1、本科毕业论文系列开题报告生物技术鱼类肌肉生长抑制素基因进化分析一、选题的背景与意义肌肉生长抑制素（MYOSTATIN，MSTN）是近年来发现的一种重要的肌细胞负向生长调控因子，又称生长分化因子8（GROWTHDIFERENTIATIONFACTOR8，GDF8），属于转化生长因子（TRANSFORMINGGROWTHFACTOR，TGF）家族成员，是体内广泛表达的一种糖蛋白。MSTN是在1997年美国JOHNHOPKING大学医学院的研究小组发现的。该因子具有TGF8共有的结构特征，在脊椎动物体内是高度保守的，氨基酸序列有家族特征。目前国内外对小鼠、猪、牛、鸡、鸭以及鹅的MSTN基因做了大量研
2、究，一致认为该基因多态与生长发育相关，且是负调控肌细胞生长发育，这些哺乳动物中的MSTN主要在骨骼肌中表达。而通过对多种鱼类的研究发现，鱼类MSTN产物在身体中的分布比哺乳动物MSTN在体内的分布更广泛，除了在骨骼肌表达以外，还可以在多个组织中表达，如脑、肠、鳃、肾、性腺等等。鱼类与哺乳动物的MSTN有不同的分布、表达方式，暗示其可能有不同于哺乳动物MSTN的功能；除抑制肌肉生长外，可能还影响其他组织如神经系统的发育。如在MSTN缺失动物模型中除了影响骨骼肌发育外，还对脂肪沉积起抑制作用；以及近来研究发现MSTN基因还与肌肉萎缩症、爱滋病等与肌肉有关的疾病有关。MSTN一经发现就受到了生物学家
3、、医学、育种学界等科学工作者的广泛重视，很快地就成为了分子生物领域的一个研究热点，并且逐步向应用型转化。目前已有几十种鱼类MSTN基因被克隆和报道斑马鱼（DANIORERIO）、虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）、大西洋鲑（SALMOSALAR）、莫桑比克罗非鱼（OREOCHROMISMOSSAMBICUS）、白鲈（MORONEAMERICANA）、条纹石鮨（MSAXATILIS）、金头鲷（SPARUSAURATA）、斑点叉尾鲴（ICTALURUSPUNCTATUS）、波纹短须石首鱼（UMBRINACIRROSA）、花鲈（LATEOLABRAXJAPONICUS）、牙鲆（PARALI
4、CHTHYSOLIVACEUS）、鲤（CYPRINUSCARPIO）、加州鲈（MICROPTERUSSALMOIDES）、眼斑拟石首鱼（SCIAENOPSOCELLATUS）和几种鲆蝶鱼类等。MSTN在鱼类生长发育、免疫和系统进化中的作用受到越来越多重视。目前MSTN基因已经广泛用于哺乳动物系统进化分析，但将其用于鱼类系统进化研究的报道还不多。本研究利用生物信息学上的各种软件对鱼类MSTN基因进行氨基酸替换分析、同源性比较及进化树的构建，得到鱼类MSTN基因的进化特性，以期为研究鱼类肌肉发育调控和进化机理奠定基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1通过在NCBIHTTP/WWWNCBINL
5、MNIHGOV的NUCLEOTIDE中检索各种鱼类的MSTN基因的核苷酸序列。2对各种鱼类的MSTN基因利用生物信息学软件进行分析（1）通过CLUSTALW程序对各种鱼类的MSTN基因序列进行同源性比对。（2）通过MEGA41软件对各种鱼类的MSTN基因序列进行氨基酸替换分析及亲缘进化树的构建。3分析讨论鱼类MSTN基因的进化特性，并对其在分子生物领域上的应用进行展望。三、研究的方法与技术路线1研究方法1）序列检索通过在NCBIHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV的NUCLEOTIDE中检索各种鱼类的MSTN基因的核苷酸序列。2）同源序列检索用检索到的鱼类MSTN基因序列通过CLUSTA
6、LW程序对其进行同源性比对。3）氨基酸替换分析通过CLUSTALW程序对各种鱼类的MSTN基因序列进行氨基酸替换分析。4）进化树构建使用MEGA41软件的NJ法构建各种鱼类的MSTN基因的亲缘进化树。5）对得出的数据进行进化特性的分析。2技术路线在NCBI中检索待用鱼类的MSTN基因的核苷酸序列建立FASTA格式在NCBI中检索待用鱼类的MSTN基因的核苷酸序列建立FASTA格式用软件进行序列分析同源性比对进化树构建氨基酸替换分析鱼类MSTN基因的进化特性CLUSTALWMEGA41四、研究的总体安排与进度2010年10月到2010年11月查阅文献、资料，熟悉实验中要用的各种生物信息学软件20
7、10年12月到2011年2月进行网上实验和外文文献的翻译。2011年3月到2011年4月完成毕业论文。2011年5月准备毕业论文答辩。五、主要参考文献1ALEXANDRACMCPHERRON,ANNMLAWLER,LEESJREGULATIONOFSKELETALMUSCLEMASSINMICEBYANEWTGFSUPERFAMILYMEMBERJNATURE,1997,387662883902岳志刚,杨福合,邢秀梅,宋兴超肌肉生长抑制素的研究新进展J黑龙江畜牧兽医,2010,631333徐良梅,等肌肉生成抑制素一MSTN一基因及其在畜牧业上的应用J东北农业大学学报,2008,39614114
8、44GONZALEZCADAVIDNF,TAYLORWE,YARASHESKIK,ETA1ORGANIZATIONOFTHEHUMANMYOSTATINGENEANDEXPRESSIONINHEALTHYMENANDHIVINFECTEDMENWITHMUSCLEWASTINGPROCNATLACADSCIUSA,1998,952514938149415薛良义,李婷,杨巧一,肖章奎眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析J海洋学报中文版,2008,300395996ALEXANDRACMCPHERRON,THANHVHUYNH,SEJINLEEREDUNDANCYOFMYOSTATIN
9、ANDGROWTH/DIFFERENTIATIONFACTOR11FUNCTIONJBMC,20097马现永,施振旦鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析J华南农业大学学报自然科学版,2004,25285888张增荣,朱庆肌肉生长抑制素（MSTN）基因的研究进展J黑龙江畜牧兽医,2007,119219SHARMAM,KAMBADURR,MATTHEWSKGETALMYOSTATIN,ATRANSFORMINGGROWTHFACTORBETASUPERFAMILYMEMBER,ISEXPRESSEDINHEARTMUSCLEANDISUPREGULATEDINCARDIOMYOCYTESAF
10、TERINFARCTJCELLPHYSIOL,1999,1801910徐建勇,陈松林牙鲆肌肉生长抑制素MSTN基因克隆J水产学报,2008,320449750411叶寒青,陈松林真鲷肌肉生长抑素MSTN基因的克隆及表达分析J高技术通讯,2006,29071318毕业论文文献综述生物技术肌肉生长抑制素基因（MSTN）的研究及进展摘要肌生成抑制素（MSTN）是肌肉生长的一种负调控因子，隶属于TGF超家族，具有TGF超家族所有特点。本文主要阐述了MSTN的结构，遗传效应、组织特异性和同源性以及作用机制，并对其在农业生产和医学领域的发展趋势和应用前景等进行了展望。关键词肌肉生长抑制素肌肉生长抑制素（M
11、YOSTATIN，MSTN）又称生长分化因子8（GROWTHDIFERENTIATIONFACTOR8，GDF8），属于转化生长因子（TRANSFORMINGGROWTHFACTOR，TGF）家族成员，是体内广泛表达的一种糖蛋白。MSTN是近年来发现的一种重要的肌细胞负向生长调控因子，一经发现就受到了生物学家、医学、育种学界等科学工作者的广泛重视，很快地就成为了分子生物领域的一个研究热点，并且逐步向应用型转化。1MSTN的概况11MSTN的发现及结构特征MCPHERRON等1根据TGF超家族的保守区设计一对简并引物，PCR扩增出一个约280BP的新产物。以此为探针筛选小鼠的骨骼肌CDNA文库，
12、得到全长的CDNA序列。分析表明，该CDNA中只有一个可读框（OPENINGREADINGFRAME，ORF），可编码376个氨基酸，它的结构具有TGF超家族的典型特征N端疏水的信号肽序列，可籍以跨越内质网膜，起分泌信号的作用；前区有一个糖基化位点；紧挨着生物活性区由4个氨基酸（RSRRARGSERARGARG）组成一个蛋白酶加工位点；C端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体，即所谓的“CYSKNOT”的结构2，3。GONZALEZCADAVID等于1998证实人的MSTN基因，其全长为77KB，由3个外显子和2个内含子组成，内含子1和内含子2分别为18和24KB，3
13、个外显子编码的氨基酸长度分别为125、124、126个氨基酸4。而欧阳红生等于2001研究表明猪的MSTN起始密码子位于308BP处，外显子1编码第L124个氨基酸及第125个氨基酸残基的密码子的第1个碱基；外显子2为371BP，编码第125氨基酸残基的密码子的第2、3个碱基及第126249氨基酸；外显子3编码第250375氨基酸；终止密码子位于外显子3内5。12MSTN的遗传效应、组织特异性及同源性分析1997年MCPHERRON等1通过基因敲除技术使小鼠的GDF8基因的C端生物活性区缺失得到缺失突变纯合体小鼠，比对照组肌肉量大23倍而且可以存活能够生育肩部、臀部的肌肉明显肥大，整个身体的骨
14、骼肌都比对照组的小鼠大得多，对照组小鼠骨骼肌肌纤维的数目比野生小鼠高出86（P001），DNA的量高出约50（P005），表明突变小鼠的肌肉肥大的原因既有肌细胞的增生（HYPERPLASIA），也有肌纤维的肥大。2009年MEXANDRACMCPHERRON等再次通过敲除基因技术将MSTN和GDF基因敲除，对冗余的MSTN和GDF功能研究，证实其丰余性功能，主要是对骨骼肌的发育，更主要是调节骨骼肌的尺寸6。MCPHERRON等以小鼠的MSTN保守C末端的CDNA序列作为探针筛选不同动物的骨骼肌CDNA文库时，克隆了大鼠、人、猪、鸡、牛、绵羊、狒狒和斑马鱼的CDNA序列；序列分析表明，MSTN和
15、TGF超家族其他成员一样，在不同物种之间高度保守就C一端而言，小鼠、大鼠、人、猪、鸡和火鸡的同源性为100，狒狒、牛和绵羊比较仅有13个碱基的区别。斑马鱼与上述其他动物的同源性为881。MSTN基因在家禽动物中的研究较晚，马现永7等最近研究发现鸡与鹅核苷酸序列的同源性为946，鸡、鹅的MSTN核苷酸序列转换为相应的氨基酸序列的同源性高达979。显然，在哺乳动物中具有高度的保守性8。经研究发现，并不是动物所有组织中都表达肌肉生长抑制素。最初通过对小鼠MSTN基因MRNA分子杂交分析（NORTHERNBLOTANALYSIS）发现，鼠的MSTN基因MRNA仅存在于胚胎生长发育时期和成体小鼠的骨骼肌
16、中，而在其他组织（肺、胸腺、脑、肾、胰腺、肠、脾、睾丸、肝、卵巢等）中均检测不到MSTN基因的转录产物1。在最近研究中现，MSTN不仅在骨骼肌中表达，而且也存在于其他组织中。SHARMA等发现在羊和牛的心脏组织中有MSTN基因的表达9。JIS等发现在猪的乳腺中也表达MSTN基因MRNA，其可能起调节初生猪生长的作用10。RODGERS从BROOKTROUT中获得了2种MSTN的异构体，两者在核酸水平上的同源性为92，其中一种存在于肌肉和大脑中，另一种存在于卵巢中11。RESCAN等的研究也证实了上述结果，从TROUT中克隆了2种MSTN基因，其中MSTN1在各种组织中均表达,而MSTN2仅限于
17、在脑组织中表达12。而通过对多种鱼类的研究发现，肌肉生长抑制素基因在鱼类中的表达更广泛，该基因在罗非鱼、大马哈鱼的骨骼肌、眼、腮、肠、大脑、舌、性腺等组织中均有表达，并且表达的时序性与肌形成一致13。2MSTN的作用机制目前的研究结果证实，MSTN是肌肉生长的负性调控因子，通过抑制成肌细胞的增殖而发挥作用14。从国内外对MSTN的研究情况来看，MSTN如何调控肌细胞发育的分子机理还不清楚。但我们已知道，作为TGF超家族成员是通过与其细胞表面受体相结合引起受体自身磷酸化或诱导下一步级联放大反应来发挥它们在细胞内的生物学作用。目前，人们主要从信号传递、细胞周期等方面对MSTN的作用机理进行深入研究
18、，已取得了一定的进展。21通过调控细胞周期抑制成肌细胞生长许多生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物对自身细胞及其他细胞的DNA代谢的调节，都是通过信号转导途径最终影响细胞周期实现的。研究表明，MSTN控制成肌细胞生长的途径正是通过调控细胞周期进程来抑制成肌细胞增殖与分化的。而成肌细胞的分化与生长是通过生肌调节因子（MRFS）（MYOD、MYF5、MYOG）和P21的表达来可逆地调控。细胞周期受细胞周期素（CYCLIN）、细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDKS）、细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子（CKIS）的共同作用。CDKS作为细胞周期循环的必需因子，帮助细胞完成细胞周期循环，促进肌管的生成。CK
19、IS包括2个家族，P16和P21家族通过调控CDKS的活性来阻断细胞周期，抑制成肌细胞的增殖。P16家族可抑制CDK4和CDK6，而P21家族则抑制所有参与G1S期转化的CDKS。肌肉生长抑制素基因在G1期表达量最高15，可下调CDK2的活性和表达水平，降低了CYCLINE和CDK2复合物的形成。肌肉生长抑制素也可上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物CKIS活性和水平15，16，抑制了CDK2、CDK4的活性，降低了CYCLINE和CDK2及CYCLIND和CDK4复合物的形成。从而阻碍了MYOD丝氨酸苏氨酸残基的磷酸化，使其稳定不能释放G1期向S期进行的基本转录因子E2F，导致G1期不能向S期推
20、进，抑制成肌细胞的迁移、增殖、形成的肌纤维数减少，阻碍了肌肉的生成。22通过受体介导抑制肌肉生长目前，公认的MSTN的信号传导途径是MSTNACTRB型受体（蛋白激酶受体）SMAD蛋白信号传导通路。其中涉及3类SMAD蛋白受体激活型SMAD蛋白（RSMAD）SMAD3、协同型SMAD蛋白（COSMAD）SMAD4和抑制型SMAD蛋白（ISMAD）SMAD7。MSTN在信号转导中需要I型（TPRI）和型（TPRII）受体的异二聚体复合物。MSTN端的半胱氨酸二聚体先与型受体结合，然后再与I型受体结合，在细胞表面形成一个异源聚合体，通过型受体的激酶活性，导致I型受体GS区域的磷酸化。活化的I型受体
21、可与胞浆内SMAD2/3分子的MH2暂时结合，并使SMAD3的端SSXS（SER465、SER467）区的丝氨酸残基磷酸化而激活17。激活后的SMAD23与SMAD4形成复合体，复合体进入细胞核，与基因的调控序列结合促进或者抑制相应基因的转录。MSTN信号通过SMAD23、SMAD4复合体和靶基因如MYOD调控序列上的SBE（SMAD结合因子）结合，抑制靶基因如MYOD的转录，从而抑制MYOD介导的肌肉发生和发育过程，抑制肌肉生长。但SMAD23，SMAD4复合体和SMAD7调控序列上的SBE结合后，促进SMAD7的表达；而SMAD7抑制SMAD23的磷酸化。抑制SMAD23和SMAD4复合体
22、的形成，抑制MSTN诱导的转录，形成负反馈调节。3MSTN的应用发展MSTN作为一种肌肉生长的负性调控因子，通过对其基因结构、表达调控和作用机理的深入了解不仅能使人们加深对肌肉分化、发育和生长的科学认识，还在农业、渔业、畜牧业和医药等很多方面都有广泛的应用前景和商业价值。31MSTN在畜牧上的应用目前在畜牧生产中，MSTN主要在动物应用研究上。可从几个方面入手（1）利用MSTN分子标记技术结合传统的数量育种选培肉质性状优良的畜禽；（2）开发MSTN基因的抗体或抑制剂，使之与MSTN基因表达蛋白结合从而降低或灭活其功能；（3）利用基因同源重组技术（基因敲除技术）获得MSTN基因缺失的动物。（4）
23、利用RNAI技术干扰MSTNMRNA的表达，从而解除或缓解MSTN基因对肌肉细胞的抑制作用。这就可以通过分子辅助育种技术。选育生长迅速、肌肉产量高的优良种群，提高肉类生产；还可以进行转基因动物育种。如MSTN基因修饰的鱼，这种鱼将具有肌肉生产量大、脂肪含量少的优良特点；还可通过建立转MSTN反义RNA基因的动物，培育转基因新品种。32MSTN在医疗医药上的应用MSTN基因在医疗医药业研究领域也十分活跃。GONZALEZCADAVID等4发现，在感染HIV并伴有肌消耗综合症患者血清中MSTN免疫反应性蛋白质显著高于正常人。ZIMMERS等将重组人MSTN蛋白载体肌注于裸鼠后腿，发现裸鼠逐渐开始出
24、现全身骨骼肌的进行性消瘦，但也发现其体内的白色脂肪几乎全部消失，同时出现进行性加重的低血糖状态，这一结果表明，MSTN可能参与机体内的糖、脂代谢18。这就有助于在HIV感染、肿瘤等消耗性病及与机体的糖代谢相关性疾病提供了一条新的途径。最近临床研究表明，MSTN抑制剂能够提高骨骼肌的质量，防止骨骼肌退变19，MSTN基因与一些肌萎缩性疾病如癌症、AIDS、肌营养不良，代谢紊乱症如肥胖症和II型糖尿病等疾病相关。通过阻断MSTN对治疗因慢性疾病引起的肌肉萎缩或许是一种新的治疗策略20，MSTN的深入研究为治疗这些疾病提供了部分理论基础和科学依据，并为研发治疗这类疾病的药物提供了技术支持，蕴涵着巨大
25、的经济价值。在畜牧生产中，虽然分子辅助育种技术和基因敲除技术较传统的数量遗传育种有较多的优点，但是还仍然存在着不足，例如需要较大的群体、投入多、耗时等等。再加上MSTN基因在医学上药用价值，使得研制MSTN抗体或抑制剂、和运用RNAI技术进行分子水平的干扰这两种技术成为了当今研究MSTN领域最具有挑战性的研究方向。参考文献1ALEXANDRACMCPHERRON,ANNMLAWLER,LEESJREGULATIONOFSKELETALMUSCLEMASSINMICEBYANEWTGFSUPERFAMILYMEMBERJNATURE,1997,387662883902岳志刚,杨福合,邢秀梅,宋兴
26、超肌肉生长抑制素的研究新进展J黑龙江畜牧兽医,2010,631333徐良梅,等肌肉生成抑制素MSTN基因及其在畜牧业上的应用J东北农业大学学报,2008,3961411444GONZALEZCADAVIDNF,TAYLORWE,YARASHESKIK,ETA1ORGANIZATIONOFTHEHUMANMYOSTATINGENEANDEXPRESSIONINHEALTHYMENANDHIVINFECTEDMENWITHMUSCLEWASTINGPROCNATLACADSCIUSA,1998,952514938149415欧阳红生,孙燕猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定J中国兽医学报,2001,
27、2154794816ALEXANDRACMCPHERRON,THANHVHUYNH,SEJINLEEREDUNDANCYOFMYOSTATINANDGROWTH/DIFFERENTIATIONFACTOR11FUNCTIONJBMC,20097马现永,施振旦鸡、鹅肌肉生成抑制因子基因的克隆及序列分析J华南农业大学学报自然科学版,2004,25285888张增荣,朱庆肌肉生长抑制素（MSTN）基因的研究进展J黑龙江畜牧兽医,2007,119219SHARMAM,KAMBADURR,MATTHEWSKGETALMYOSTATIN,ATRANSFORMINGGROWTHFACTORBETASUPER
28、FAMILYMEMBER,ISEXPRESSEDINHEARTMUSCLEANDISUPREGULATEDINCARDIOMYOCYTESAFTERINFARCTJCELLPHYSIOL,1999,1801910JIS,LOSINSKIRL,CORNELIUSSC,ELA1MYOSTATINEXPRESSIONINPORCINETISSUESTISSUESPECIFITYANDDEVELOPMENTALANDPOSMATALREGULATIONAMJPHYSM,1998,2751265127311RODGERSBD,WEBERGMSEQUENCECONSERVATIONAMONGFISHMYO
29、STATINORTHOLOGUESANDTHECHARACTERIZATIONOFTWOADDITIONALCDNACLONESFROMMORONESAXATILISANDMORONEAMERICANAJCOMPBIOCHEMPHYSIOLBBIOCHEMMOLBIOL,2001,12959760312RESCANPY,JUTELI,RALLIERECTWOMYOSTATINGENESAREDIFFERENTIALLYEXPRESSEDINMYOTOMALMUSCLESOFTHETROUTONCORHYNCHUSMYKISSJJEXPBIOL,2001,2043523352913王娜,石新辉,
30、胡兰,郑颖肌肉生长抑制素的研究进展及应用现状J畜牧与兽医,2005,3710555814戴晔,候水生,刘小林MYOSTATIN基因研究进展J畜牧兽医杂志,2005,246121415THOMASM,LANGLEYB,BERRYC,ETA1MYOSTATIN,ANEGATIVEREGULATOTOFMUSCLEGROWTH，FUNCTIONSBYINHIBITINGMYOBLASTPROLIFERATIONJJBIOLCHEM,2000,275402354024316JOULIAD,BERNARDIH,GARANDELVMECHANISMSINVOLVEDINTHEINHIBITIONOFMYO
31、BLASTPROLIFERATIONANDDIFERENTIATIONBYMYOSTATINJEXPERIMENTALCELLRESEARCH,2003,286226327517KAMBADURR,SHARMAM,SMITHTP,ETA1MUTATIONSINMYOSTATINGDF8INDOUBLEMUSCLEDBELGIANBLUEANDPIEDMONTESECATTLEJGENOMERESEARCH,1997,7991091618ZIMMERSTA,DAVIESMV,KONIARISLGETALINDUCTIONOFCACHEXIAINMICEBYSYSTEMICALLYADMINIST
32、EREDMYOSTATINJSCIENCE,2002,29655721486148819TSUCHIDAKMYOSTATININHIBITIONBYFOLLISTATINDERIVEDPEPFIDEAMELIORATESTHEPATHOPHYSIOLOGYOFMUSCULARDYSTROPHYMODELMICEJACTAMYOL,2008,127141820ZAMORAE,GALFINA,SIMOR,ETA1ROLEOFMYOSTATININWASTINGSYNDROMEASSCIATERWITHCHRONICDISEASESJMEDCLINBARC,2008,13115585590本科毕业设
33、计（20_届）鱼类肌肉生长抑制素基因的进化分析目录摘要1关键词1ABSTRACT1KEY2引言31材料与方法311不同物种MSTN基因序列检索312序列分析方法52结果与分析521MSTN基因的同源性分析522MSTN氨基酸替换分析1023不同物种MSTN基因的进化分析103讨论11致谢13参考文献14摘要肌肉生长抑制素（MYOSTATIN，MSTN）基因对肌肉生长起负调控作用。本研究报道了鱼类与哺乳类、鸟类以及各种鱼类之间MSTN基因的同源性和位于MSTN基因序列C端区域上的碱基替换情况，同时还通过构建NJ进化树分析了各种鱼类间的系统进化关系。利用CLUSTALW多重序列比对，发现MSTN基
34、因上的C端生物活性区在鱼类还是哺乳类或是鸟类，都具有很强的保守性，且在C端都具有一个保守的蛋白酶加工位点RXXR及9个CYS残基。同时在保守性强C端区域内仅有几处存在碱基的替换，其中在碱基数分别为36BP和19BP的两个高度保守片段上，36BP的氨基酸片段，除了大黄鱼有一处R替换G，鸟类和哺乳类有一处D替换A外，所有鱼类都是相同的。19BP的氨基酸片段，除了溪红点鮭有一处T替换A，大西洋鲑有一处I替换V外，从鱼类到哺乳类都是相同的。在CLUSTALW的基础上通过MEGA41软件以35种脊椎动物MSTN氨基酸序列构建的进化树上分析得到，鲈形总目的鱼类（大黄鱼、花鲈、罗非鱼、石鼓鱼、美国红鱼和青鳉
35、）之间相似性高达8899，同时鲈形总目鱼类与其它两种（鲱形总目和鲤形总目）之间的相似性分别有8290及7282，而鲱形总目与鲤形总目的鱼类之间相似性有7988。MSTN的研究将更有助于了解鱼类肌肉发育调控和进化机理。关键词鱼类；肌肉生长抑制素基因；同源性；进化分析ABSTRACTTHEGENEOFMYOSTATINISANEGATIVEREGULATOROFSKELETALMUSCLEGROWTHTHISSTUDYREPORTEDTHEHOMOLOGYOFMSTNGENEBETWEENTELEOSTANDMAMMALS,AVIANANDDIFFERENTTELEOST,ASWELLASTHEB
36、ASESUBSTITUTIONTHATLOCATEDINTHECTERMINALAREAATTHESAMETIME,EVOLUTIONARYTREEOFALLKINDSOFTELEOSTWEREBUILTBYUSINGTHENEIGHBORJOININGMETHODOFPHYLOGENETICANALYSISAFTERCLUSTALWMULTIPLESEQUENCEALIGNMENT,STRONGCONSERVATISMINTHECTERMINALBIOLOGICALACTIVITYAREAOFTHEMSTNGENESALLHAVEBEENFOUNDINTELEOST,MAMMALIANORA
37、VIANMOREOVERITCONTAINSARXXRPROTEOLYTICPROCESSINGSITEANDNINECONSERVEDCYSTEINERESIDUESSEVERALBASESUBSTITUTION,INCLUDINGTWOHIGHLYCONSERVATIVESEGMENTWHICHTHENUMBEROFBASESIS36BPAND19BPALSOEXISTSINTHISREGIONINTHEAMINOACIDSCLIPSOF36BP,ALLTHETELEOSTARETHESAMEEXCEPTONEPLACEOFRSUBSTITUTEFORGINPSEUDOSCIAENACRO
38、CEAANDDSUBSTITUTEFORAINMAMMALIANANDAVIANIDENTICALLY,INTHEAMINOACIDSCLIPSOF19BP,FROMTELEOSTTOMAMMALSARETHESAMEEXCEPTONEPLACEOFTSUBSTITUTEFORAINSALVELINMFONTINALISANDISUBSTITUTEFORVINSALMOSALARTHROUGHTHEPHYLOGENETICTREEBASEDONTHEAMINOACIDSSEQUENCESOFMSTNFROM35SPECIESOFVERTEBRATE,ANALYSISREVEALEDTHEDIF
39、FERENTPERCOMORPHAOFPSEUDOSCIAENACROCEA,LATEOLABRAXJAPONICUS,OREOCHROMISMOSSAMBICUS,UMBRINACIRROSA,SCIAENOPSOCELLATUSANDORYZIASLATIPESWERE8799IDENTICALTOEACHOTHERMEANWHILETHEYWERE7282AND8290IDENTICALWITHINTHETWOOTHERACTINOPTERYGIIOFCLUPEOMORPHAANDCYPRINIFORMESWHLIECLUPEOMORPHAANDCYPRINIFORMESWERE7988
40、IDENTICALTOEACHOTHERONGOINGWORKINTELEOSTMSTNGENEWILLHELPBETTERUNDERSTANDTHEDEVELOPMENTREGULATIONANDEVOLUTIONMECHANISMOFTELEOSTKEYWORDSTELEOSTMYOSTATINHOMOLOGYEVOLUTIONANALYSIS引言骨骼肌发育过程中的生长分化一直是人们感兴趣的的热点问题之一。它由生肌决定因子（MDFS，MYOGENICDETERMINATINGFACTORS）家族基因调控1。二十世纪九十年代发现的肌肉生长抑制素（MYOSTATIN，MSTN），又称生长分化因
41、子8（GROWTHANDDIFFERENTIALFACTOR8）对生长具有负调控作用，是体内广泛表达的一种糖蛋白。MCPHERRON等2发现MSTN基因的CDNA中只有一个可读框（OPENINGREADINGFRAME，ORF），可编码376个氨基酸，它的结构具有TGF超家族的典型特征N端疏水的信号肽序列，可籍以跨越内质网膜，起分泌信号的作用；前区有一个糖基化位点；紧挨着生物活性区由4个氨基酸（RSRRARGSERARGARG）组成一个蛋白酶加工位点；C一端包含9个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体，即所谓的“CYSKNOT”的结构3，4。MSTN敲除的小鼠，其骨骼肌重量明
42、显增加，是正常野生型小鼠的23倍左右。随后，MSTN的功能在双肌牛品种比利时蓝牛（BELGIANBLUE）和皮尔蒙特牛（PIEDMONTESE）得到进一步证明2。之后，MSTN的重要性以及其在动物育种中的潜在应用前景日益得到动物育种学家的关注，可以通过抑制MSTN的活性，提高养殖品种的肌肉含量，促进养殖品种的生长。以及近来研究发现MSTN基因还对脂肪沉积起抑制作用，与肌肉萎缩症、爱滋病等与肌肉有关的疾病相关5，6。而通过对多种鱼类的研究发现，鱼类MSTN产物在身体中的分布比哺乳动物MSTN在体内的分布更广泛，除了在骨骼肌表达以外，还可以在多个组织中表达，如脑、肠、鳃、肾、性腺等等7。鱼类与哺乳
43、动物的MSTN有不同的分布、表达方式，暗示其可能有不同于哺乳动物MSTN的功能。由于鱼类在系统发生过程中，有基因重复现象发生，从而导致MSTN产生两种基因型8。目前，对鱼类MSTN的研究较为深入，已在多种鱼类中克隆到MSTN，并对该基因的特征进行了一些分析，如斑马鱼（DANIORERIO）9，10、溪红点鲑（SALVELINMFONTINALIS）11，12，虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）13、大西洋鲑（SALMOSALAR）14、金头鲷（SPARUSAURATA）15，16、莫桑比克罗非鱼（OREOCHROMISMOSSAMBICUS）17、白鲈（MORONECHRYOPS）1
44、7、斑点叉尾鲴（ICTALURUSPUNCTATUS）18、白石鮨（MORONEAMERICANA）19、条纹石鮨（MORONESAXATILIS）19、石鼓鱼（UMBRINACIRROSA）20、长鳍叉尾鲴（ICTALURUSFURCATUS）21、白叉尾鲴（AMEIURUSCATUS）21、花鲈（LATEOLABRAXJAPONICUS）22、美国红鱼（SCIAENOPSOCELLATUS）23、大黄鱼（PSEUDOSCIAENACROCEA）24和几种鲆蝶鱼类等。MSTN在鱼类生长发育、免疫和系统进化中的作用受到越来越多重视。目前MSTN基因已经广泛用于哺乳动物系统进化分析，但将其用于鱼
45、类系统进化研究的报道还不多。本研究利用生物信息学上的各种软件对鱼类MSTN基因进行氨基酸替换分析、同源性比较及进化树的构建，得到鱼类MSTN基因的进化特性，以期为研究鱼类肌肉发育调控和进化机理奠定基础。1材料与方法11不同物种MSTN基因序列检索通过NCBI（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/）的GENBANK中读取鱼类、鸟类、哺乳类各物种的MSTN基因。见表1。表1进行序列分析的物种物种（SPECIES）GENBANK登录号（GENBANKACCESSIONNO）编码蛋白数量（PROTIEN）MAMMALIANHOMOSAPIENSAF019627375AAOVISARIESAF0
46、19622375AA物种（SPECIES）GENBANK登录号（GENBANKACCESSIONNO）编码蛋白数量（PROTIEN）RATTUSNORVEGICUSAF019624376AABOSTAURUSAF019620375AAPAPIOHAMADRYASAF019619375AASUSSCROFAAF019623375AAAVIANMELEAGRISGALLOPAVOAF019625362AACOTURNIXCOTURNIXAF407340375AAANSERANSERAY448009375AACOLUMBALIVIAAF440863375AATELEOSTPSEUDOSCIAENAC
47、ROCEAAY842934376AAPSEUDOBAGRUSFULVIDRACODQ767966393AASPARUSAURATAAF258448385AATAKIFUGURUBRIPESAY445322376AASEBASTESSCHLEGELIIDQ423474377AAUMBRINACIRROSAAF316881376AAEPINEPHELUSCOIOIDESAY856860276AADANIORERIOAF019626374AAORYZIASLATIPESAB520935377AAONCORHYNCHUSMYKISSAF273035373AAPROCYPRISRABAUDIYGU553
48、283375AACTENOPHARYNGODONIDELLAEU555520375AASALMOSALAR1AAJ344158373AASALMOSALAR1BAJ297267373AASALVELINUSALPINUSAJ829532373AAONCORHYNCHUSKISUTCHAY434465325AAMEGALOBRAMAPELLEGRINIGU5532841375AASALVELINUSFONTINALISAF247650373AAICTALURUSFURCATUSAY540992390AAICTALURUSPUNCTATUSAF396747389AAMORONEAMERICANAA
49、F290911376AAMORONECHRYSOPSAF197194377AAMORONESAXATILISAF290910376AALATEOLABRAXJAPONICUSAY965685374AA物种（SPECIES）GENBANK登录号（GENBANKACCESSIONNO）编码蛋白数量（PROTIEN）ACANTHOPAGRUSSCHLEGELIIDQ303480382AASCIAENOPSOCELLATUSDQ855526376AATILAPIAMOSSAMBICUSAF197193376AA12分析方法采用CLUSTALW（HTTP/WWWEBIACUK/TOOLS）程序对哺乳类、鸟类和鱼类之间以及各种鱼类之间MSTN基因进行多序列的同源性比对，并用手工校正。进行比对的物种见表2。系统进化树的构建使用MEGA40中的NEIGHBORJOINING方法25，自展值为1000。进行构建进化树的物种见表1。表2进行同源性比对的物种物种（SPECIES）GENBANK登录号（GENBANKACCESSIONNO）编码蛋白数量（PROTIEN）MAMMALIANHOMOSAPIENSAF019627375AAOVISARIESAF019622375AARATTUSNORVEGICU
