1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程硒酸化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究一、选题的背景与意义胞外多糖EXOPOLYSACCHARIDES,EPS是由细菌和微型藻类在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖。EPS常常以荚膜多糖和黏多糖两种形式存在。但对于微生物来说，主要是指不与细胞表面永久粘附的黏多糖。微生物EPS具有增稠和凝胶的特性，已被用作工业中的增稠剂、凝胶剂和稳定剂。但是，乳酸菌具有公认的安全性。其产生的EPS可以替代工业微生物多糖广泛用于食品配方中。而且，大量的研究证实乳酸菌产生EPS具有抗肿瘤活性、免疫激活作用、降低血清胆固醇和益生元作用等，对人类的健康有着重要的意义。硒元素是生命活动的必
2、需元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，这说明了硒与人体健康的直接关系。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。硒能作用于人体转化成硒酶，大量破坏血管壁损伤处集聚的胆固醇，使血管保持畅通，提高心脏中辅酶A的水平，使心肌所产生的能量提高，从而保护心脏；硒是构成谷胱
3、甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛B细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状；硒是一种可增强免疫系统和抑制细胞增殖的抗氧化微量元素，具有降低癌症危险的作用；硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX的组成成分，每摩尔的GSHPX中含4G原子硒，此酶的作用是催化还原性谷胱甘肽GSH与过氧化物的氧化还原反应，所以可发挥抗氧化作用，是重要的自由基清除剂。尽管硒在人体内的含量非常少，而且每日摄人量也极微，但却在人体的机能中发挥着极其重要的作用。硒在地壳中分布广泛但含量不均。据WHO公布的资料，全球有40多个国家属于低硒和缺硒地区。对中国1094个县市的土壤硒含量进行了测
4、定，结果显示中国是个缺硒国家,全国有72的人口存在不同程度的硒摄入不足。硒只占人体重量的万分之一以下，不能在体内合成，必须从食物中摄取，而且食物中的有机硒才容易被人体吸收。有机硒主要是硒蛋白和硒多糖，本文讲述的是硒多糖。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1硒化乳酸菌胞外多糖基本理化性质确定。2测定多糖的抗氧化能力确定最适抗氧化浓度。3测定硒多糖的抗氧化能力并与多糖的抗氧化能力做比较，确定硒多糖的抗氧化能力。三、研究的方法与技术路线工艺路线乳酸菌胞外多糖制取抗氧化能力测定比较二者的抗氧化能力硒酸化乳酸菌胞外多糖抗氧化能力测定1乳酸菌胞外粗多糖制取采用BLX培养基培养乳酸菌，用冷冻干燥的方法制取
5、乳酸菌胞外粗多糖2抗氧化能力测定采用邻苯三酚自氧化法，脱氧核糖氧化法等方法3比较二者的抗氧化能力确定乳酸菌胞外多糖的最适抗氧化浓度，再与硒酸化后的多糖的抗氧化能力进行比较四、研究的总体安排与进度201010820101230查阅资料，整理设计实验步骤，并按照步骤进行实验。完成开题报告、文献综述、开题论证20111102011220完成实验，外文翻译2篇20112212011510整理数据、书写论文，完成答辩五、主要参考文献1胡群宝,郭宝江螺旋藻硒多糖对小鼠免疫功能的影响J中国海洋药物杂志,2001,51820,292关玉梅硒与缺硒对机体的影响J微量元素与健康研究,2002,184833邹宇,于
6、俊林,徐晶,等硒及微生物富硒研究进展J食品研究与开发,2006,12791711744王能才,等硒微量元素临床进展J医学文选,2004,23178795邹宇,于俊林,徐晶,等硒及微生物富硒研究进展J食品研究与开发,2006,12791711746史丽英,罗世炜微量元素硒的研究进展J襄樊职业技术学院学报,2005,41108一L1O7WHANGERPDSELENIUMINTHETREATMENTOFHEAVYMETALPOISONINGANDCHEMICALCARCINOGENESISJJTRACEELEMELEETROLYTESHEALTHDIS,1992,642092118崔乔,尚德静,邹霞
7、硒多糖的研究进展J中国生化药物杂志,2003,2431551579YANGMING,WANGKUI,GAOLINEXPLORATIONFORANATURALSELENIUMSUPPLEMENTCHARACTERIZATIONANDBIOACTIVITIESOFSECONTAININGPOLYSACCHARIDEFROMGARLICJJCHIMPHARMSCI,1992,11283210吴应亮,蔡宗源,何康明,等富硒植物中硒化合物的提取和分析J暨南大学学报,1994,153707311汪兴平,莫开菊,周大黄精含硒多糖的分离提取及含硒量分析技术研究J工艺研究食品科学,2004,2510119122
8、12于志,王萌灵芝硒多糖的研究进展与前景J安徽农学通报,2010,165717313温磊,尚德静,王伟灵芝硒多糖的制备及其分离纯化J中国食用菌,2005,24,6444614陈海生,梁荣能,徐一新野生云芝中水溶性多糖的分离鉴定J解放军药学学报,2002,16515王敏,朱劲华,马宇翔含硒紫球藻胞外多糖的制备及对体内外肿瘤细胞生长的影响J海洋科学,2006,30L232716陈国静,彭佳明,潘丽元,等香菇硒多糖抗肿瘤作用的研J中国误诊学杂志,2006,8,6152893289417徐春兰,钦传光,尚晓娅ENTEROBACTERCLOACAEZ0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化活性J化学研究,201
9、0,3,2122010646818许峰,张瞳,周波食用蕈菌硒多糖研究进展J生物技术,2006,2,161868819唐家骏硒化角叉菜胶的制备及其理化性质和生化活性的研究J生物化学与生物物理学报,1988,20325926420龚晓钟硒化黃芪多糖与硒化葡萄糖的研究硒化条件选择J深圳大学学报理工版,1997,144687521蒋京,廖宝N含硒壳聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性J广东微量元素科学,2000,75141722方积年多糖研究的现状J药学学报,1986,211294495023和朝军,李景原,秦广雍,等灵芝硒多糖的研究进J展河南农业科学,2006,391124徐辉碧,黄开勋硒蛋白与硒多糖
10、J科学,1997,495222525黄峙,郑文杰,郭宝江等含硒生物大分子化合物研究进展J海南大学学报自然科学版,2001,19216917526陈春英,高秋华,涂欢,等箬叶硒多糖提取液生物活性的初步研究J微量元素与健康研究,1994,114333427高林,尚德静,崔乔灵芝硒多糖SEGLP1抑制小鼠肝腹水癌作用的研究J食用菌学报,2001,3343828邓守恒,孙各琴,朱名安,等硒化壳聚糖对NB4细胞作用的实验研究J广东微量元素科学,2006,131232629门晓媛,王一飞,郑文杰,等纳米硒化裙带菜多糖的制备及其体外抗CVB3病毒作用研究J中国卫生检验杂志,2005,151011531I55
11、30魏战勇,崔保安,黄克和,等硒对猪细小病毒体外增殖抑制作用的研究J中国病毒学2005年12月第20卷第6期61361731方敏甲壳低聚糖硒的合成及其干预性糖尿病鼠模型形成的研究D南华大学,200532张敖珍,刘雯,江明华硒化卡拉胶对小鼠的降血糖作用J上海医科大学学报,1993,205385387毕业论文文献综述食品科学与工程硒多糖的研究状况摘要硒在有机体的生命活动过程中具有重要的生物学作用，其中有些作用是与它的抗氧化作用密切相关的。硒多糖是硒的一种有机形式，可以作为一种安全的补硒剂。本文综述了硒多糖国内外的一些研究近况以及硒多糖的结构性质和生理生化作用，硒多糖同硒一样具有体外抗氧化作用，抗肿
12、瘤、抗病毒作用，以及降血糖、血脂等作用，而其活性比后者要高，并且利于机体吸收、安全，是一种理想的补硒剂。关键词硒多糖；结构；生理活性0前言硒元素是生命活动的必需元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，这说明了硒与人体健康的直接关系。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著1因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得
13、到优化。硒能作用于人体转化成硒酶，大量破坏血管壁损伤处集聚的胆固醇，使血管保持畅通，提高心脏中辅酶A的水平，使心肌所产生的能量提高，从而保护心脏2；硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛B细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状3；硒是一种可增强免疫系统和抑制细胞增殖的抗氧化微量元素，具有降低癌症危险的作用4；硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX的组成成分，每摩尔的GSHPX中含4G原子硒，此酶的作用是催化还原性谷胱甘肽GSH与过氧化物的氧化还原反应，所以可发挥抗氧化作用，是重要的自由基清除剂5。多糖本身也具有很多抗氧化活性6。从乳酸乳球菌乳酸亚种
14、12的培养基中获得了一种新型的胞外多糖（EPS）,该胞外多糖表现出强烈的抗氧化作用，展示了清除超氧阴离子和羟自由基的能力，和显著降低丙二醛（MDA）水平的能力。尽管硒在人体内的含量非常少，而且每日摄人量也极微，但却在人体的机能中发挥着极其重要的作用。硒在地壳中分布广泛但含量不均。据WHO公布的资料，全球有40多个国家属于低硒和缺硒地区。对中国1094个县市的土壤硒含量进行了测定，结果显示中国是个缺硒国家,全国有72的人口存在不同程度的硒摄入不足7。硒只占人体重量的万分之一以下，不能在体内合成，必须从食物中摄取，而且食物中的有机硒才容易被人体吸收8。有机硒主要是硒蛋白和硒多糖，本文讲述的是硒多糖
15、。1硒多糖的来源天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，但含量较低，即使在高硒地区的富硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。因此，研究者们试图通过一些富硒手段如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等，使生物体中硒多糖的硒含量增加。此外，通过多糖硒化修饰或化学合成等化学方法也可以获得大量的硒多糖。11天然硒多糖目前成功获得的天然硒多糖有灵芝硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻硒多糖、箸叶硒多糖和大蒜硒多糖、黑木耳硒多糖等9。这些硒多糖主要是在富硒的环境下，植物或微生物通过特殊的代谢途径利用环境中的无机硒合成的天然有机硒。湖北恩施州是我国最大也是世界罕见的高硒区，区内含硒量比一般地区高出数十倍乃至数百倍，该地
16、区一些常见的多糖类植物大蒜、魔芋、板党、南瓜等的硒多糖含量明显高于其它地区的同种植物。1992年YANG等10从恩施地区的富硒大蒜中分离出一种硒多糖，通过高效液相色谱和纸色谱法测定为硒化的甘露聚糖。1994年吴应亮等11对恩施地区富硒植物黄芪和魔芋进行研究，提取精制出了硒多糖，测得其中的硒含量分别为106GG1和155GG1。2004年汪兴平等12从富硒黄精中提取的多糖中测得硒的含量为05973G/G。从天然灵芝中提取的灵芝硒多糖含量也很低13。可见植物自然富集硒多糖的硒含量仍然很低。12微生物富集硒多糖微生物富集法获取硒多糖，即在适宜的培养条件下将无机硒添加到真菌、藻类、细菌等的培养基中，通
17、过微生物的生长代谢，对硒进行富集和生物转化，从面获得硒多糖。目前，通过人工协迫富硒培养法成功获得的硒多糖不仅硒含量较高，而且种类繁多，例如真菌类的灵芝硒多糖、香菇硒多糖、木耳硒多糖、金针菇硒多糖等；藻类的螺旋藻硒多糖、绿色巴夫藻硒多糖等。2005年温磊等14以灵芝为载体，通过灵芝菌丝体的深层培养，将无机的亚硒酸钠加入培养基，通过生物转化作用，使无机硒转化为有机硒，并对富硒灵芝多糖进行了分离纯化15，从中筛选了对癌细胞有高抑制率的纯化硒多糖。王敏等16采用在培养液中添加亚硒酸来实现藻对无机硒的富集和转化，制备一种含硒的紫球藻PORPHYRIDIUMSP胞外多糖SEPSP可以延长荷瘤小鼠的生存时间
18、，陈国静等17将含硒化合物按设计比例重量加入香菇固体培养基中培育出富硒香菇,提取分离得硒多糖,并证明其具有比普通香菇多糖较高的抑制肿瘤生长的作用。徐春兰等18利用产多ENTEROBACTERCLOACAEZ0206ECLOACAEZ0206的深层发酵法制备了ECLOACAEZ0206细菌富硒多糖。富硒多糖SEPS的产量为928G/L，富硒量为2314MG/G；许峰等19以亚硒酸根的形式的硒，添加到食用蕈菌培养基中，通过蕈菌的生长代谢，对硒进行富集和生物转化而获得硒多糖。13人工合成硒多糖多糖含有多种基团，例如自由羟基、醛基或酮基，这些基团能够与其它化合物发生特定的反应，使多糖的硒化修饰或合成成
19、为可能。到目前为止，人工合成硒多糖主要有以下3种方式一是在温和条件下使用单体硒、亚硒酸或亚硒酸钠等对多糖进行硒化修饰；1988年唐家骏20首次用硒粉、浓硝酸与卡拉胶反应制备出硒化卡拉胶，硒化KAPPA价叉菜和LAMBDA角叉菜胶中硒含量分别达到2512G/G和1157G/G。经红外光谱、激光拉曼光谱测定表明，硒化产物仍保持硫酸酯多糖的基本构型，其中硒以不同形态存在，即角叉菜胶中部分硫被硒取代，形成硒酸酯，其末单元的3、6一内醚，D一半乳糖在C一1位开环形式CSEH结构。二是利用化学性质活泼、具有酰氯结构的SEOC1，作为硒化试剂21；三是将含硒的功能基团接枝到多糖分子上22。2硒多糖的结构性质
20、通过对硒多糖的分析发现，硒多糖的单糖组成一般分为两类单一聚糖；由GAL（半乳糖）、GLU（葡萄糖）、RHA（鼠李糖）、XYL（木糖）、FUC（岩藻糖）和MAN（甘露糖）等多种单糖中的几种组成的杂聚糖。各种单糖一般以D构型存在，它们在硒多糖分子中的比例也不尽相同。多数硒多糖为构型，构型的硒多糖也有发现。硒多糖的主链一般是由13糖苷键键合而成，支链形式多样，如以D葡萄糖残基、D葡糖醛酸残基、（16D葡萄糖残基、（12D木糖残基等作为支链。其它键合方式，如12糖苷键、14糖苷键较为少见。硒作为硒多糖的特征性部分，在硒多糖中的存在形式可能有SEH和R1SEOOR2两种23。实验表明，一种灵芝硒多糖是以
21、糖苷键键合成的吡喃多糖，由GLU、MAN、XYL、GAL和RHA组成24；大蒜硒多糖的平均分子量为15000，其水解产物经HLPC和纸色谱分析，证明大蒜硒多糖含硒量约为12G/G,其中硒可能以硒酸酯形式存在25。箬叶硒多糖是一种硒酸酯多糖26。螺旋藻硒多糖分子量为12590，由D甘露糖、D葡萄糖、D半乳糖和D葡糖醛酸组成27。3硒多糖的生理生化作用多糖具有多种生理活性,是一种广谱的免疫促进剂,具有防癌抗癌、调节免疫功能、延缓衰老、抗感染、抗辐射等生理作用23。活性氧自由基对生物分子起损害作用,甚至造成DNA链断裂或变异,硒则对因脂质过氧化产生的自由基具有清除作用。硒多糖兼有多糖和硒两方面的功能
22、,因此表现出更有效的生理活性,在医药研制和疾病治疗等方面有着广泛的应用前景。31抗氧化作用谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX能分解过氧化物,减少自由基的产生,保护脏器免受自由基的侵害,在疾病防治过程中具有重要的作用。硒是谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心,因此硒的新陈代谢对动物体内的抗氧化能力具有重要的影响,硒多糖作为一种硒源物质不仅能够有效地补给硒的代谢,而且本身具有抗氧化作用,能够显著提高动物的抗氧化能力。陈春英等27用箬叶多糖与硒化合物反应得到箬叶硒多糖,并发现箬叶硒多糖能有效地提高血液中的硒含量和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,显著降低脂质过氧化产物丙二醛的含量,增强红细胞抗H2O2氧化损伤的能力,具有
23、明显的免疫增强效应。徐春兰等19利用产多糖菌ENTEROBACTERCLOACAEZ0206ECLOACAEZ0206的深层发酵法制备了ECLOACAEZ0206细菌富硒多糖。ECLOACAEZ0206富硒多糖对DPPH自由基和羟自由基具有较好的清除作用，在浓度为5G/L时对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为8035和8426，并具有较强的还原能力。32抗肿瘤作用硒多糖不仅能够抑制肿瘤的生长,而且能够直接杀伤或杀死癌细胞,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖。高林等28发现灵芝硒多糖比灵芝多糖有更显著的抑制肿瘤生长的活性,而且这种抑瘤活性与硒多糖的分子组成以及分子结构密切相关。胡群宝等1在研究
24、螺旋藻硒多糖的药理作用时也发现了类似现象,并且这种抑瘤作用与硒多糖对动物免疫功能的影响没有关系。邓守恒等29研究硒化壳聚糖对NB4急性早幼粒白血病肿瘤细胞株生长的影响发现,硒化壳聚糖可有效地抑制NB4细胞生长,并呈量效和时效关系,细胞明显出现核固缩、碎裂等凋亡形态的改变,显示硒化壳聚糖具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。33抗病毒作用门晓媛等30制备出了纳米硒化裙带菜多糖并观察其体外抗柯萨奇CVB3病毒肠道病毒属的作用。结果表明,硒多糖具有良好的体外抗CVB3病毒的活性,在安全性和有效性上均超过常用的抗病毒药物病毒唑RIBAVIRIN。魏战勇等31通过研究发现海藻硒多糖对猪细小病毒体外复制有抑作用。但
25、其效果不如硒蛋氨酸和亚硒酸钠显著，可能是由于不同硒化合物的含硒形式和结构不同而造成的。对于海藻硒多糖抑制病毒所需的有效浓度，尚有待于进一步的研究。34降血糖、降血脂作用糖尿病是一种常见的糖、脂代谢紊乱的临床综合症,主要是由于胰岛素生物活性的降低或者效应不足引起的。硒多糖通过保护胰岛细胞,改善胰岛素的敏感性,从而对糖尿病起到干预作用。方敏32在合成硒化甲壳低聚糖的基础上,研究其对糖尿病鼠模型形成的干预作用及作用机制。结果发现,硒化甲壳低聚糖能够显著抑制模型动物血糖和胆固醇的提高,并明显提高GSH2PX的活性,表明硒化甲壳低聚糖能够改善动物的糖、脂代谢。张敖珍等33发现硒化卡拉胶可使正常小鼠以及四
26、氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖降低,而且对正常小鼠注射肾上腺素所引起的高血糖也有降低作用。硒多糖良好的降糖作用已经引起糖尿病专家及广大学者的注意,在开发糖尿病药物或保健食品方面显现出诱人的前景。4前景与展望前文中许多研究表明硒对人体的健康是缺一不可的，而由于硒的分布不规律，使很多人存在缺硒而致病的危险，特别在我们中国这个人口大国，竟然有72的人口存在硒摄入不足的问题，硒多糖作为硒的一种有机形式，不仅活性比无机硒要高，而且其在机体中的吸收好，不会像无机硒一样在体内造成蓄积性制毒，因此硒多糖是一种理想的补硒剂，有很广阔的开发前景。参考文献1胡群宝,郭宝江螺旋藻硒多糖对小鼠免疫功能的影响J中国海洋药物杂志,
27、2001,51820,292关玉梅硒与缺硒对机体的影响J微量元素与健康研究,2002,184833邹宇,于俊林,徐晶,等硒及微生物富硒研究进展J食品研究与开发,2006,12791711744王能才,等硒微量元素临床进展J医学文选,2004,23178795邹宇,于俊林,徐晶,等硒及微生物富硒研究进展J食品研究与开发,2006,12791711746DAODONGPAN,XIUMINGMEIANTIOXIDANTACTIVITYOFANEXOPOLYSACCHARIDEPURIFIEDFROMLACTOCOCCUSLACTISSUBSPLACTIS12JCARBOHYDRATEPOLYMERS
28、,8020109089147史丽英,罗世炜微量元素硒的研究进展J襄樊职业技术学院学报,2005,41108一L1O8WHANGERPDSELENIUMINTHETREATMENTOFHEAVYMETALPOISONINGANDCHEMICALCARCINOGENESISJJTRACEELEMELEETROLYTESHEALTHDIS,1992,642092119崔乔,尚德静,邹霞硒多糖的研究进展J中国生化药物杂志,2003,24315515710YANGMING,WANGKUI,GAOLINEXPLORATIONFORANATURALSELENIUMSUPPLEMENTCHARACTERIZA
29、TIONANDBIOACTIVITIESOFSECONTAININGPOLYSACCHARIDEFROMGARLICJJCHIMPHARMSCI,1992,11283211吴应亮,蔡宗源,何康明,等富硒植物中硒化合物的提取和分析J暨南大学学报,1994,153707312汪兴平,莫开菊,周大黄精含硒多糖的分离提取及含硒量分析技术研究J工艺研究食品科学,2004,251011912213于志,王萌灵芝硒多糖的研究进展与前景J安徽农学通报,2010,165717314温磊,尚德静,王伟灵芝硒多糖的制备及其分离纯化J中国食用菌,2005,24,6444615陈海生,梁荣能,徐一新野生云芝中水溶性多糖
30、的分离鉴定J解放军药学学报,2002,16516王敏,朱劲华,马宇翔含硒紫球藻胞外多糖的制备及对体内外肿瘤细胞生长的影响J海洋科学,2006,30L232717陈国静,彭佳明,潘丽元,等香菇硒多糖抗肿瘤作用的研J中国误诊学杂志,2006,8,6152893289418徐春兰,钦传光,尚晓娅ENTEROBACTERCLOACAEZ0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化活性J化学研究,2010,3,2122010646819许峰,张瞳,周波食用蕈菌硒多糖研究进展J生物技术,2006,2,161868820唐家骏硒化角叉菜胶的制备及其理化性质和生化活性的研究J生物化学与生物物理学报,1988,203259
31、26421龚晓钟硒化黃芪多糖与硒化葡萄糖的研究硒化条件选择J深圳大学学报理工版,1997,144687522蒋京,廖宝N含硒壳聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性J广东微量元素科学,2000,75141723方积年多糖研究的现状J药学学报,1986,211294495024和朝军,李景原,秦广雍,等灵芝硒多糖的研究进展J河南农业科学,2006,391125徐辉碧,黄开勋硒蛋白与硒多糖J科学,1997,495222526黄峙,郑文杰,郭宝江等含硒生物大分子化合物研究进展J海南大学学报自然科学版,2001,19216917527陈春英,高秋华,涂欢,等箬叶硒多糖提取液生物活性的初步研究J微量元素与健
32、康研究,1994,114333428高林,尚德静,崔乔灵芝硒多糖SEGLP1抑制小鼠肝腹水癌作用的研究J食用菌学报,2001,3343829邓守恒,孙各琴,朱名安,等硒化壳聚糖对NB4细胞作用的实验研究J广东微量元素科学,2006,131232630门晓媛,王一飞,郑文杰,等纳米硒化裙带菜多糖的制备及其体外抗CVB3病毒作用研究J中国卫生检验杂志,2005,15101153115531魏战勇,崔保安,黄克和,等硒对猪细小病毒体外增殖抑制作用的研究J中国病毒学,2005,20661361732方敏甲壳低聚糖硒的合成及其干预性糖尿病鼠模型形成的研究D南华大学,200533张敖珍,刘雯,江明华硒化卡
33、拉胶对小鼠的降血糖作用J上海医科大学学报,1993,205385387本科毕业设计（20_届）硒化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究目录0前言141材料与方法1511材料1512仪器与设备1513试剂1514理化性质的测定15141多糖的溶解性15142多糖的鉴别与分析16143乳酸菌胞外多糖多糖成分分析161431单糖标准溶液的配制161432水解多糖样品的制备171433展开系统及显色剂的配制171434点样171435展层171436显色171437RF值的测定方法1715体外抗氧化活性的测定17151对超氧阴离子自由基（O2）清除能力的测定17152羟自由基（OH）清除能力测定18153总抗
34、氧化能力测定182结果与分析1821硒化乳酸菌胞外多糖理化性质的测定18211硒化乳酸菌胞外多糖的溶解性测定18212硒化乳酸菌胞外多糖的鉴别与分析182121碘碘化钾反应182122MOLISH反应192123茚三酮反应19213硒化乳酸菌胞外多糖多糖成分分析1922硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对超氧自由基（O2）的清除作用192硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖对羟自由基（OH）清除作用2024硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖总抗氧化能力213结论22致谢错误未定义书签。参考文献23摘要本文对制备的硒化乳酸菌胞外多糖进行了理化性质及其抗氧化活性的研究。通过理化性质实验得出，它是一种溶于水，不溶于乙醇
35、，丙酮，氯仿等有机溶剂的不含淀粉多糖的多糖；通过硒化与未经硒化乳酸菌胞外多糖清除超氧自由基，羟自由基的能力以及他们的总抗氧化能力实验，得出结果，经硒化的乳酸菌胞外多糖在多糖浓度为8MG/ML时对超氧阴离子自由基清除率为6125，相比硒化前的多糖在同样浓度下对超氧阴离子自由基的清除率4174提高了1951；而在多糖浓度为8MG/ML时对羟自由基的清除率从54947提高到418，提高了1924；在多糖浓度为10MG/ML时，硒多糖的总抗氧化能力为97U/L，未经硒化的总抗氧化能力74U/L，提高了23U/L。关键词乳酸菌；硒多糖；抗氧化活性；理化性质ABSTRACTARESEARCHOFPHYSI
36、CALANDCHEMICALPROPERTIESANDANTIOXIDANTACTIVITYTOSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAINTHISPAPERTHEPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIESEXPERIMENTSSHOWEDTHATSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAISAPOLYSACCHARIDETHATSOLUBLEINWATERBUTINSOLUBLEINORGANICSOLVENTSLIKEETHANOL,ACETONE,CHLOROFORM,E
37、TC,ANDISNONSTARCHPOLYSACCHARIDESTHESCAVENGINGOFSUPEROXIDERADICALANDHYDROXYLRADICALANDTOTALANTIOXIDANTCAPACITYTOSELENIUMANDNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIAWASRESEARCHED,THERESULTSSHOWEDTHATTHESUPEROXIDEANIONRADICALSCAVENGINGRATEWAS6125INTHESELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTER
38、IACONCENTRATION8MG/ML,COMPAREDTOTHESCAVENGINGRATEOFNONSELENIUMEXOPOLYSACCHARIDESOFLACTICACIDBACTERIA4174INCREASED1951,WHILETHESCAVENGINGRATEOFHYDROXYLRADICALINCREASED1924FROM5494TO7418,WHENTHECONCENTRATIONOF10MG/MLINPOLYSACCHARIDE,THETOTALANTIOXIDANTCAPACITYOFPOLYSACCHARIDEINCREASED23U/LFROM74U/LTO9
39、7U/LKEYWORDSLACTICACIDBACTERIASELENIUMPOLYSACCHARIDEANTIOXIDANTACTIVITYPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIES0前言乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。从广泛意义上讲，这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系，具有抑菌消炎，
40、抗氧化、抗肿瘤，降低胆固醇，提高免疫力等功效1,2。胞外多糖EXOPOLYSACCHARIDESEPS是由细菌和微型藻类在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖。EPS常常以荚膜多糖和黏多糖两种形式存在，但对于微生物来说,主要是指不与细胞表面永久粘附的黏多糖3。多糖的提取工艺在国内外的研究已经有很多4。微生物EPS具有增稠和凝胶的特性，已被用作工业中的增稠剂、凝胶剂和稳定剂。但是，乳酸菌具有公认的安全性,其产生的EPS可以替代工业微生物多糖广泛用于食品配方中。而且，大量的研究证实乳酸菌产生的EPS具有抗肿瘤活性、免疫激活作用、降低血清胆固醇和益生元作用等，对人类的健康有着重要的意义5。因此，乳酸菌E
41、PS作为食品级生物添加剂应用于食品工业，甚至应用于医药和工业中的潜力很大，认识、改造和利用乳酸菌EPS对于提升食品的质量和增加食品的功能具有重要意义。近几十年来,由于微生物胞外多糖在产品结构、性能及生产方面所具有的特殊优势而得到大力研究和开发,微生物胞外多糖的开发已成为工业微生物研究的热点之一。由于乳酸菌是食品级工业生产菌,与其他菌相比安全性高,所以近年来对乳酸菌胞外多糖的研究逐渐增多。硒是动物和人体中一些抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶）和硒P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，研究证明具有提高动物免疫力作用，在国际上硒对于免疫力影响和癌症预防的研究是该领域的热点问题，因此，硒
42、可作为动物饲料微量添加剂，也在植物肥料中添加微量元素肥，提高农副产品含硒量。硒已被作为人体必需的微量元素，目前，中国营养学会推荐的成人摄入量为每日50250微克，而我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值，因此，中国是一个既有丰富硒资源，又存在大面积硒缺乏地区，这也是国际学者对中国感兴趣的原因。硒多糖是硒的一种有机存在形式，相对无机硒6而言有机硒7毒性低、副作用小，能够更好地发挥硒的生理活性8。有机硒主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白和硒核酸等，其中硒多糖不但具有无机硒的多种活性，还具有多糖的各种生理功能，并且硒多糖的活性普遍高于硒和多糖，也更利于被机体吸收利用9。天然硒多糖一般存在于植物或微生物中
43、，但含量较低，即使在高硒地区的富硒植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相对较低。因此，研究者们试图通过一些富硒手段如人工协迫富硒栽培、富硒酵母培养等，使生物体中硒多糖的硒含量增加。此外，通过多糖硒化修饰或化学合成等化学方法也可以获得大量的硒多糖10。已经有不少关于硒多糖的研究，如孙兰萍，张胜义，许晖对硒化壳聚糖的研究11，张威,王敏,朱劲华等对硒化紫球藻胞外多糖的研究12，温磊，尚德静，王伟对灵芝硒多糖的研究13。但是对微生物的硒化多糖的研究还不多见。硒化乳酸菌胞外多糖是实验室人工合成的微生物硒多糖，本次实验对制备得到的硒多糖进行初步的理化性质分析及抗氧化活性研究，通过比较硒化前后乳酸菌胞外多糖
44、的抗氧化活性，初步明确其抗氧化活性是否优于未经硒化的乳酸菌胞外多糖，为硒化乳酸菌胞外多糖的开发提供理论依据。1材料与方法11材料A乳酸菌胞外多糖由实验室制备所得B硒化乳酸菌胞外多糖将一定量的乳酸菌胞外多糖粉末放入三角瓶中，加入体积分数为05的硝酸水溶液10ML，加热搅拌使多糖全部溶解，再经水浴加热到相应的温度，加入相应量的NA2SEO3和BACL2，反应相应的时间后。冷却到室温，用NA2CO3调PH56，加入适量无水NA2SO3沉淀反应液中的氯化钡，用高速冷冻离心机下在5000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，再用无水乙醇沉淀4冰箱过夜，收集沉淀，透析24H，冷冻干燥后，即为硒多糖。
45、12仪器与设备湘仪H2500R离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司KDT23可见光分光光度计上海科登精密仪器有限公司湘仪H2050R离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司LDZX50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂DHG9108A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司PHS3C型酸度计上海盛磁仪器有限公司电子天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司硅胶板上海信谊仪器厂WFZUV4802H型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司DK8D型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司其他通风柜，电冰箱，移液枪，移液管，锥形瓶，试管，烧杯，电热恒温水浴锅等。13试剂总抗氧化能力（TAOC）测试盒（南京
46、建成生物工程研究所），乙酸乙酯（天津市博迪化工有限公司），吡啶（上海展云化工有限公司），苯胺（国药集团化学试剂有限公司），二苯胺（国药集团化学试剂有限公司），D木糖（上海晶纯试剂有限公司），D半乳糖（上海晶纯试剂有限公司），葡萄糖（上海展云化工有限公司），D果糖（ALADDINCHEMISTRYCOLTD），L鼠李糖（上海晶纯试剂有限公司），TRIS，邻苯三酚，浓HCL，邻二氮菲，磷酸盐，FESO4，H2O2，无水乙醇，丙酮，氯仿，NAOH，磷酸均为国产级分析纯14理化性质的测定141多糖的溶解性14多糖类物质由于其分子中含有大量的极性基团，因此对于水分子具有较大的亲和力；但是一般多糖的分子量
47、相当大，其疏水性也随之增大；因此分子量较小，分支程度低的多糖类在水中有一定的溶解度，加热情况下更溶液溶解；而分子量大，分支程度高的多糖类在水中溶解度低。多糖一般不溶于高浓度的有机溶剂。在25下将02G硒化乳酸菌胞外多糖分别溶于水，乙醇，丙酮，氯仿四种不同的溶剂中，24H后观察其溶解性。称取4份02G的硒化乳酸菌胞外多糖于事先准备好的10ML的小烧杯中，在烧杯壁上贴上标签，注明水，乙醇，丙酮，氯仿四种不同的溶剂，然后根据标签往烧杯中分别倒入四种高浓度溶剂，以倒入烧杯总量的2/3为宜。倒入后轻轻摇晃小烧杯，使多糖与溶剂充分接触，用保鲜膜封住杯口，在25放置24H。142多糖的鉴别与分析1518如果
48、多糖遇碘变蓝，说明多糖为淀粉多糖，因此可以用碘检测多糖。取LML浓度为1MGML的硒多糖溶液加入碘碘化钾溶液，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，淀粉溶液1MGM1作阳性对照。糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。取LML浓度为LMGML的硒多糖溶液，加入2滴MOLISH试剂，
49、摇匀，将试管倾斜，沿试管壁慢慢加入LML浓硫酸，竖直试管，观察浓硫酸和糖溶液交界面颜色变化。以蒸馏水作为阴性对照，淀粉溶液（1MGM1）作为阳性对照。茚三酮与氨基酸、肽类或蛋白质的自由氨基或其他氨基化合物所产生的一种可定量的显色反应。所呈现的颜色随反应的条件（酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等）不同而异。用于氨基酸和肽的层析及定量测定。取LML浓度为LMG/ML的硒多糖溶液，加入05ML的01茚三酮乙醇溶液，摇匀，沸水浴2MIN，冷却，观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照，05甘氨酸溶液作阳性对照。143乳酸菌胞外多糖多糖成分分析1921薄层色谱THINLAYERCHROMATOGRAPHY常用TLC表示，又称薄层层析，属于固液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至001G）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500MG的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。1431单糖标准溶液的配制分别称取葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、
