物分析中的应用J天津药
8、学,2000,13351542吴红京,张春扩,赖钟雄等高效液相色谱法测定龙眼胚芽中的细胞分裂素J福建分析实验研究报告,2005,141209620983秦旸,徐友宣,杨树民等液相色谱质谱联用在兴奋剂检测中的应用及进展J色谱,2000,2644314364邓中洋,胡征宇,况琪军等地木耳规模化培养的初步研究J武汉植物学研究2004,2265785805杨方,陈国南高效液相色谱法同时检测水产品中氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素残留J福建分析测试,2005,141211221136郑天,屠春燕高效液相色谱法和液相色谱质谱联用技术在食品工业上的应用J南京工业大学学报,2007,261991057张广洲,马玉
9、贞液相色谱质谱联用技术在体内药物分析中的应用进展J齐鲁药事,2006,2542362378姜艳艳,刘斌,石任兵等高效液相色谱质谱联用技术在天然产物分离鉴定中的应用J药品评价,2005,2111169赵丽娟,周成旭,严小军等地木耳人工培养最适光温条件及功能性成分SCYTONEMIN的变化J食品科学学报,2011,329252810赵鹏,徐继林,亓一舟等几种海洋甲壳动物20羟基蜕皮酮液质分析研究J分析化学,2011,14131511范群艳,吴向阳,朱晓宦等地木耳的研究进展J常熟理工学院学报,2001,214555712盛家荣,范会钦,曾令辉等普通念珠藻的主要营养成分分析J广西师院学报自然科学版,1
10、998,124687013贺宝珍,李义先地木耳营养价值及其潜能研究J山西大学学报自然科学版,1991,41151714胡良成,宋光泉地木耳营养品质的研究初报J仲恺农业技术学院学报,1998,112676915苗影志,王维坚,田青等长白山地藻食品全天然地耳营养保健饮料的研制J食品科学,19966101316李三相,李勃,左国防等陆生蓝藻地木耳中海藻糖研究初报J天水师范学院学报,2004,125050717范群艳,吴向阳,仰榴青等响应面分析法优化地木耳多糖提取工艺的研究J江苏大学学报,2004,17323724218EXEIPLOUTNO,RAYMONDANDBEVERLYSACKLERETALN
11、OSTOCYCLYNEA,ANOVELANTIMICROBIALCYCLOPHANEFROMTHECYANOBACTERIUMNOSTOCJNATPROD2000,63,31524152619JAKI,VOGLER,STICHER,ETALNOVELEXTRACELLULARDITERPENOIDSWITHBIOLOGICALACTIVITYFROMTHECYANOBACTERIUMNOSTOCCOMMUNEJNATPROD2000,63,333934320CHARLESCOCKELL,JOHNKNOWLANDULTRAVIOLETRADIATIONSCREENINGCOMPOUNDSJBIO
12、L,1999,74231134521ANGELAH,BRENDANJACRITICALASSESSMENTOFTHEANALYSISANDDISTRIBUTIONSOFSCYTONEMINANDRELATEDUVSCREENINGPIGMENTSINSEDIMENTSJORGANICGEOCHEMISTRY,2004,35412211228毕业论文文献综述生物工程利用液相色谱质谱联用技术分析研究地木耳中抗紫外成分摘要地木耳是一种具有良好的食用、药用和环境生态学价值的陆生蓝藻，以宁波产野生地木耳为研究对象，探究适合地木耳的环境条件并培养，采用结合了色谱法高分离性和质谱法高鉴别特点的液相色谱质谱联
13、用技术，分析研究其中的抗紫外成分，并开发适合研究地木耳性质与营养含量的液质方法。关键词地木耳；色谱质谱联用；抗紫外成分地木耳NOSTOCCOMMUNEVAUCH俗称地皮菜，属蓝藻门（CYANOPHYTA）念珠藻NOSTOCACEAE。该藻幼小植物体呈球形，成熟植物体外形极像黑木耳1。地木耳是生存范围很广的陆生藻类，我国华北、华南、西北、西南均有分布。其营养价值很高，自古以来就是我国民间的传统美食和绿色保健食品，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质。近年来的研究表明，地木耳多糖、环肽NOSTOFUNGICIDINE等多种物质具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、清除超氧阴离子
14、自由基和羟基自由基等多方面的生物活性，也可增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫机能2。液相色谱质谱联用技术结合了色谱和质谱两者的优点，将色谱法的高分离性能和质谱法的高鉴别特点相结合，组成了较完美的现代分析技术。液相色谱法（LC）是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，操作一般在室温下进行，对于不挥发性化合物和极性化合物和大分子化合物可直接分析，包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等，分析范围广，而且不需衍生化步骤34。液相色谱质谱（LCMS）联用技术也始于20世纪70年代，1977年，LCMS开始投放市场5，1978年首次用于生物样品的药品检测6，1989年，LCMSMS技术取得成功，但直到20世纪80年代中
15、后期大气压电离技术（API）得到发展且逐渐成熟后，LCMS才得以迅速发展，1991年APILS用于药物开发，1997年，LCMS技术用于药物动力学筛选，1999年，APIQ/TOF/LCMSMS投放市场，到2000年，大气压接口的应用，彻底改变了LC/MS的面貌，并很快成为科研和日常分析的有力工具7。1地木耳的营养成分多年来，科学家们对地木耳的研究始终没有间断，并取得了大量的科学数据以及参考方法8。11蛋白类研究报道，地木耳蛋白质含量占干重的2282879。MARCVTHORSTEINSSON等研究发现地木耳含有一种血红蛋白，取名为CYANOGLOBI10。BREANNESHIRKEY等叫从休
16、眠多年的地木耳中得到一种有活性的含铁超氧化物歧化酶SODF，这些SODF可以清除胞外多糖在紫外线照射下产生的超氧自由基，减少紫外线对细胞的损害，并且测定了SODF的氨基酸顺序,另外，地木耳中含有肌红蛋白。111212脂类地木耳是低脂肪食品，粗脂肪含量为02428，因此可以作为低脂肪保健品，。中国医学大辞典记载，地木耳具有“明目，益气，令人有子”的功效。13多糖类报道地木耳的总糖含量是053238，钱信忠研究报道地木耳含有海藻糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、果胶多糖类、葡萄糖苷以及胞外多糖等多种营养成分13。14维生素类地木耳还含有多种维生素，例如维生素C、维生素B、维生素B、维生
17、素A和维生素E14。15矿物质类地木耳含有钾、钠、钙、镁、铁、锰、锌、铜、磷和硒等多种矿物质，这些常量元素和微量元素亦为人体必不可少的营养物质，且从膳食中摄取要比通过药物补给更易被人体吸收。地木耳含钙量很高，长期食用，可预防婴幼儿佝偻病和成人骨质疏松病及上消化道出血症。铁的含量也比较高，长期食用，可预防婴幼儿和孕妇缺铁性贫血症。由于地木耳易采集，对大气污染的敏感性高，马骥等利用地木耳监测大气污染，并分析其结果具有可靠性。16色素类地木耳中含有叶绿素A、B胡萝卜素BEAROTEME、4，4二氧B胡萝卜素、4氧B胡萝卜素和玉米黄素，还有海胆酮、眉藻黄素和念珠藻素。2地木耳的处理技术方法目前还没有成
18、熟的地木耳人工大量培养技术。究其原因，一方面是因为地木耳野生资源量本来就很大，容易采集；另一方面，还可能由于地木耳并未真正被大量开发利用有关。赵良忠等报道了地木耳的实验室培养方法，通过比较地木耳在各种培养基中生长情况，找出了适合地木耳室内扩大培养的培养基，发现地木耳在延迟期宜遮光培养，对数生长期和稳定生长期的光照强度以3504000LX为宜。邓忠祥等人有过地木耳规模化培养的初步研究，是地木耳规模化培养的首次报道15。21地木耳样品预处理50100MG藻样超声破碎（适当程度）SPE小柱富集纯化90甲醇洗脱，浓缩HPLC分析22地木耳分离纯化SPE小柱再生10ML甲醇、10ML水、抽干上样将样液循
19、一次6ML90甲醇溶液洗脱氮气吹干至1ML内流动相定容至2ML离心进样23江苏大学范群艳等人采用响应面分析法优化过地木耳提取工艺，本实验采用液相色谱质谱联用技术检测地木耳中的抗紫外成分16。液相色谱质谱联用是以HPLC为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术，它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体。技术路线选用LCMS/MS法的MRM方式检测地木耳中紫外线成分，灵敏度高,不须经过复杂的富集萃取过程，实验效率明显提高。采用了UPLC分离技术，利用石油醚/乙酸已酯为流动相，采用三重四极杆质谱的多离子反应监测（MRM）方式，经碰撞能量优化试验，确定特征子离子，可获得
20、极高的检测灵敏度，方法检出定量限（LOQ）均低于1G/L的限量5倍以上，满足了低含量样品的检测要求17。方法学验证表明，本方法精密度高，回收率稳定。随着各种离子化技术的不断出现，液相色谱质谱联用在生物、医药等领域的地位越来越重要18。液相色谱质谱串联接口技术的进展当前使用广泛的接口技术有，热喷雾TSP、等离子体喷雾（PSP）、粒子束（LINC）、大气压电离（API）和动态原子轰击技术（FAB）。API技术是当今质谱界最为活跃的领域，它是一种常压电离技，不需要真，减少了许多设备，使用方便，因而近年来得到了迅速发展，主要包括电喷雾离子化ESI气动辅助点喷雾即离子喷雾离子化ISI和大气压化学离子化A
21、PCI种模式19。质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域20。高效液相色谱法作为基本分析方法在食品工业上应用已经十分广泛，液相色谱质谱联用技术解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，特别是适合亲水性强、挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子的分离分析，因此是对食品的生产、运输等过程进行质量监控的有效分析手段，在食品工业中一定会得到更加广泛的应用。近年的仪器都
22、具有单离子和多离子检测的功能，提高了灵敏度及专一性，灵敏度可提高到10G的水平。色谱质谱串联技术主要是利用母离子与子离子的离子对作为筛选离子检测已知药物及其代谢物，这一筛选方法可以最大限度地提高检测灵敏度，但同时也会受到检测化合物数量的限制，对未知其相对分子质量（M）和断裂途径的药物在常规的CID条件下往往无法检测21。3展望地木耳营养丰富，富含人体必须的氨基酸，含多种微量元素和维生素。因此，地木耳已成为人们的席上珍馐，利用地木耳可以生产健康饮品、食品同时地木耳也可人药，对某些疾病有独到的疗效。地木耳中粗蛋白质及糖含量中等，含有一定的营养成分，并含有多种的微量元素，尤其是元素锌的含量较高作为人
23、和动物的食物制品，不仅可获得蛋白质的营养成分，同时可补充微量元素锌，是一种营养价值较高可供开发利用的藻类。因此，它是一种很有经济效益和理论价值的微生物。目前，已有越来越多的人把地木耳作为一种野生蔬菜进行开发，其前景十分广阔。目前国内外对地木耳的化学成分、生物活性和开发利用等研究处于起步阶段，对地木耳营养成分进行了些研究，但是研究结果差别较大；对地木耳的化学成分未进行系统研究，其活性成分及生物活性有待深人研究；有关化学成分的分离纯化、分析结构鉴定、活性测定等研究不够；地木耳功能食品、药品的研究开发不足。使用色谱质谱联用技术不仅可以相对有效地克服背景干扰，也体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱的高分
24、离性能和质谱鉴别力强的特点相结合，组成了比较完善的现代分析技术，较好地适应了地木耳紫外分析研究对高精密度和准确度分析方法的需求，进而获得广泛应用，并将在未来的科技研究与人民生活中发挥此技术的潜在作用。参考文献1尹显贵液相色谱质谱/串联质谱联用技术及其在药物分析中的应用J天津药学,2000,13351542吴红京,张春扩,赖钟雄等高效液相色谱法测定龙眼胚芽中的细胞分裂素J福建分析实验研究报告,2005,141209620983秦旸,徐友宣,杨树民等液相色谱质谱联用在兴奋剂检测中的应用及进展J色谱,2000,2644314364邓中洋,胡征宇,况琪军等地木耳规模化培养的初步研究J武汉植物学研究20
25、04,2265785805杨方,陈国南高效液相色谱法同时检测水产品中氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素残留J福建分析测试,2005,141211221136郑天,屠春燕高效液相色谱法和液相色谱质谱联用技术在食品工业上的应用J南京工业大学学报,2007,261991057张广洲,马玉贞液相色谱质谱联用技术在体内药物分析中的应用进展J齐鲁药事,2006,2542362378姜艳艳,刘斌,石任兵等高效液相色谱质谱联用技术在天然产物分离鉴定中的应用J药品评价,2005,2111169赵丽娟,周成旭,严小军等地木耳人工培养最适光温条件及功能性成分SCYTONEMIN的变化J食品科学学报,2011,329252
26、810赵鹏,徐继林,亓一舟等几种海洋甲壳动物20羟基蜕皮酮液质分析研究J分析化学,2011,14131511范群艳,吴向阳,朱晓宦等地木耳的研究进展J常熟理工学院学报,2001,214555712盛家荣,范会钦,曾令辉等普通念珠藻的主要营养成分分析J广西师院学报自然科学版,1998,124687013贺宝珍,李义先地木耳营养价值及其潜能研究J山西大学学报自然科学版,1991,41151714胡良成,宋光泉地木耳营养品质的研究初报J仲恺农业技术学院学报,1998,112676915苗影志,王维坚,田青等长白山地藻食品全天然地耳营养保健饮料的研制J食品科学,19966101316李三相,李勃,左国
27、防等陆生蓝藻地木耳中海藻糖研究初报J天水师范学院学报,2004,125050717范群艳,吴向阳,仰榴青等响应面分析法优化地木耳多糖提取工艺的研究J江苏大学学报,2004,17323724218EXEI,RAYMOND,BEVERLYETALNOSTOCYCLYNEA,ANOVELANTIMICROBIALCYCLOPHANEFROMTHECYANOBACTERIUMNOSTOCJNATPROD2000,63,31524152619JAKI,VOGLER,STICHERETALNOVELEXTRACELLULARDITERPENOIDSWITHBIOLOGICALACTIVITYFROMTHE
28、CYANOBACTERIUMNOSTOCCOMMUNEJNATPROD2000,63,333934320CHARLES,JOHNULTRAVIOLETRADIATIONSCREENINGCOMPOUNDSJBIOL,1999,74231134521ANGELAH,BRENDANJACRITICALASSESSMENTOFTHEANALYSISANDDISTRIBUTIONSOFSCYTONEMINANDRELATEDUVSCREENINGPIGMENTSINSEDIMENTSJORGANICGEOCHEMISTRY,2004,35412211228本科毕业设计（20_届）利用液相色谱质谱联用技
29、术分析研究地木耳中抗紫外成分目录中英文摘要1引言411蛋白类412脂类413多糖类414维生素类415矿物质类416色素类52实验材料与方法621材料与样品622试剂623仪器624实验方法6241前处理6242光照、温度条件的设置6243摇动培养的设置7244样品培养方式7245提取流程7246标准工作曲线制作825色谱质谱条件83结果与讨论931质谱和液相色谱条件的优化932定量标准曲线和方法检测限12321定量标准曲线12322最低检测限和最低定量限1233方法回收率测定1334精密度测定134实际样品检测1441光照强度对地木耳中SCYTONEMIN含量的影响1442不同培养温度对地木
30、耳中SCYTONEMIN含量的影响1743不同紫外光照时间对地木耳中SCYTONEMIN含量的影响175结论18参考文献19致谢错误未定义书签。附录错误未定义书签。摘要以宁波产野生地木耳为研究对象，探究适合地木耳的环境条件并培养，采用液相色谱三重四级杆质谱联用技术，分析研究其中的抗紫外成分SCYTONEMIN1。在所选实验条件下，以乙腈和01三氟乙酸为流动相，SCYTONEMIN在反相C18色谱柱上得到良好的分离。根据LC/MS的SRM扫描模式和LC/UV对SCYTONEMIN的分离及回收率实验,测出SCYTONEMIN在0550G/ML浓度范围内线性相关系数良好,最低检测限分别为01NG/M
31、L和40NG/ML。平均回收率分别1031和794,相对标准偏差均小于9。在不同培养条件下，通过改变光照强度，温度及紫外照射时间等因素，比较地木耳中SCYTONEMIN的含量变化情况。关键词地木耳液相色谱质谱联用抗紫外成分ABSTRACTTHELIQUIDCHROMATOGRAPHY/TRIPLEQUADRUPOLEMASSSPECTROMETRYHPLCQQQMSMETHODWASDEVELOPEDFORANALYSESANDCHARACTERIZATIONOFSCYTONEMININTHENOSTOCCOMMUNESCYTONEMINOBTAINEDTHEGOODSEPARATIONONT
32、HEREVERSEDC18CHROMATOGRAPHICCOLUMNUSINGACETONITRILEAND01TFAASTHEMOBILEPHASEACCORDINGTOQUANTITATIVEANALYSESUTILIZINGLC/MS（INPOSITIVEIONMODEUSINGSE1ECTREACTIONMONITORINGSRM）ANDLC/UV（384NM）,SCYTONEMINHADGOODLINEARITYATTHERANGEOF0550UG/ML,WITHCORRELATIONCOEFFICIENTABOVE09925THELOWDETECTIONLIMITSWERE01NG
33、/MLAND40NG/ML,RESPECTIVELYTHERECOVERIESOFSCYTONEMINWERE1031AND794,WITHTHEVALUEOFTHERELATIVELYSTANDARDDEVIATIONLESSTHAN9UNDERARTIFICIALCULTURECONDITIONS,COMPARINGTHEAMOUNTSOFSCYTONEMINOFNOSTOCCOMMUNEBYCHANGINGTHETEMPERATURE,LIGHTINTENSITYOFUVANDULTRAVIOLETIRRADIATIONTIMEKEYWORDSSCYTONEMINLCQQQMSQUANT
34、ITATIVEANALYSIS1引言地木耳是一种陆生蓝藻，又称地皮菜，具有很高的营养价值，自古以来就是我国民间的传统美食和绿色保健食品。具有非常良好的食用、药用和生态价值，在宁波等江浙地区分布广泛，地木耳适应生活在潮湿的地方，一般在雨后会大量出现。近年来的研究表明，地木耳多糖、环肽NOSTOFUNGICIDINE等多种物质具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等多方面的生物活性，也可增强吞噬细胞的防御能力和机体的免疫机能。多年来，科学家们的研究始终没有间断，并取得了大量的科学数据和参考方法。地木耳中含有很多的营养成分，譬如蛋白质、脂质、多糖类、维生素类、矿物质类和色素类等
35、，其中有一种成分叫做伪枝藻素，英文名称为SCYTONEMIN，是一种光学活性的天然产物，是地木耳中的抗紫外成分。地木耳的主要成分如下所示11蛋白类研究报道，地木耳蛋白质含量占干重的228287。MARCVTHORSTEINSSON等人研究发现地木耳含有一种血红蛋白，取名为CYANOGLOBI。BREANNESHIRKEY等叫从休眠多年的地木耳中得到一种有活性的含铁超氧化物歧化酶SODF，这些SODF可以清除胞外多糖在紫外线照射下产生的超氧自由基，减少紫外线对细胞的损害，并且测定了SODF的氨基酸顺序,另外，地木耳中含有肌红蛋白2。12脂类地木耳是低脂肪食品，粗脂肪含量为02428，因此可以作为
36、低脂肪保健品，。中国医学大辞典记载，地木耳具有“明目，益气，令人有子”的功效。13多糖类报道地木耳的总糖含量是053238，钱信忠1研究报道地木耳含有海藻糖、蔗糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、果胶多糖类、葡萄糖苷以及胞外多糖等多种营养成分。14维生素类地木耳还含有多种维生素，例如维生素C、维生素B、维生素B、维生素A和维生素E3。15矿物质类地木耳含有钾、钠、钙、镁、铁、锰、锌、铜、磷和硒等多种矿物质，这些常量元素和微量元素亦为人体必不可少的营养物质，且从膳食中摄取要比通过药物补给更易被人体吸收。地木耳含钙量很高，长期食用，可预防婴幼儿佝偻病和成人骨质疏松病及上消化道出血症。铁的含量也
37、比较高，长期食用，可预防婴幼儿和孕妇缺铁性贫血症。由于地木耳易采集，对大气污染的敏感性高，马骥等利用地木耳监测大气污染，并分析其结果具有可靠性。16色素类地木耳中含有叶绿素A、B胡萝卜素、4，4二氧B胡萝卜素、4氧B胡萝卜素和玉米黄素，还有海胆酮、眉藻黄素和念珠藻素。但对于地木耳来说，目前还没有成熟的人工大量培养技术。原因主要有两方面，一方面是因为地木耳野生资源量本来就很大，分布很广，容易采集；另一方面，还可能由于地木耳缺乏科学的引导，并未真正被大量开发利用有关。赵良忠等报道了地木耳的实验室培养方法，通过比较地木耳在各种培养基中生长情况，找出了适合地木耳室内扩大培养的培养基，发现地木耳在延迟期
38、宜遮光培养，对数生长期和稳定生长期的光照强度以3504000LX为宜。邓忠祥等人有过地木耳规模化培养的初步研究，是地木耳规模化培养的首次报道4。在地木耳检测方面，选用LCMS/MS法的SRM方式检测地木耳中紫外线成分，不仅灵敏度高,而且不须经过复杂的富集萃取过程，可以不经分离直接进样分析生物样品，实验效率得到了明显的提高5。而采用了UPLC分离技术，利用石油醚/乙酸已酯为流动相，采用三重四极杆质谱的多离子反应监测（SRM）方式，经过碰撞能量优化试验，确定特征子离子，可获得极高的检测灵敏度，方法检出定量限（LOQ）均低于1G/L的限量5倍以上，可以满足低含量样品的检测要求。方法学验证表明，本方法
39、精密度高，回收率稳定。液相色谱质谱联用技术解决了传统液相检测器灵敏度和选择性不够的缺点，提供了可靠、精确的相对分子质量及结构信息，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，特别是适合亲水性强、非挥发性强的有机物，热不稳定化合物及生物大分子的分离分析6。2实验材料与方法21材料与样品地木耳采自宁波双桥岸边树荫下的沙质土壤上；SCYTONEMIN标准品纯度91，MERCKKGAA,DARMSTADT,德国；22试剂蓝藻专用培养基BG11培养基7乙腈色谱纯，美国TEDIA公司；DMSO分析纯，北京恒业中远化工有限公司；丙酮分析纯，杭州余杭区塘栖镇山村；三氟乙酸色谱纯，美国SIGMAALDRICH
40、公司；甲醇色谱纯，美国TEDIA公司；超纯水超纯水系统法国MILLIPORE公司；23仪器BUCHIR210/215旋转蒸发仪海万捷科技有限公司；GXZ128A智能光照培养箱宁波东南仪器有限公司；WD9405B水平摇床北京六一仪器厂；便携式溶氧仪H1945北京哈纳科仪科技有限公司；PB203N电子天平梅特勒托利多仪器上海有限公司；ANKETGL802B离心机上海安亭科学仪器厂；超纯水系统法国MILLIPORE公司；TSQQUANTUMACCESS液相色谱一三重四极杆质谱联用分析系统美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司；24实验方法241前处理选新鲜、质感好的地木耳，除净杂草和附
41、着物，洗净。移入超净工作台，用75的酒精浸泡40多秒钟，再用消毒棉棒沾上10的洗洁精全面擦洗，超纯水冲洗多次，直至把洗洁精洗净为止，再放入灭菌的培养液中漂洗三次。然后于紫外灯下照射20分钟左右。242光照、温度条件的设置利用最适培养基BG11，就光照和温度对地木耳培养的影响进行了研究实验中设置25EM2S1和50EM2S1两组光照强度，每组再分别设置25、30和35三个不同的温度，培养过程中光暗周期是12H/12H和24H。243摇动培养的设置由于地木耳在液体培养中不宜长期生长，故本实验设置摇动培养，观察摇动与否对悬浮培养地木耳的时间限制。培养方法用250ML的三角瓶装液量200ML放于转速为
42、35R/MIN的摇床上培养，每瓶放入干燥地木耳025G，于2525EM2S1BG11C培养液中培养。定期测定培养过程中培养液溶氧值的变化，测定周期是12H。244样品培养方式挑取无杂质、叶色鲜绿、质好的干燥野生的地木耳，分别称量02G。清理干净，然后放置于300ML无菌三角瓶中，每瓶装液量150ML，于培养条件下培养，7天后取样。设置组别及培养条件分别如下（表1）表1不同培养条件下SCYTONEMIN的含量组别培养时间紫外照射时间光照周期培养光照培养温度1237天7天7天7天7天7天/12H12H12H12H12H12H/25EM2S125EM2S125EM2S125/30/35ABC/50E
43、M2S150EM2S150EM2S1/25/30/352H4H6H10H20H30H/2H4H6H10H20H30H2525252525257天7天7天/24H24H24H50EM2S150EM2S150EM2S125/30/35245提取流程将02G样品在37烘箱烘干，再用100丙酮浸泡，打碎匀浆，在4过夜放置，75超声10MIN，10000R/MIN离心5MIN，再用丙酮浸泡和超声10MIN，重复用丙酮浸泡超声步骤，直至液体无色为止。37旋转蒸发浓缩，丙酮定容至15ML，保存在棕色进样品中，20避光保存待测。确保所有提取工作要一日内完成。246标准工作曲线制作准确称取10MGSCYTONE
44、MIN标准品，用甲醇DMSO（11）溶解定容到10ML，充分摇匀，配制成1MG/ML标准储备液，置4冰箱中避光保存。制作工作曲线时再取此储备液用甲醇DMSO（11）溶液配制成不同浓度的标准溶液8。25色谱质谱条件液相条件固定相选用为C18色谱柱，HYPERSILGOLD（10021MM,17M）；流动相为01三氟乙酸水溶液（A）和乙腈B，流速03ML/MIN，洗脱梯度为08MIN,10B50B815MIN,50B80B1520MIN,80B90B2025MIN,90B100B；进样体积为10L；柱温30。质谱条件采用电喷雾电离源正离子电离模式，雾化气采用氮气，喷雾电压28KV，鞘气流量30L/
45、MIN，辅助气流量10（单位为任意值），离子传输毛细管温度300，扫描采用选择反应监测（SRM）正离子模式。碰撞能量见表2，采集时间均为02S，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。表2SCYTONEMIN在正离子SRM模式下定量离子对及碰撞能量分析物ANALYTES通道1TRANSITION1碰撞能量COLLISIONENERGY通道2TRANSITION2碰撞能量COLLISIONENERGY通道3TRANSITION3碰撞能量COLLISIONENERGY（EV）（EV）（EV）SCYTONEMIN54515263485451517228545
46、14888293结果与讨论31质谱和液相色谱条件的优化对于流动相中的有机相，一般采用甲醇或者乙腈。本实验曾分别采用甲醇、乙腈或甲醇、乙腈混合溶液和水作为的三元流动相9。实验发现使用甲醇作为有机相时，液相色谱图的峰型较为混乱10。不添加三氟乙酸水溶液或者01甲酸水溶液作为流动相时，样品没有出峰,由此可得流动相的PH对SCYTONEMIN色谱峰的出峰情况和峰形会产生较大的影响。利用紫外检测器进行全波段扫描，得出样品的紫外谱图，如图1所示，在384NM下得到最大吸收峰，色谱峰保留时间RT为138MIN。因此，通过多次实验条件摸索，选取乙腈和01三氟乙酸作为流动相，384NM作为紫外检测的定量波长，应
47、用于液相色谱三重四级杆质谱分析研究中，其色谱图如图2所示。SCYTONEMIN10081650PPM24141RT1380AV1NL897E5MICROAU200250300350400450500550600WAVELENGTHNM05101520253035404550556065707580859095100RELATIVEABSORBANCE38400252002980054400560005290058200图1SCYTONEMIN的全波段紫外扫描图RT00035000246810121416182022242628303234TIMEMIN050000100000150000200
48、000250000300000350000400000450000500000550000600000650000700000750000800000850000900000UAU13801271111614871129708011625135777941279416622848194431163419NL908E5CHANNELAUVSCYTONEMIN10081650PPM2图2SCYTONEMIN在384NM下的紫外色谱图用1G/ML的SCYTONEMIN标准溶液，以流动注射方式进行ESI源质谱分析。分别在正、负离子模式下进行检测，SCYTONEMIN在正离子模式主要产生准分子离子峰MH
49、（M/Z545）与文献12报道一致，而在负离子模式下不出峰。因此选择正离子模式作为质谱的扫描模式，液质联用所得的质谱总离子流图如图3所示，保留时间为1389MIN。在正离子模式下，选择目标化合物的MHM/Z545作为选择检测模式（SRM）下的母离子。对其进行二级质谱扫描，产生三个主要碎片离子M/Z5263，5172,4888，以这三个二级碎片离子作为选择反应监测模式下的定量子离子。最后以选择反应监测（SRM）正离子模式优化锥孔电压（TUBELENSOFFSET）、碰撞能量（COLLISIONENERGY）等质谱参数，优化后的质谱条件见表2。SCYTONEMIN的选择反应监测（SRM）质谱图见图4。RT00035000246810121416182022242628303234TIMEMIN05101520253035404550556065707580859095100RELATIVEABUNDANCE138912801266977146426422457950238115741954215327237
