1、本科毕业论文系列开题报告生物工程假微型海链藻DGAT基因的重组质粒构建一、选题的背景与意义背景随着全球经济的快速增长，石油、煤炭和天然气等化石能源的消耗大幅度上升，导致一方面化石能源日益枯竭，另一方面，大量的二氧化碳气体进入大气，引起温室效应。自京都议定书签署生效后，二氧化碳在全球范围内受到排放限制，如何减排二氧化碳并对其进行资源化利用也成为研究热点。在各种可再生能源中，具有广泛实用价值的能源是生物质能。生物质是地球上最普遍的一种可再生能源资源，它包括林业生物质、能源作物、水生植物、农业废弃物、城市垃圾、有机废水和人畜粪便等。在生物质的循环利用中，生物质转化产生的碳与植物生长所吸收的碳的量几乎
2、相等。因此生物质的利用不会造成大气中二氧化碳的增加。生物质燃料中硫含量极少，不会排放导致酸雨的二氧化硫；而且生物质燃烧产生的灰分较少，这些灰分还可用作农作物肥料。近年来生物柴油BIODIESEL作为化石能源的替代燃料，已成为国际上发展最快、应用最广的环保可再生能源。意义微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出O2。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等植物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培
3、养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可以利用工业废气中的CO2，是制备生物柴油的良好原料，是未来生物柴油发展的研究热点。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1构建含DGAT基因的重组质粒以适用于拟南芥中的表达。2含GFP荧光蛋白的DGAT重组质粒的构建。拟解决的主要问题1克隆基因的酶切位点问题、载体酶切的问题、连接片段浓度比的问题2采用INFUSION基因克隆法重组质粒时出现低转化率、DNA片段低质量、对照组重组克隆良好而实验组克隆效率低、大多数克隆子不含DGAT目的基因、大多数克隆子含有非目的基因的片段。三、研究的方法与技术路线研究方法1对PCAMBIA13
4、00表达质粒进行双酶切得到线性质粒。采用INFUSION基因克隆法，根据线性表达质粒的末端15个碱基和DGAT全长基因设计合适的引物来进行PCR。对扩增得到DGAT基因进行合适的酶切，然后用INFUSION酶处理DGAT基因片段和PCAMBIA1300线性质粒，得到含DGAT基因的PCAMBIA1300DGAT重组质粒。2用双酶切法酶切含GFP基因的PACGFP11质粒，得到具有粘性末端的GFP基因片段。同样酶切处理含有DGAT基因全长序列的PMD18T测序质粒，得到具有粘性末端的DGAT基因。用连接酶处理两个片段得到GFPDGAT线性片段。同样采用INFUSION基因克隆法，对PCAMBIA
5、1300表达质粒进行双酶切得到的线性质粒。然后根据GFPDGAT线性片段和线性表达质粒的末端15个碱基设计合适的引物，PCR扩增GFPDGAT片段，得到的片段与线性表达质粒用INFUSION酶处理，得到PCAMBIA1300GFPDGAT重组质粒。实验1技术路线PCAMBIA130010107BPKPNIXBAICAMV35SPROMOTERCAMV35SPROMOTERMCSKANAMYCINR目的基因DGAT根据线性质粒末端15个碱基设计含15个同源碱基的PCR引物双酶切得到线性质粒PCR产物INFUSION酶处理15MIN3715MIN5030MIN反应蓝白斑筛选PCAMBIA1300D
6、GAT重组质粒实验2技术路线四、研究的总体安排与进度201011指导老师毕业论文题目下达201011201012进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和PACGFP114150BPNOTISACIMCSACGFP1KANAMYCINRPUCORI双酶切产生具有粘性末端的片段HINDIIISACISACINOTI含有粘性末端的GFP基因含有粘性末端的DGAT基因连接酶处理PMD18TAMPORILACZPZPR1AMPORIRPCR扩增含有双酶切位点的目的片段GFPDGAT线性片段目的片段接着用实验1的技术路线得到PCAMBIA1300GFPDGAT重组质粒实验方案。20
7、11220113完成2篇外文翻译2011320114假微型海链藻DGAT基因的重组质粒构建的实验阶段及结果的观察记录与分析2011420115论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1BROWNC,KNIGHTSBAHYDROCARBONCONTENTANDITSRELATIONSHIPTOPHYSIOLOGICALSTATEINTHEGREENALGABOTRYOCOCCUSBRAUNIIPHYTOCHEMISTRY,1969,835435472LARGEAUC,CASADEVALLE,BERKALIFFCSITESOFACCUMULATIONANDCOMPOSITIONOFHYDROCARB
8、ONSINBOTRYOCOCCUSBRAUNIIPHYTOCHEMISTRY,1980,196104310513缪小玲，吴庆余微藻油脂制备生物柴油的研究太阳能学报,2007,2822192224张薇，吴虹，宗敏华蛋白核小球藻发酵产油脂的研究微生物学通报,2008,3568558605LASSNERMW,LARDIZABALK,METZJGAJOJOBABETAKETOACYLCOASYNTHASECDNACOMPLEMENTSTHECANOLAFATTYACIDELONGATIONMUTATIONINTRANSGENICPLANTSJPLANTCELL,1996,82812926SAHAS，E
9、NUGUTTIB，RAJAKUMARIS，RAJASEKHARANRCYTOSOLICTRIACYLGLYCEROLBIOSYNTHETICPATHWAYINOILSEEDSMOLECULARCLONINGANDEXPRESSIONOFPEANUTCYTOSOLICDIACYLGLYCEROLACY1TRANSERASEJPLANTPHYSIOLOGY，2006，1414153315437LEHNERR，KUKSISABIOSYNTHESISOFTRIACY1G1YCERLSJPROGRESSINLIPIDRESEARCH，1996，3521692018CASESS，SMITHSJ，ZHENG
10、YWIDENTIFICATIONOFAGENEENCODINGANACYLCOADIACYLGLYCEROLACY1TRANSFERASE，AKEYENZYMEINTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJPROFNATLACADSCI，1998，952213018130239HOBBSDH，LUC，HILLSMJCLONINGOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMARABIDOPSISTHALIANAANDITSFUNCTIONALEXPRESSIONJFEBSLETT，1999，452314514910ROUTABOUIJM
11、，BENNINGC，BECHTOLDN，CABOCHEM，LEPINIECLTHETAG1LOCUSOFARABIDOPSISENCODESFORADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEJPLANTPHYSIOLBIOCHEM，1999，371183184011ZOUJ，WEIYD，JAKOC，KUMARA，SEIVARAJG，TAYLORDCTHEARABIDOPSISTHALIANATAG1MUTANTHASAMUTATIONINADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEGENEJPLANTJOURNAL，1999，19664565312LUNGSC，
12、WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS，2006，41121073108813BOUVIERP，BENVENISTEP，OELKERSP，STURLEYSL，SCHAIIERHEXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEURJBIOCHEM，2000，2671859614SANDAGERL，GUSTSVSSONMH，STEHIU，D
13、AHIQVISTA，WIBERGE，BANASA，LENMANM，RONNEH，STYMNESSTORAGELIPIDSYNTHESISISNONESSENTIALINYEASTJJBIO1CHEM，2002，27786478648215WAKIMOTOK,CHIBAH,MICHIBATAH,SEISHIMAM,KAWASAKIS,OKUBOK,MITSUIH,TORIIH,IMAIYANOVELDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGAT2ISDECREASEDINHUMANPSORIATICSKINANDINCREASEDINDIABETICMICEBIOCHEMBI
14、OPHYSRESCOMMUN,2003,310229630216CHENHC,FARESERVINHIBITIONOFTRIGLYCERIDESYNTHESISASATREATMENTSTRATEGYFOROBESITYLESSONSFROMDGAT1DEFICIENTMICEARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL,2005,25348248617TURKISHAR,HENNEBERRYAL,CROMLEYD,PADAMSEEM,OELKERSP,BAZZIH,CHRISTIANOAM,BILLHEIMERJT,STURLEYSLIDENTIFICATIONOFTWONOVELH
15、UMANACYLCOAWAXALCOHOLACYLTRANSFERASESMEMBERSOFTHEDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2DGAT2GENESUPERFAMILYJBIOLCHEM,2005,28015147551476418WINTERA,VANEM,BININDAEMONDSOR,HABERMANNFA,FRIESRGENOMICORGANIZATIONOFTHEDGAT2/MOGATGENEFAMILYINCATTLEBOSTAURUSANDOTHERMAMMALSCYTOGENETGENOMERES,2003,10214424719STONESJ,L
16、EVINMC,FARESERVMEMBRANETOPOLOGYANDIDENTIFICATIONOFKEYFUNCTIONALAMINOACIDRESIDUESOFMURINEACYLCOADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2JBIOLCHEM,2006,28152402734028220FRIESR,WINTERAMETHODOFTESTINGAMAMMALFORITSPREDISPOSITIONFORFATCONTENTOFMILKAND/ORITSPREDISPOSITIONFORMEATMARBLINGPATENT,INTERNATIONALAPPLICATIO
17、NNUMBERPCT/EP02/07520,2002,WORLDINTERNATIONALPROPERTYORGANIZATION21WOMACKJE,JOHNSONJS,OWENSEK,REXROADCE,SCHLAPFERJ,YANGYP,AWHOLEGENOMERADIATIONHYBRIDPANELFORBOVINEGENOMEMAPPINGMAMMALIANGENOME,1997,885485622BANDMR,LARSONJH,REBEIZM,GREENCA,HEYENDW,DONOVANJ,WINDISHR,STEININGC,MAHYUDDINP,WOMACKJE,LEWINH
18、AANORDEREDCOMPARATIVEMAPOFTHECATTLEANDHUMANGENOMESGENOMERESEARCH,2000,101359136823PEREZENCISOM,CLOPA,NOGUERAJL,OVILOC,COLLA,FOLCHJM,BABOTD,ESTANYJ,OLIVERMA,DIAZI,SANCHEZAAQTLONPIGCHROMOSOME4AFFECTSFATTYACIDMETABOLISMEVIDENCEFROMANIBERIANBYLANDRACEINTERCROSSJANIMSCI,2000,78102525253124DEKONINGDJ,JANS
19、SLL,RATTINKAP,VANOERSPA,DEVRIESBJ,GROENENMA,VANDERPOELJJ,DEGROOTPN,BRASCAMPEW,VANARENNDONKJADETECTIONOFQUANTITATIVETRAITLOCIFORBACKFATTHICKNESSANDINTRAMUSCULARFATCONTENTINPIGSSUSSCROFAGENETICS,1999,15241679169025PASZEKAA,WILKIEPJ,FLICKINGERGH,ROHRERGA,ALEXANDERLJ,BEATTIECW,SCHOOKLBINTERVALMAPPINGOFG
20、ROWTHINDIVERGENTSWINECROSSMAMMGENOME,1999,10211712226JAKOC，KUMARA，WEIYD，ZOUJ，BARTONDL，GIBLINEM，COVELLOPS，TAYLORDCSEEDSPECIFICOVEREXPRESSIONOFANARABIDOPSISCDNAENCODINGADIACYLGLYCEROLACYTRANSFERASEENHANCESSEEDOILCONTENTANDSEEDWEIGHTJPLANTPHYSIOLOGY，2001，126286187427KATAVICV，REEDDW，TAYLORDC，CIBLINEM，BA
21、RTONDL，JIATAOZ，MACKENZIESL，COVELLOPS，KUNSTLALTERATIONOFSEEDFATTYACIDCOMPOSITIONBYANETHYLMETHANESULFONATEINDUCEDMUTATIONINARABIDOMISTHALIANAAFFECTINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEACTIVITYJPLANTPHYSIOLOGY，1995，1081399409毕业论文文献综述生物工程DGAT基因的研究现状摘要能源是国家经济发展的主要基础。随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源日益枯竭，能源短缺制约了社会经济的发展。能
22、源、环境和社会经济发展的矛盾日益突出。藻类具有生物量大、生长周期短、易培养以及含有较高的脂类等特点，是制备生物质液体燃料的良好材料。关键词假微型海链藻；尼罗红；乙酰辅酶A羧化酶；二酰甘油酰基转移酶；拟南芥正文1生物能源的现状随着全球经济的快速增长，石油、煤炭和天然气等化石能源的消耗大幅度上升，导致一方面化石能源日益枯竭，另一方面，大量的二氧化碳气体进入大气，引起温室效应。自京都议定书签署生效后，二氧化碳在全球范围内受到排放限制，如何减排二氧化碳并对其进行资源化利用也成为研究热点。在各种可再生能源中，具有广泛实用价值的能源是生物质能。生物质是地球上最普遍的一种可再生能源资源，它包括林业生物质、能
23、源作物、水生植物、农业废弃物、城市垃圾、有机废水和人畜粪便等。在生物质的循环利用中，生物质转化产生的碳与植物生长所吸收的碳的量几乎相等。因此生物质的利用不会造成大气中二氧化碳的增加。生物质燃料中硫含量极少，不会排放导致酸雨的二氧化硫；而且生物质燃烧产生的灰分较少，这些灰分还可用作农作物肥料。近年来生物柴油BIODIESEL作为化石能源的替代燃料，已成为国际上发展最快、应用最广的环保可再生能源。2微藻的优点微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出O2。微藻是光合效率最高
24、的原始植物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等植物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可以利用工业废气中的CO2。因此，微藻生物柴油成为了潜在的能源研究热点。目前的产油藻主要是葡萄藻（BOTRYOCOCCUSBRAUNII）1,2、小球藻（CHLORELLAPYRENOIDOSA）3,4等。3二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的研究现状二脂酰甘油酰基转移酶（DIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE,DGAT）是一种甘油酰基转移酶，该酶与脂肪代谢、脂类在组织中的沉积有很大的关系
25、，它的主要作用机制是使二酰甘油（DIACYLGYCEROL,DAG）加上脂肪酸酰基形成三酰甘油（TRIACYLGYCEROL,TAG）。在植物中，TAG的合成对种子油脂的形成十分重要5。到目前为止，在植物中共发现3类DGAT基因家族，包括DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族6,7。DGAT3基因家族是SAHA等6从发育中的花生子叶细胞质中克隆的一个与TAG合成相关的基因，该基因属于DGAT基因家族，但是与DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10，因此将其称为DGAT3基因。DGAT1基因家族只存在于动物和植物中811。高等植物DGAT1蛋白的氨基酸残基数一般在480550之间，不同
26、物种的DGAT氨基端前100个氨基酸残基相似性较低低于20，而位于100以后的氨基酸残基相似性较高大于70，可能正是这种N端的差异导致不同植物DGAT1酶属性的不同12。DGAT2基因家族的成员在动物、植物和酵母中都存在8,12,13,14，并且与DGAT1基因家族没有明显的相关性。DGAT2酶是机体内一种非常重要的酶,它被认为是控制高甘油三酯TAG所致疾病,如肥胖症、高血糖、糖尿病、冠病、脂质代谢紊乱、脂肪肝、高甘油三酯血症等代谢异常综合征等的潜在标靶1519。对于植物DGAT2的研究较少，目前已知的植物DGAT2蛋白氨基酸残基数在320左右。DGAT3基因目前只在花生中发现，其蛋白序列与上
27、面两种DGAT家族同源性很低，但是具有类似DGAT蛋白功能基序6。DGAT相关基因可能对肌内脂肪含量产生重要影响，从而影响肉质，该基因极有希望成为影响肉质性状肌内脂肪含量候选基因。证据如下（1）DGAT酶直接参与三酰甘油的合成8；（2）EST分析证明，DGAT1基因不仅在牛乳腺中表达，而且在牛脂肪组织中表达20；（3）放射杂交定位法将DGAT基因定位于牛14号染色体19CM处，与CSSM66紧密连锁21,22，而影响牛肌内脂肪含量的QTL区间内正好存在该基因（4）猪DGAT1基因定位于SSC4P15，在这一区域内存在可能影响猪生长速度、肌内脂肪含量和脂肪酸组成的QTL2325。在NCBI中已有
28、猪DGAT1基因CDNA及DNA全长和遗传位置，但其物理位置如何还需进一步确定，猪DGAT2基因的研究仍是空白。迄今为止，国内外尚未开展鸡、鸭、鹅等禽类DGAT相关基因的研究。研究发现，拟南芥TAG1基因插入突变体AS11中，种子DGAT1活性降低，同时三酰甘油含量降低；脂肪酸组成发生变化，其中花生酸201、油酸181含量降低，而亚麻酸183作为三酰甘油的主要脂肪酸大量积累，亚油酸变化不大；种子发育迟缓，而且平均重量降低26,27。通过构建野生型ATDGAT1基因CDNA单拷贝表达载体对AS11进行基因互补研究，发现能够弥补突变体的缺陷，表型与野生型相似27。而对ATDGAT1基因在野生型拟南
29、芥中过量表达的研究发现，DGAT1转录水平和活性明显提高，油脂积累增加1070，种子平均重量增加26。目前提高种子中三酰甘油积累的水平，最后一步反应是分子操作的主要靶标12。4主要实验内容本实验室已利用尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行了筛选并跟踪了其中3株微藻的中性脂积累过程。对微藻中性脂合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶（ACCASE、ACCASE）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）进行了研究，包括3株硅藻ACCASE、ACCASE和DGAT基因的克隆和序列分析；假微型海链藻（THALASSIOSIRAPSEUDONANA）ACCASE、ACCASE和DGAT基因的实时荧光定量RTPC
30、R。研究结果显示中性脂的积累与3种关键酶的表达水平有关，其中DGAT表达水平的差异大于ACCASE和ACCASE，表明脂类的积累可能与DGAT的表达更加相关。随后又采用3RACE和5RACE的方法得到假微型海链藻DGAT基因的CDNA全长序列，经BLAST后证明为DGAT基因。为进一步验证其功能，我们拟构建含DGAT基因的异源重组质粒，以用于在拟南芥中的表达分析。主要采用INFUSION基因克隆法构建含DGAT基因的重组质粒和含GFP荧光蛋白的DGAT重组质粒，将这两种重组质粒导入根癌农杆菌中去侵染野生型拟南芥，从而观察野生型拟南芥三酰甘油的合成量变化以及DGAT基因在拟南芥中的表达部位。参考
31、文献1BROWNC,KNIGHTSBAHYDROCARBONCONTENTANDITSRELATIONSHIPTOPHYSIOLOGICALSTATEINTHEGREENALGABOTRYOCOCCUSBRAUNIIPHYTOCHEMISTRY,1969,835435472LARGEAUC,CASADEVALLE,BERKALIFFCSITESOFACCUMULATIONANDCOMPOSITIONOFHYDROCARBONSINBOTRYOCOCCUSBRAUNIIPHYTOCHEMISTRY,1980,196104310513缪小玲，吴庆余微藻油脂制备生物柴油的研究太阳能学报,2007,2
32、822192224张薇，吴虹，宗敏华蛋白核小球藻发酵产油脂的研究微生物学通报,2008,3568558605LASSNERMW,LARDIZABALK,METZJGAJOJOBABETAKETOACYLCOASYNTHASECDNACOMPLEMENTSTHECANOLAFATTYACIDELONGATIONMUTATIONINTRANSGENICPLANTSJPLANTCELL,1996,82812926SAHAS，ENUGUTTIB，RAJAKUMARIS，RAJASEKHARANRCYTOSOLICTRIACYLGLYCEROLBIOSYNTHETICPATHWAYINOILSEEDSM
33、OLECULARCLONINGANDEXPRESSIONOFPEANUTCYTOSOLICDIACYLGLYCEROLACY1TRANSERASEJPLANTPHYSIOLOGY，2006，1414153315437LEHNERR，KUKSISABIOSYNTHESISOFTRIACY1G1YCEROLSJPROGRESSINLIPIDRESEARCH，1996，3521692018CASESS，SMITHSJ，ZHENGYWIDENTIFICATIONOFAGENEENCODINGANACYLCOADIACYLGLYCEROLACY1TRANSFERASE，AKEYENZYMEINTRIAC
34、YLGLYCEROLSYNTHESISJPROCNATLACADSCI，1998，952213018130239HOBBSDH，LUC，HILLSMJCLONINGOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMARABIDOPSISTHALIANAANDITSFUNCTIONALEXPRESSIONJFEBSLETT，1999，452314514910ROUTABOUIJM，BENNINGC，BECHTOLDN，CABOCHEM，LEPINIECLTHETAG1LOCUSOFARABIDOPSISENCODESFORADIACYLGLYCERO
35、LACYLTRANSFERASEJPLANTPHYSIOLBIOCHEM，1999，371183184011ZOUJ，WEIYD，JAKOC，KUMARA，SEIVARAJG，TAYLORDCTHEARABIDOPSISTHALIANATAG1MUTANTHASAMUTATIONINADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEGENEJPLANTJOURNAL，1999，19664565312LUNGSC，WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPI
36、DS，2006，41121073108813BOUVIERP，BENVENISTEP，OELKERSP，STURLEYSL，SCHAIIERHEXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEURJBIOCHEM，2000，2671859614SANDAGERL，GUSTSVSSONMH，STEHIU，DAHIQVISTA，WIBERGE，BANASA，LENMANM，RONNEH，STYMNESSTORAGELIPIDSYNTHESISISNONESSENTIALINYEA
37、STJJBIO1CHEM，2002，27786478648215WAKIMOTOK,CHIBAH,MICHIBATAH,SEISHIMAM,KAWASAKIS,OKUBOK,MITSUIH,TORIIH,IMAIYANOVELDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGAT2ISDECREASEDINHUMANPSORIATICSKINANDINCREASEDINDIABETICMICEBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2003,310229630216CHENHC,FARESERVINHIBITIONOFTRIGLYCERIDESYNTHESISASATREA
38、TMENTSTRATEGYFOROBESITYLESSONSFROMDGAT1DEFICIENTMICEARTERIOSCLERTHROMBVASCBIOL,2005,25348248617TURKISHAR,HENNEBERRYAL,CROMLEYD,PADAMSEEM,OELKERSP,BAZZIH,CHRISTIANOAM,BILLHEIMERJT,STURLEYSLIDENTIFICATIONOFTWONOVELHUMANACYLCOAWAXALCOHOLACYLTRANSFERASESMEMBERSOFTHEDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2DGAT2GEN
39、ESUPERFAMILYJBIOLCHEM,2005,28015147551476418WINTERA,VANEM,BININDAEMONDSOR,HABERMANNFA,FRIESRGENOMICORGANIZATIONOFTHEDGAT2/MOGATGENEFAMILYINCATTLEBOSTAURUSANDOTHERMAMMALSCYTOGENETGENOMERES,2003,10214424719STONESJ,LEVINMC,FARESERVMEMBRANETOPOLOGYANDIDENTIFICATIONOFKEYFUNCTIONALAMINOACIDRESIDUESOFMURIN
40、EACYLCOADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2JBIOLCHEM,2006,28152402734028220FRIESR,WINTERAMETHODOFTESTINGAMAMMALFORITSPREDISPOSITIONFORFATCONTENTOFMILKAND/ORITSPREDISPOSITIONFORMEATMARBLINGPATENT,INTERNATIONALAPPLICATIONNUMBERPCT/EP02/07520,2002,WORLDINTERNATIONALPROPERTYORGANIZATION21WOMACKJE,JOHNSONJS,O
41、WENSEK,REXROADCE,SCHLAPFERJ,YANGYP,AWHOLEGENOMERADIATIONHYBRIDPANELFORBOVINEGENOMEMAPPINGMAMMALIANGENOME,1997,885485622BANDMR,LARSONJH,REBEIZM,GREENCA,HEYENDW,DONOVANJ,WINDISHR,STEININGC,MAHYUDDINP,WOMACKJE,LEWINHAANORDEREDCOMPARATIVEMAPOFTHECATTLEANDHUMANGENOMESGENOMERESEARCH,2000,101359136823PEREZ
42、ENCISOM,CLOPA,NOGUERAJL,OVILOC,COLLA,FOLCHJM,BABOTD,ESTANYJ,OLIVERMA,DIAZI,SANCHEZAAQTLONPIGCHROMOSOME4AFFECTSFATTYACIDMETABOLISMEVIDENCEFROMANIBERIANBYLANDRACEINTERCROSSJANIMSCI,2000,78102525253124DEKONINGDJ,JANSSLL,RATTINKAP,VANOERSPA,DEVRIESBJ,GROENENMA,VANDERPOELJJ,DEGROOTPN,BRASCAMPEW,VANARENND
43、ONKJADETECTIONOFQUANTITATIVETRAITLOCIFORBACKFATTHICKNESSANDINTRAMUSCULARFATCONTENTINPIGSSUSSCROFAGENETICS,1999,15241679169025PASZEKAA,WILKIEPJ,FLICKINGERGH,ROHRERGA,ALEXANDERLJ,BEATTIECW,SCHOOKLBINTERVALMAPPINGOFGROWTHINDIVERGENTSWINECROSSMAMMGENOME,1999,10211712226JAKOC，KUMARA，WEIYD，ZOUJ，BARTONDL，G
44、IBLINEM，COVELLOPS，TAYLORDCSEEDSPECIFICOVEREXPRESSIONOFANARABIDOPSISCDNAENCODINGADIACYLGLYCEROLACYTRANSFERASEENHANCESSEEDOILCONTENTANDSEEDWEIGHTJPLANTPHYSIOLOGY，2001，126286187427KATAVICV，REEDDW，TAYLORDC，CIBLINEM，BARTONDL，JIATAOZ，MACKENZIESL，COVELLOPS，KUNSTLALTERATIONOFSEEDFATTYACIDCOMPOSITIONBYANETHY
45、LMETHANESULFONATEINDUCEDMUTATIONINARABIDOMISTHALIANAAFFECTINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEACTIVITYJPLANTPHYSIOLOGY，1995，1081399409本科毕业设计（20_届）假微型海链藻DGAT基因的重组质粒构建目录摘要引言11绪论111生物柴油的研究现状112藻类的特点213二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的研究现状2131二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的特点2132DGAT基因对肌内脂肪含量的影响2133拟南芥中DGAT活性变化32实验材料321DGAT片段322菌株323质粒3231表
46、达质粒3232对照质粒424引物425药品和常用药剂4251酶和生化试剂4252抗生素4253其他试剂4254培养基的配制53实验方法531质粒抽提（试剂盒）532电泳检测633质粒双酶切634DNA片段回收（试剂盒）735目的基因的获取7351PCR扩增目的基因7352割胶回收目的基因（试剂盒）836大肠杆菌DH5感受态的制备837连接与转化9371连接（采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒）9372转化9373PCR检测重组质粒94结果941目的基因PCR扩增1042电泳检测割胶回收图1043PCR检测重组质粒1044测序结果115小结11参考文献13附录15I摘要在高产油
47、微藻假微型海链藻中，二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油合成途径的关键酶。本研究试验采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒进行重组质粒的构建，从而解决PCAMBIA1300表达质粒的多克隆位点在DGAT基因序列的酶切位点上都存在的问题。用XBA和KPN限制性内切酶对PCAMBIA1300质粒进行双酶切得到线性质粒。根据此试剂盒的引物设计原理，利用线性表达质粒的序列和已知DGAT基因序列设计引物，以用于进行DGAT基因的PCR扩增，得到目的片段。使用此试剂盒特有的INFUSION连接酶连接目的片段和表达质粒，该酶不受酶切位点的限制可高效连接目的片段和表达质粒，从而构建含假微型海
48、链藻DGAT基因的重组质粒。该质粒适用于研究拟南芥三酰甘油含量的变化及该基因在拟南芥中的表达定位。关键词假微型海链藻；尼罗红；乙酰辅酶A羧化酶；二酰甘油酰基转移酶ABSTRACTTHALASSIOSIRAPSEUDONANAISTHEOLEAGINOUSALGA,ANDITSDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGATISTHEKEYENZYMEINSYNTHESISPATHWAYOFTRIGLYCERIDETHEEXPERIMENTCONSTRUCTSRECOMBINANTPLASMIDUSINGINFUSIONPCRCLONINGKIT,INORDERTOSOLVET
49、HEPROBLEMOFTHEMULTIPLECLONINGSITESOFPCAMBIA1300ARETHESAMETOTHERESTRICTIONSITESOFDGATTHELINEARPLASMIDOBTAINEDBYDOUBLEENZYMECLEAVAGEOFPCAMBIA1300PLASMIDWITHXBAANDKPNBASEDONTHEPRINCIPLEOFPRIMERDESIGNINGINTHEKIT,THEPRIMERISDESIGNEDWITHTHESEQUENCEOFLINEARPLASMIDANDTHESEQUENCEOFDGATGENETOOBTAINTHEFRAGMENTTARGETDNAFRAGMENTANDEXPRESSIONPLASMIDISCONNECTEDBYUNIQUEINFUSIONLIGASEOFTHEKITTHEENZYMECANCONNECTTHEDNAFRAGMENTANDEXPRESSIONPLASMIDEFFICIENTLYWITHOUTTHERESTRICTIONSOF
