1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全重组铁蛋白的活性研究一、选题的背景与意义铁是人体生理代谢必需元素之一，也是不可缺少的营养元素。缺铁对儿童的智力、身体发育，免疫功能，消化吸收功能均有较大影响。缺铁性贫血是世界上最普遍的营养缺乏症，会损坏免疫系统，降低人的生理和心理机能，也会阻碍大脑认识能力的发育。据估计，全球约有30的人口受缺铁的痛苦。在以稻米等植物性食物为主食的发展中国家，缺铁的影响程度更大，有近半数的5岁以下儿童和超过一半的孕妇患有铁缺乏症。铁蛋白是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的铁储存蛋白，是动植物生长发育的储存铁的共同来源。当细胞内二价铁离子含量高时，铁蛋白通过它的亚铁氧化还原
2、中心，在氧气的帮助下，将其催化氧化生成无毒的三价铁储藏在它的内部，1分子铁蛋白最多可储存4500个三价铁，这个特点是铁蛋白与其它酶最大的不同之处；当细胞需要铁时，铁蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁离子从其内部释放出来，以供其它蛋白质合成利用，所以铁蛋白在细胞内具有去除二价铁离子的毒性以及调节铁代谢平衡的双重作用，同时它还参与细胞RNA代谢的调节。有研究认为该蛋白是解决动物和人类全球饮食缺铁的有效方法。纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器能够翻转的吻。研究表明其铁蛋白有较强的结合铁的能力，因此通过基因工
3、程技术导入铁结合蛋白基因来提高食品铁含量以改良其营养品质将具有十分重要的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、重组铁蛋白的获取（1）IPTG诱导重组蛋白的表达，SDSPAGE检测表达的情况；（2）大量表达蛋白并检测该蛋白为可溶性还是包涵体形式存在；（3）镍柱纯化蛋白得到实验用的蛋白；2、重组铁蛋白的活性研究（1）蛋白复性使蛋白恢复天然构象；（2）重组铁蛋白对铁的吸收能力；（3）重组铁蛋白亚铁氧化酶活性研究。拟解决的主要问题1、熟悉菌株的活化和IPTG诱导表达的过程与方法；2、掌握SDSPAGE法检测表达蛋白；3、检测快速表达蛋白的存在形式可溶性还是包涵体形式，若为包涵体形式，则
4、需复性；4、铁蛋白对铁吸收能力的检测方法；5、亚铁氧化酶活性检测方法。三、研究的方法与技术路线重组铁蛋白的原核表达SDSPAGE检测表达蛋白大量表达蛋白蛋白纯化（镍柱纯化）蛋白复性（使蛋白恢复天然构象）检测、计算分光光度计计测量蛋白溶液的吸光值活化菌株IPTG诱导表达四、总体安排与进度20101011查阅文献，了解实验总体步骤与方法；20101112完成重组铁蛋白的原核表达和蛋白检测，并大量表达蛋白；20101220101进行蛋白纯化和复性，计算得到结果；2010220104重组蛋白活性研究；2010520106完成论文和答辩。五、主要参考文献1STEVEND,AUSTFERRITINASAS
5、OURCEOFIRONANDPROTECTIONFROMIRONINDUCEDTOXICITIESTOXICOLOGYLETTERS,VOLUMES8283,DECEMBER1995,9419442袁小红，杨星勇，罗小英等豌豆铁蛋白的纯化及其抗血清的制备J中国生物化学与分子生物学学报，200256146183王群力，孔波，黄河清铁蛋白纳米蛋白壳结构与功能研究新进展J化学进展，2004，1645165194朱王飞，钱胜峰铁与人体健康J膳食指南，2004347495杜莉利，李太武，等可口革囊星虫PHASCOLOMAESCULENTA铁结合蛋白基因的研究J海洋与湖沼，2008，3932522556白
6、霞，周金林，等微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析J畜牧兽医学报，2005，36166697王永斌，郭长虹，郭东林大豆铁蛋白CDNA的克隆及植物表达载体的构建大豆科学，2006，2544544578GOTOF，YOSHIHARAT，SAIKIHIRONACCUMULATIONANDENHANCEDGROWTHINTRANSGENICLETTUCEPLANTSEXPRESSINGTHEIRONBINDINGPROTEINFERRITINJTHEORETICALANDAPPLIEDGENETICS，2000，1006586649王敏，易新元，曾宪芳，等日本血吸虫铁蛋白基因的克隆、表达及其免疫诊断的研
7、究J中国免疫学杂志，2004，201069669910JYOTIVELAYUDHAN，MARGARETCASTOR，ANTHONYRICHHARDSON，ETALTHEROLEOFFERRITINSINTHEPHYSIOLOGYOFSALMONELLAENTERICSVTYPHIMURIUMAUNIQUEROLEFORFERRITINBINIRONSULPHURCLUSTERREPAIRANDVIRULENCEJMOLECULARMICROBIOLOGY，2007，6351495150711刘巧泉，姚泉洪，王红梅，等转基因水稻胚乳中表达铁结合蛋白提高稻米铁含量遗传学报，2004,3151852
8、412董阔，徐杰，等大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析J中国农业科学，2006，39112362236713徐晓辉，郭泽建，程志强，等铁蛋白基因的水稻转化及其功能初步分析J浙江大学学报，2003,291495414程志强，郭泽建，徐晓辉，等转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性J中国水稻科学，2003,171858815王彩芬，付永彩，安永平，等转大豆铁结合蛋白基因水稻的初步研究J西北农业学报，2008,176848716丁聃，王娅娜，等细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组、表达、纯化及免疫学特性鉴定J宁夏医科大学学报，2009，310214614817曹阳，高华颖，于黎，等人乳铁蛋白
9、基因克隆及细胞表达研究J遗传，2002，24191418张蓉，刁其玉乳铁蛋白在犊牛生产中的应用及其生物信息学分析J乳业科学与技术，2007，1394219张述，王革非等重组人乳铁蛋白基因克隆及表达J中国生物制品学杂志，2005，180211711920高海燕，郭荣富乳铁蛋白肽的研究现状及进展J中国饲料添加剂，2007,6107151921单体中，汪以真乳铁蛋白的生物学功能及其基因工程研究J中国饲料，200510101222康萍，印遇龙乳铁蛋白的抑菌机制J中国饲料，200615293123邢芳芳，等乳铁蛋白肽的生物学活性及应用前景J中国饲料添加剂，2006101524黄海青，汪以真乳铁蛋白肽的研
10、究进展J中国兽药杂志，2004，386151825唐传核，曹劲松，彭志英乳铁蛋白最新研究进展活性多肽及生理功能（）中国乳品工业，2000，285444726吕慈仙，李太武，等浙江沿海最新发现一种枝吻类纽虫J水产科学，20071265265427王孟前，李太武，等浙江沿海一新纽虫的18RDNA序列研究J科技通报，2010，2616771毕业论文文献综述食品质量与安全铁蛋白的研究现状与展望摘要本文概括了一些关于铁蛋白的研究现状，发现铁蛋白在生物体内具有去除二价铁的毒性以及调节机体铁代谢平衡的活性。在以往对铁蛋白研究取得的进展上对该领域的研究前景做了一些展望。关键词铁蛋白；活性；研究现状；展望铁蛋白
11、FERRITIN于1937年由LAUFBERGE从脊椎动物马的脾脏中纯化分离出来1，具有耐稀酸PH21、耐稀碱PH121和耐较高温度7O75不变性等特性。它主要分布于肝、脾、骨髓组织中，是细胞用于储存铁离子的最重要的蛋白质。铁蛋白由蛋白质外壳和铁核两部分组成，外形结构呈球形。蛋白壳由24个亚基组成高度对称性的结构，厚度约225NM，外径1113NM，内径89NM，铁核位于蛋白壳中心，由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均匀的结构，直径约78NM。哺乳动物铁蛋白由H和L两种亚基以不同比例组成，植物、原核生物铁蛋白由相同亚基组成【2】。铁蛋白的分子量因含铁量不同而异,大约为460000,体内铁
12、蛋白含铁总量占机体含铁总量的1530。因此，对纽虫进行基因克隆得到的重组铁蛋白的活性、功能和作用机理研究具有重要意义。1有关铁蛋白和重组铁蛋白的研究现状和成果自1991年国外报道了大豆铁蛋白基因的完整CDNA序列以来，国外又陆续报道了国外陆续报道了豌豆、玉米、油菜、马铃薯、烟草、紫花苜蓿、羽扇豆等铁蛋白基因的CDNA序列。我国在这方面的工作起步较晚,目前报道的主要有黄花苜蓿铁蛋白CDNA的克隆与序列分析、细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组、表达、纯化及免疫学特性鉴定和可口革囊星虫铁结合蛋白基因的研究等。转基因研究已证明大豆铁结合蛋白基因能提高水稻种子中铁结合蛋白的含量【3】。11调节铁代谢平衡的研究铁
13、在细胞内的浓度需要严格控制，一方面，机体缺铁会引起很多生理上的变化，也会引发某些疾病，最常见的是缺铁性贫血；另一方面，铁又不可过量，否则可发生铁中毒，引起胃肠道出血，大量铁积聚在肝脏等重要脏器，引起肝功能损害等疾病。铁蛋白主要在释放和储存上对铁代谢进行调控。当体内铁含量过高时铁以FE2的形式贮存于铁蛋白中，铁蛋白贮存铁的过程包括二价铁氧化、铁离子移动和矿质铁心的形成和生长。在出血或其他需要铁的情况下，贮存的铁可以释放，参与造血或其他含铁化合物的合成【4】。杜莉利等【5】在实验中从可口革囊星虫体液中获得铁结合蛋白基因的全长序列，当过量的“游离铁”入侵时,可口革囊星虫能启动防御机制,避免机体受损。
14、白霞等【6】在对微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析中从微小牛蜱克隆到1个新的铁蛋白编码基因,研究认为蜱铁蛋白很可能存在于细胞溶质中,当外界大量的铁和血红蛋白被蜱消化吸收后,到达各组织器官的细胞中,铁蛋白对过多的铁进行贮存和调控,使其维持在生理水平,起到解毒作用。12铁蛋白基因研究由于植物性食物的铁含量低，且存在吸收率低的问题，使得人类铁营养主要依耐于动物食品。在以谷物等食物为主要来源的人们中，尤其是发展中国家存在严重的缺铁问题。近年来铁蛋白基因作为提高植物铁含量的候选基因而倍受关注，原因是（1）铁蛋白贮存铁的能力高于其它蛋白；（2）铁蛋白由特殊酶亚基形成，无需导入任何其它基因诱导产生翻译产物；
15、（3）铁蛋白在单、双子叶植物中都存在；（4）铁蛋白中铁以生物可以利用形式存在。克隆其基因并导人经济作物，实现稳定而高效的表达，将会提高植物的铁营养成分【7】。植物中有关铁结合蛋白基因的分离和克隆已涉及大豆、豌豆、豇豆、苜蓿、玉米、油莱、拟南芥、马铃薯、兰花等植物。迄今，运用转基因技术将外源铁蛋白基因导人经济作物中已有许多成功报道。GOTO等将由35S启动子驱动的大豆铁蛋白基通过农杆菌转入莴苣后发现含铁量明显提高【8】。动物转基因技术相对于植物转基因技术而言转化效率低、操作困难，目前动物铁蛋白的研究主要集中在基因的分离和克隆上。王敏等【9】筛选日本血吸虫铁蛋白CDNA文库获得日本血吸虫铁蛋白基因
16、并对其进行克隆表达及其免疫诊断的研究。目前国内有关微生物铁蛋白基因的研究很少，国外相对多一些。细菌中已经发现三种特征铁蛋白（1）典型铁蛋白（FTNA），在真核生物（H链）中也有发现；（2）血包含细菌铁蛋白（BFR）广泛存在于细菌中；（3）DNA结合铁蛋白（DPS）存在于细菌和古细菌中【10】。13重组铁蛋白的研究刘巧泉等【11】尝试利用水稻胚乳中表达铁结合蛋白来方法提高稻米铁含量。董阔、徐杰等【12】在此基础上采用基因枪和农杆菌转化法，将水稻胚乳特异表达的谷蛋白基因启子GLUB1驱动下的大豆铁结合蛋白基因转入2个优良早稻品种“旱稻297”和“早稻277”。利用PCR、SOUTHERN杂交分析方
17、法验证转化结果。发现转基因植株T1T3代的RTPCR证明，外源基因在种子中特异表达。T1T3代的PCR检测证明铁结合蛋白基因已经稳定遗传。多数转基因植株T0T3代种子中铁含量高于未转化植株，最高达到未转化对照的2倍以上。由此得出结论利用基因枪和农杆菌转化法可将大豆铁结合蛋白基因导入旱稻基因组中，并使转基因稻米铁含量增高。徐晓晖【13】，程志强【14】等采用农杆菌介导法，以35S启动子，将豌豆铁结合蛋白基因转化到水稻秀水11品种中，转基因水稻FT4植株种子中铁含量比非转基因植株提高了22倍，而FT66植株叶片中铁含量提高了23倍。同时转铁蛋白基因的水稻呈现出对百草枯的抗性，并提高了抗水稻稻瘟病能
18、力。王彩芬【15】等采用冻融法将含有大豆铁结合基因的质粒转入农杆菌菌株LBA4404中，以宁夏4个水稻主栽品种为受体材料，通过农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，经2轮次除草剂筛选获得了再生植株。经过对转化植株的PC扩增检测，证明外源大豆铁结合基因已经转入宁夏水稻植株中。大豆铁结合蛋白基因在水稻种子中特异表达，转基因植株种子中的铁含量未转化植株的1722倍。2小结铁结合蛋白在生物体内铁的代谢方面起着关键作用，不仅可以贮存铁，还能对铁给予调节【1619】。而且乳铁蛋白铁蛋白的一种还具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能【2022】,被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和
19、饲料添加剂【2325】。此外，铁蛋白可以通过红细胞膜,为血红素提供铁，同时还参与细胞RNA代谢的调节，有研究认为该蛋白是解决动物和人类全球饮食缺铁有效的方法。3展望纽虫【2627】是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器能够翻转的吻。目前国内外对纽虫的研究较少，尽管有关吻的结构、毒素的性质、胚胎发育、以及再生现象已有部分报道，但是大多数的研究主要在形态解剖学或生理生化上，很少在分子水平上对它的这些生理现象进行深入地分析。因此，从分子水平上对纽虫铁结合蛋白进行分析，为研究铁结合蛋白在纽虫中的表达特征，功能和作用机理奠定基
20、础，具有重要意义。参考文献1袁小红，杨星勇，罗小英等豌豆铁蛋白的纯化及其抗血清的制备J中国生物化学与分子生物学学报，200256146182王群力，孔波，黄河清铁蛋白纳米蛋白壳结构与功能研究新进展J化学进展，2004，1645165193GOTOF，YOSHIHARAT，SHIGEMOTON，TOKIS，TAKAIWAFIRONFORTIFICATIONOFRICESEEDBYTHESOYBEANFERRITINGENEJNATUREBIOTECHNOLOGY，1999，172822864朱王飞，钱胜峰铁与人体健康J膳食指南，2004347495杜莉利，李太武，等可口革囊星虫PHASCOLOM
21、AESCULENTA铁结合蛋白基因的研究J海洋与湖沼，2008，3932522556白霞，周金林，等微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析J畜牧兽医学报，2005，36166697王永斌，郭长虹，郭东林大豆铁蛋白CDNA的克隆及植物表达载体的构建大豆科学，2006，2544544578GOTOF，YOSHIHARAT，SAIKIHIRONACCUMULATIONANDENHANCEDGROWTHINTRANSGENICLETTUCEPLANTSEXPRESSINGTHEIRONBINDINGPROTEINFERRITINJTHEORETICALANDAPPLIEDGENETICS，2000，100
22、6586649王敏，易新元，曾宪芳，等日本血吸虫铁蛋白基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究J中国免疫学杂志，2004，201069669910JYOTIVELAYUDHAN，MARGARETCASTOR，ANTHONYRICHHARDSON，ETALTHEROLEOFFERRITINSINTHEPHYSIOLOGYOFSALMONELLAENTERICSVTYPHIMURIUMAUNIQUEROLEFORFERRITINBINIRONSULPHURCLUSTERREPAIRANDVIRULENCEJMOLECULARMICROBIOLOGY，2007，6351495150711刘巧泉，姚泉洪，王
23、红梅，等转基因水稻胚乳中表达铁结合蛋白提高稻米铁含量遗传学报，2004,3151852412董阔，徐杰，等大豆铁结合蛋白基因在旱稻中的表达及铁含量分析J中国农业科学，2006，39112362236713徐晓辉，郭泽建，程志强，等铁蛋白基因的水稻转化及其功能初步分析J浙江大学学报，2003,291495414程志强，郭泽建，徐晓辉，等转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性J中国水稻科学，2003,171858815王彩芬，付永彩，安永平，等转大豆铁结合蛋白基因水稻的初步研究J西北农业学报，2008,176848716丁聃，王娅娜，等细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组、表达、纯化及免疫学特性鉴定
24、J宁夏医科大学学报，2009，310214614817曹阳，高华颖，于黎，等人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究J遗传，2002，24191418张蓉，刁其玉乳铁蛋白在犊牛生产中的应用及其生物信息学分析J乳业科学与技术，2007，1394219张述，王革非等重组人乳铁蛋白基因克隆及表达J中国生物制品学杂志，2005，180211711920高海燕，郭荣富乳铁蛋白肽的研究现状及进展J中国饲料添加剂，2007,6107151921单体中，汪以真乳铁蛋白的生物学功能及其基因工程研究J中国饲料，200510101222康萍，印遇龙乳铁蛋白的抑菌机制J中国饲料，200615293123邢芳芳，等乳铁蛋白肽的
25、生物学活性及应用前景J中国饲料添加剂，2006101524黄海青，汪以真乳铁蛋白肽的研究进展J中国兽药杂志，2004，386151825唐传核，曹劲松，彭志英乳铁蛋白最新研究进展活性多肽及生理功能（）中国乳品工业，2000，285444726吕慈仙，李太武，等浙江沿海最新发现一种枝吻类纽虫J水产科学，20071265265427王孟前，李太武，等浙江沿海一新纽虫的18RDNA序列研究J科技通报，2010，2616771本科毕业设计（20_届）重组铁蛋白的活性研究目录0前言11材料和方法211材料212试剂213仪器设备314方法3141重组蛋白的诱导表达3142诱导表达产物的SDSPAGE电泳
26、31421分离胶的制备31422浓缩胶的制备31423样品制备31424电泳3143重组蛋白的大量表达及纯化3144蛋白复性4145活性检测42结果521SDSPAGE522表达产物的纯化523复性及计算53讨论631目的基因在原核细胞中的诱导表达632表达产物的纯化733复性及计算74结论7致谢7参考文献8摘要目的获得了大量的有活性的重组铁蛋白，为进一步研究这一蛋白的功能和开发应用奠定了基础。方法（1）重组铁蛋白的原核表达并用SDSPAGE检测表达蛋白。（2）大量表达蛋白并用镍柱纯化法进行纯化。（3）进行蛋白复性使蛋白获得天然构象后，分析其活性。结论该重组蛋白表现出明显的结合铁离子的活性，本
27、实验为研究铁结合蛋白的功能和对其的开发应用奠定了基础。关键词重组铁蛋白；蛋白表达；活性研究ABSTRACTPURPOSEOBTAINEDLARGENUMBEROFACTIVERECOMBINANTFERRITIN,CONTRIBUTETOFURTHERRESEARCHOFFUNCTIONANDDEVELOPMENTAPPLICATIONSMETHODS1EXPRESSIONOFRECOMBINANTFERRITINANDDETECTIONBYSDSPAGE2EXPRESSLARGENUMBEROFPROTEINANDPURIFIEDBYNICKELCOLUMNPURIFICATION3REFO
28、LDTHEPROTEINANDTHENANALYZETHEACTIVITYCONCLUSIONRECOMBINANTPROTEINSHOWESIGNIFICANTACTIVITYOFBINDINGIRONTHEFUNCTIONANDMECHANISMOFTHEFOUNDATIONIRONBINDINGPROTEINCANBASEONTHISSTUDYKEYWORDSRECOMBINANTFERRITIN；PROTEINEXPRESSION；ACTIVITYRESEARCH0前言铁蛋白FERRITIN于1937年由LAUFBERGE从脊椎动物马的脾脏中纯化分离出来1，具有耐稀酸PH21、耐稀碱P
29、H121和耐较高温度7O75不变性等特性。它主要分布于肝、脾、骨髓组织中，是细胞用于储存铁离子的最重要的蛋白质。铁蛋白由蛋白质外壳和铁核两部分组成，外形结构呈球形。蛋白壳由24个亚基组成高度对称性的结构，厚度约225NM，外径1113NM，内径89NM，铁核位于蛋白壳中心，由数千氢氧化铁分子和数百磷酸盐分子组成非均匀的结构，直径约78NM。哺乳动物铁蛋白由H和L两种亚基以不同比例组成，植物、原核生物铁蛋白由相同亚基组成2。铁蛋白的分子量因含铁量不同而异,大约为460000,体内铁蛋白含铁总量占机体含铁总量的1530。铁蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中的铁储存蛋白，是动植物生长发育的储存铁的共
30、同来源。当细胞内二价铁离子含量高时，铁蛋白通过它的亚铁氧化还原中心，在氧气的帮助下，将其催化氧化生成无毒的三价铁储藏在它的内部，1分子铁蛋白最多可储存4500个三价铁，这个特点是铁蛋白与其它酶最大的不同之处；当细胞需要铁时，铁蛋白在还原剂的帮助下，将三价铁还原为二价铁离子从其内部释放出来，以供其它蛋白质合成利用，所以铁蛋白在细胞内具有去除二价铁离子的毒性以及调节铁代谢平衡的双重作用，同时它还参与细胞RNA代谢的调节。有研究认为该蛋白是解决动物和人类全球饮食缺铁的有效方法。铁是人体必需的微量元素，在新陈代谢过程中起着极其重要的作用。铁不仅是多种化合物的组分，还与参与代谢的多种活性酶有关，同时在一
31、定程度上影响机体的免疫机能。铁可以形成血红素HEME、铁硫原子簇IRONSULFURCLUSTERS以及其他一些铁化合物，这使得它在光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的合成等诸多生理代谢过程扮演着举足轻重的角色，是动物、植物以及微生物生长发育所必需的营养元素之一。铁在细胞内的浓度需要严格控制，一方面，机体缺铁会引起很多生理上的变化，也会引发某些疾病。铁缺乏的表现（1）贫血，缺铁性贫血的诊断特征是红细胞计数减少，周边图1人类FERRITINH型亚基的中心结构（结合了FE3的结构模型）FIG1FERROXIDASECENTERREGIONOFHUHFMODELEDTOSHOWBINDING
32、OFTHEFE3OXOBRIDGEDDIMER血的HB浓度降低。此外还有一些贫血与铁有关。例如，溶血性贫血是由于红细胞破坏过多造成的，而红细胞的破坏可因铁催化产生自由基引起。由于铁供给不足使红细胞增殖能力下降，也可引起贫血。缺铁还可引起低色素小红细胞性贫血。它与红细胞的成熟不够有关。还有种因铁代谢紊乱造成的贫血，它的特征是骨髓中出现铁沉着成红细胞代替在正常情况下的正成红细胞。（2）缺铁造成的含铁酶功能下降，重要的如细胞色素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、琥珀酸脱氢酶和黑嘌呤氧化酶等，这些酶在物质和能量代谢中起重要作用。（3）缺铁造成的脑神经系统变化，长期缺铁可以引起一系列脑神经系统表现异常。在缺铁
33、性贫血的婴幼儿中，可见注意力、学习能力、记忆力异常。（4）机体防御能力降低，由于许多自由基代谢环节如OH的形成需要铁的参与，所以缺铁时白细胞杀菌能力降低，感染性疾病患病率有所增加3。另一方面，铁又不可过量，否则可发生铁中毒，铁在生物体内聚积过多时会产生毒害作用，FEII很容易与过氧化氢氧分子不完全还原的产物通过FENTON反应生成羟基自由基。此外，通过铁催化的HABERWEISS反应也可以生成羟基自由基以及过氧离子自由基。这些自由基反应性极强，极易导致DNA、蛋白质及细胞膜的破坏；FEII的氧化产物FEIII离子很容易水解生成氢氧化铁沉淀，使得铁的生物利用度下降。引起胃肠道出血，大量铁积聚在肝
34、脏等重要脏器，引起肝功能损害等疾病。铁结合蛋白在生物体内铁的代谢方面起着关键作用，不仅可以贮存铁，还能对铁给予调节，食物中的铁蛋白铁不受任何化学限制，即使在肌醇六磷酸含量相对高的大豆中，饮食中的铁蛋白铁仍被吸收并被转化为血红细胞能使用的形式4，5。因此，铁蛋白对人体的健康有较大影响。铁蛋白主要在释放和储存上对铁代谢进行调控。当体内铁含量过高时铁以FE2的形式贮存于铁蛋白中，铁蛋白贮存铁的过程包括二价铁氧化、铁离子移动和矿质铁心的形成和生长。在出血或其他需要铁的情况下，贮存的铁可以释放，参与造血或其他含铁化合物的合成6。另外，有研究表明铁蛋白对清除自由基，抗氧化也具有很好的功效。自由基是机体的正
35、常代谢产物,生物组织中许多生化反应的中间代谢过程都伴有自由基的产生。自由基又极易引起化学反应,可与生物体内的许多物质如DNA、脂肪酸、蛋白质等作用,夺去它们的氢原子,造成相关细胞结构与功能的变化,从而引起疾病和衰老。生物内总自由基中95以上属于氧自由基,因此,氧自由基对生物体危害极大。对过量表达FERRITIN基因植物的研究表明,转基因植株种子中铁含量提高,并且对生物胁迫和非生物胁迫都有一定的抗性。转FERRITIN基因植株的生物抗性和非生物抗性主要由铁蛋白的抗氧化作用而引起。目前普遍认为铁蛋白通过截获细胞间铁而阻止铁参与FENTON反应,产生具有很强活性的OH,而保护细胞免受因各种环境胁迫而
36、导致的细胞氧化性损伤。比如细胞中铁蛋白的诱导合成与其抗H2O2的活性相关；肿瘤细胞对氧化剂的敏感性与FERRITIN基因的表达水平一致。通过对FERRITIN基因缺失拟南芥的研究发现,FERRITIN在拟南芥中的主要作用是防御由自由铁诱导的氧化胁迫而非仅仅在发育过程提供铁源7，8。因此铁蛋白被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂9。此外，铁蛋白可以通过红细胞膜,为血红素提供铁，同时还参与细胞RNA代谢的调节。纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布，它具有柔软、能伸展、无分节的身体，以及一个极具特征性的捕食器能够翻转的吻。当捕食时，乘被捕者不备，吻部
37、可突然伸出，迅速缠住猎获物并将它卷人口中。纽虫大多数色彩鲜艳，红、蓝、黄、绿、白等各种颜色混合一体，有时呈交叉的横带状，有时具特殊的警戒色。纽虫还有一个众所周知的特征就是它极强的再生能力，在受到外界刺激的情况下，纽虫的身体会自行断成几个部分，并再次长成完整的个体。纽虫的生命力很强，即使在寒冷的冬天也能够僵而不死。它有特厚的肌肉层，而且体表能分泌酸性很强的粘液，在它的肠道和体壁之间充满着许多组织细胞，可以贮存食物。因此，它的耐饿力很强10。纽虫的这些独特的生理特点，使其成为一类绝佳的生物研究模型。但是目前国内外对纽虫的研究较少11,12,13，尽管有关吻的结构、毒素的性质、胚胎发育、以及再生现象
38、已有部分报道，但是大多数的研究主要在形态解剖学或生理生化上，很少在分子水平上对它的这些生理现象进行深入地分析。本论文在获得纽虫铁蛋白，并成功构建了其原核重组表达质粒的基础上，对该重组蛋白进行诱导表达，分离纯化和复性，获得了大量的有活性的重组铁蛋白。这为进一步研究这一蛋白的功能和开发应用奠定了基础。1材料和方法11材料表达宿主菌ECOLIBL21由本实验室保存含有构建了纽虫铁蛋白基因的重组质粒PET28AFERRITIN。12试剂LB液体培养基450ML去离子水中加入胰蛋白胨5G，酵母粉25G，NACL5G，摇动容器直至溶质溶解，用5MOL/LNAOH调PH至70，用去离子水定容,500ML，高
39、压蒸汽灭菌锅120灭菌20MIN。KNA溶液005G/ML，IPTG诱导剂0238G/ML，电泳分离胶和浓缩胶，溴酚蓝指示剂，凝胶染色液和脱色液，PBS缓冲液，BUFFERB溶液、BUFFERC溶液和BUFFERE溶液，EDTA溶液，尿素缓冲液，复性BUFFER。13仪器设备主要仪器有电泳槽，37摇床，高压蒸汽灭菌锅，4冰箱，其他为实验室常规仪器。14方法141重组蛋白的诱导表达取1ML混悬液接种于50MLLB液体培养基中，加入50LKNA溶液（以上操作在无菌操作台进行），37180R/MIN振荡培养34H，每瓶加IPTG诱导剂50L后37振荡培养。以培养0H为起点，每隔1H取出2ML菌液于塑
40、EP管（1ML/管）中，共诱导6H。取出的菌液用离心机在12000R/MIN转速下离心3MIN，倒出上清，将EP管置于20冰箱。142诱导表达产物的SDSPAGE电泳SDSPAGE电泳原理聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效地把不同类型的蛋白质分开的主要依据是样品中各种物质的电荷和分子量的差异性。各种SDS蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映出分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。1421分离胶的制备12分离胶（总量5ML）H2O16ML30ACRYLAMIDE2ML15MTRISHCL（PH88）13ML10SDS50L10APS50LTEMED2L按照仪器使
41、用说明安装好垂直板，将上述溶液混匀后，迅速在两层玻璃板间灌入分离胶，上面为浓缩胶留出2CM的空隙。并在胶面上加入051ML超纯水，覆盖其界面，待分离胶聚合完全后，倾去分离胶上面的液体，并尽量用滤吸水纸吸干凝胶顶端的残存液体。1422浓缩胶的制备5浓缩胶（总量2ML）H2O14ML30ACRYLAMIDE033ML10MTRISHCL（PH68）025ML10SDS20L10APS20LTEMED2L灌入浓缩胶，插入梳子，室温下放置1020MIN，待浓缩胶聚合完全后，拔出梳子。按照说明书，将胶安装上SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳槽上。在槽内加入电泳缓冲液，并使内侧槽缓冲液浸没胶面。1423样品制备加入
42、1ML预冷的PBS悬浮液于不同诱导时间的表达菌体（0H，1H，2H，3H，4H，5H，6H）及其对照菌体中，对照菌分别为含有PET28A质粒的菌液不诱导和含有PET28A质粒的菌液诱导4H。6,000R/MIN，5MIN离心使菌体沉淀。加入等量的上样缓冲液，100沸水浴10MIN后立即冰浴，使菌体破碎，10,000R/MIN，10MIN离心，各取上层10L直接用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。1424电泳接通电源电泳条件为恒压方式70V，待样品进入分离胶后，升至120V。当溴酚蓝抵达分离胶底部时结束电泳。取下电泳凝胶，以考马斯亮蓝R250染色液浸泡凝胶，室温下缓慢摇动1H以上。回收染色液，以脱色液浸
43、泡凝胶，缓慢摇动48H，期间更换脱色液数次至凝胶背景清晰。（考马斯亮蓝R250染色液配方10G考马斯亮蓝R250，250ML异丙醇，100ML冰醋酸，加650去离子水后过滤；脱色液配方甲醇100ML，冰醋酸100ML，蒸馏水800ML。）143重组蛋白的纯化宿主菌经IPTG诱导后，不仅会表达出我们需要的目的蛋白，同时也会表达出菌体蛋白，这就需要进行分离纯化。为检测表达产物在ECOLIBL21胞质中是以可溶性物质还是以包涵体形式存在，我们采用下面的方法（1）收集菌液，10，000G，4，离心5MIN；1PBS漂洗后离心收集沉淀。（2）加入1PBS，PH80（含有2TRITONX100），振荡混匀
44、后加入溶菌酶，在4反应30MIN。（3）菌体用超声破碎仪作用10MIN，随后在10，000G，离心10MIN。（4）上清（胞质中的可溶性物质）和沉淀（包涵体沉淀）分别进行SDSPAGE电泳分析。表达产物带有HIS标签，并且以不可溶性的包涵体形式存在于细胞中，所以我们采用NINTA，在变性条件下进行分离纯化，具体过程如下（1）3ML菌体超声破碎后，收集包涵体沉淀。加入200LBUFFERB（100MMNAH2PO4，10MMTRIS，6MGUHCL，PH80），05L巯基乙醇和4L咪唑（终浓度为20MM）。轻微混匀后，在室温放置1H，使包涵体充分溶解。（2）12，000G，离心10MIN，上清置
45、于新的离心管中备用。（3）取50L混合50酒精的NINTA，轻微离心后，吸去上清，NINTA用等量的BUFFERB洗涤两次。（4）把包涵体破碎后的上清，加入到NINTA中，室温轻微混匀30MIN。（5）12，000G，离心10SEC沉淀NINTA，去上清。（6）在NINTA中加入250LBUFFERC100MMNAH2PO4,10MMTRIS,8MUREA,PH63，和5L咪唑（终浓度为20MM），轻微混匀后，12，000G，离心10SEC，去上清。重复一次。（7）加入25LBUFFERE100MMNAH2PO4,10MMTRIS,8MUREA,PH45，和5L咪唑（终浓度为160MM），12
46、，000G，离心10SEC，上清为含重组蛋白的洗脱液E。重复三次。（8）SDSPAGE分析鉴定表达产物的分离纯化情况。144蛋白复性很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物往往在细胞内形成包涵体。包涵体中基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，因而无生物活性。所以应使含体使目标蛋白质恢复天然的构型并获得活性。经SDSPAGE分析鉴定，表达产物的分离纯化情况较好。但因为是在变性条件下分离纯化的，所以我们采用一套复性缓冲液对这些重组蛋白进行复性和天然构象的恢复。具体过程如下（1）透析袋的处理剪取合适长度的透析袋，分别置于溶液1（含8NAHCO3的05MEDTA，PH80）和溶液2（
47、05MEDTA，PH80）中各煮沸10MIN，然后用去离子水彻底清洗，备用。（2）将含有8M尿素的重组蛋白洗脱液放入透析袋中，于6M尿素缓冲液中，4，透析过夜。（3）然后在复性BUFFER缓冲液（20MMTRIS，PH80含2MMGSH，02MMGSSG，5MMEDTA和50MMGLYCINE）中，4，透析24H，并更换一次复性BUFFER。（4）于2M尿素缓冲液中，4透析过夜。（5）于50MMTRISHCL缓冲液，4透析过夜以交换BUFFER。145活性检测纯化的铁蛋白浓度采用BRADFORD法测定，以牛血清白蛋白作为标准。用牛血清清蛋白BSA，配制成10MG/ML标准蛋白质溶液。取11支试
48、管，1支作空白，其余试管按下表分别加入样品、水和试剂，然后用无离子水补充到01ML。最后各试管中分别加入50ML考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合。（考马斯亮兰G250染料试剂称100MG考马斯亮兰G250，溶于50ML95的乙醇后，再加入120ML85的磷酸，用水稀释至1升。）加完试剂25分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595NM处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即01MLH2O加50MLG250试剂。以标准蛋白浓度为横座标，以吸光度值A595为纵座标作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品
49、的蛋白质含量。纯化铁蛋白的铁结合能力由以下方法测定制备浓度为6G/ML的纯化蛋白1ML，向1ML体系中加入2MM/L的FECL220L，加入浓度为5MM/L的菲洛嗪40L，用分光光度计在波长为562NM处测其吸光值记为C。将上述混合液摇晃混匀，室温下反应10分钟，用分光光度计在波长为562NM处测其吸光值记为S。测量三组数值，由计算式CS/C计算得出数据进行结果分析14。编号012345678910BSA（L）005123456789H2O（L）100995999897969594939291C（G/ML）051020304050607080902结果21SDSPAGE通过SDSPAGE电泳分析，重组菌在相对分子质量在201KD与290KD之间可见明显的条带，而未经诱导菌株与空载体对照菌则无条带，由于质粒PET28A在多克隆位点上游有一段编码序列，分子量约为35KD，而目的蛋白为1999544KD，故融合蛋白约为235KD，两者相符，见图2A。诱导后1H，2H，3H，4H目的蛋白表达量逐渐增多，之后蛋白表达量居于恒定水平，不随时间的延长而增加。表明诱导4H时目的蛋白可以完全表达，见图2A。22表达产物的纯化纯化后的蛋白用SDSPAGE电泳分析，在相对分子质量约
