1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响一、选题的背景与意义真核细胞的细胞骨架由微管、微丝和中间纤维构成。肌动蛋白ACTIN是微丝的主要构成成分。微丝参与细胞形态和极性的维持、内吞作用、胞内运输、细胞收缩及运动、细胞分裂等众多功能。而肌动蛋白结合蛋白ACTINBINDINGPROTEINS，ABPS则在肌动蛋白纤丝聚合及解聚的动态变化中发挥重要的调节作用。纽虫的体壁肌肉中含有大量的肌动蛋白和凝溶胶蛋白。凝溶胶蛋白GELSOLIN则是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，最早于1979年由YIN和STOSSEL在兔肺巨噬细胞中发现，证实其能以钙依赖的方式调节肌动蛋白的重组，促使细胞
2、质GELSOL的相互转换。GELSOLIN通过对微丝的剪切、封端和成核作用，来实现对细胞微丝骨架的动态调节，推测过表达的GELSOLIN可以通过调控神经细胞内肌动蛋白网络来影响轴突的起始、发生、伸长和树突的形成，从而增加神经元的长度，加快神经元的生长，从而促进外伤、截肢等患者的离断神经的修复。另外，推测GELSOLIN对肌肉的收缩和肌原纤维的装配起重要作用。成肌纤维细胞MYOFIBROBLAST是伤口愈合和各种组织纤维化中起主要作用的细胞，成肌纤维细胞不能及时从病变处退出，使细胞外基质持续过量分泌，并发生重塑是组织纤维化的主要特征。ACTIN作为肌肉细胞的一个重要的收缩蛋白，也是构成细胞骨架的
3、主要成分，其表达量的多少能直接反应成肌纤维细胞的分化、增值及凋亡情况，而GELSOLIN又在肌动蛋白纤丝聚合及解聚的动态变化中发挥重要的调节作用，因此研究GELSOLIN对成肌纤维细胞的功能性作用具有重要的理论意义，通过分子生物学技术阻断其分化、增殖的信号通路及基因转录，通过药物或重组蛋白促进成肌纤维细胞的凋亡，抑制其分化和增殖，促其恢复转化前细胞表型，从而阻断纤维化进程，根治组织纤维化疾病。无序生长和高迁移能力是转移性癌细胞的重要特征，而这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架的解聚与重排，而GELSOLIN作为胞质内重要的ACTIN调节蛋白也与肿瘤的发生和发展有着密切的关系。已报道GELSOLI
4、N在人类多种恶性肿瘤中表达明显降低，其表达水平与肿瘤大小、侵袭性生长等密切相关，如在人膀胱癌中，GELSOLIN在6个膀胱癌细胞系和778的膀胱癌组织中表达缺失和明显降低。在乳腺癌中，GELSOLIN在乳腺癌细胞系中缺失或明显低于正常人乳腺上皮细胞和良性永生化细胞的表达水平。人们对GELSOLIN在肿瘤中表达明显降低的现象进一步进行了深入研究，发现将外源GELSOLINCDNA全长转入癌细胞系过表达后，可抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性。这些实验证据提示GELSOLIN具有明显的肿瘤抑制作用。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1、胃癌细胞的培养。2、重组凝溶胶蛋白的
5、诱导表达、NI柱纯化和冷冻干燥。3、凝溶胶蛋白对胃癌细胞功能性作用和作用的机制的研究，包括凝溶胶蛋白对胃癌细胞形态变化的影响对细胞迁移运动情况的影响对胃癌细胞有丝分裂情况的影响。三、研究的方法与技术路线四、总体安排与进度201010201011查阅文献，了解实验总体步骤与方法。201011201012重组凝溶胶蛋白的制备；以及胃癌细胞的培养。201012201103凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响。重组凝溶胶蛋白GELSOLIN对胃癌细胞作用细胞形态的变化迁移运动情况有丝分裂情况诱导表达、纯化和冷冻干燥培养胃癌细胞201103201105对整个试验的补充、完善阶段，论文的撰写。五、主要参考文献1韩晓
6、曦，王继红，李庆伟凝溶胶蛋白的结构与功能J中国生物化学与分子生物化学报，2007，23（5）3313372王旭涛，张新超凝溶胶蛋白和危重病JCHINESEGENERALPRACTICE，2009，12（11）208820913倪晓光凝溶胶蛋白的结构和功能及其抑制肿瘤的作用J实用癌症杂志，2007，2211051074汪勇沛，詹永乐日本血吸虫凝溶胶蛋白基因在虫体不同发育阶段的转录水平分析上海畜牧兽医通讯，2010，148495潘有福，王新宇，张大伟，等烟草花粉母细胞减数分裂前期肌动蛋白的免疫细胞化学定位J实验生物学报，2000，3332732816孟宪敏，曹慧青，王震等NELIN的肌动蛋白结合特
7、性及与其相互作用蛋白质的筛选J科学通报，2004，49（21）217321777江奇峰，蔡绍皙，晏小清，等钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对癌细胞迁移能力的影响研究J生物化学与生物物理进展，2010，3733263368徐国恒细胞骨架肌动蛋白纤维J生物学通报，2005，402439倪晓光凝溶胶蛋白的结构和功能及其抑制肿瘤的作用J实用癌症杂志，2007，22110510710高绪霞，黄海长，李晓玫成肌纤维细胞在纤维化过程中的作用及其调控J生理科学进展，2007，381788011胡永斌，曾庆富，彭劲武，等二氧化硅影响人肺成纤维细胞平滑肌肌动蛋白表达的实验研究J中华劳动卫生职业病杂志，2006，2495
8、2352512LEEWM，GALBRAITHRMTHEEXTRACELLULARACTINSCAVENGERSYSTEMANDACTINTOXICITYJNENGLJMED，1992，3261335134113YINHL，STOSSELTPCONTROLOFCYTOPLASMICACTINGELSOLTRANSFORMATIONBYGELSOLIN，ACALCIUMDEPENDENTREGULATORYPROTEINJNATURE，1979，28158358614SNABESMC，BOYDAE，BRYANJDETECTIONOFACTINBINDINGPROTEINSINHUMANPLATEL
9、ETSBY125IACTINOVERLAYOFPOLYACRYLAMIDEGELSJJCELLBILO，1981，90（3）80981215HARRISHE，BAMBURGJR，WEEDSAGACTINFILAMENTDISASSEMBLYINBLOODPLASMAJFEBSLETT，1980，121（1）17517716MCGOUGHAM，STAIGERCJ，MINJK，ETALTHEGELSOLINFAMILYOFACTINREGULATORYPROTEINSMODULARSTRUCTURES，VERSATILEFUNCTIONSJ，FEBSLETT，2003，552（23）758117S
10、ILACCIP，MAZZOLAIL，GAUCIC，ETALGELSOLINSUPERFAMILYPROTEINSKEYREGULATORSOFCELLULARFUNCTIONSJCELLMOLLIFESCI，2004，6119202614262318CUNNINGHAMCC,STOSSELTP,KWIATKOWSKIDJENHANCEDMOTILITYINNIH3T3FIBROBLASTSTHATOVEREXPRESSGELSOLINJSCIENCE,1991,25149981233123619CHELLAIAHM,KIZERN,SILVAM,ETALGELSOLINDEFICIENCYBLO
11、CKSPODOSOMEASSEMBLYANDPRODUCESINCREASEDBONEMASSANDSTRENGTHJJOURNALOFCELLBIOLOGY,2000,148466567820FERJANII,FATTOUMA,MACIVERSK,ETALADIRECTINTERACTIONWITHCALPONININHIBITSTHEACTINNUCLEATINGACTIVITYOFGELSOLINJBIOCHEMJOURNAL,2006,396346146821TANAKAM,MULLAUERL,OGISOY,ETALGELSOLINACANDIDATEFORSUPPRESSOROFHU
12、MANBLADDERCANCERJCANCERRES,1995,5515322822PHILCHENKOVAACASPASESASREGULATORSOFAPOPTOSISANDOTHERCELLFUNCTIONSJBIOCHEMISTRYMOSC，2003，68436537623MEJILLANOM,YAMAMOTOM,ROZELLEAL,ETALREGULATIONOFAPOPTOSISBYPHOSPHATIDYLINOSITOL4,5BISPHOSPHATEINHIBITIONOFCASPASES,ANDCASPASEINACTIVATIONOFPHOSPHATIDYLINOSITOLP
13、HOSPHATE5KINASESJJBIOLCHEM,2001,27631865187224QIAOH,KOYARC,NAKAGAWAK,ETALINHIBITIONOFALZHEIMERSAMYLOIDBETAPEPTIDEINDUCEDREDUCTIONOFMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDNEUROTOXICITYBYGELSOLINJNEUROBIOLAGING,2005,26684985525YUKIOOHTSUKA,HIROKINAKAE,HIROSHIABE,ETALFUNCTIONALCHARACTERISTICANDTHECOMPLETEPRI
14、MARYSTRUCTUREOFASCIDIANGELSOLINJBIOCHIMICAETBIOPHUSICAACTA,1998,13832219231毕业论文文献综述食品质量与安全凝溶胶蛋白的研究现状及展望摘要凝溶胶蛋白是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，主要通过切断、封端肌动蛋白丝，或使肌动蛋白聚集成核等方式来控制肌动蛋白的结构。本文对凝溶胶蛋白的结构特点、对细胞凋亡的调控以及与胃癌细胞的相互作用等几个方面进行概述。关键词凝溶胶蛋白，肌动蛋白结合蛋白，肌动蛋白1凝溶胶蛋白的结构特点凝溶胶蛋白是一种重要的激动蛋白结合蛋白。细胞能在特定的时间、空间调节肌动蛋白的聚合解聚过程。能与肌动蛋白结合兵调节其聚
15、合解聚作用的一类蛋白统称为肌动蛋白结合蛋白1。目前，在生物界里已经发现几十种，凝溶胶蛋白是其中研究较为清楚的一种。且凝溶胶蛋白最早于1979年2在兔的肺巨噬细胞发现，发现其以钙以来的方式调节肌动蛋白重组的功能，因而将其命名为凝溶胶蛋白3。后来人们在血小板细胞中4和血清中5也发现了此蛋白。凝溶胶蛋白是细胞骨架蛋白的重要组成成分之一，生物活性和功能多种多样，在诸如细胞运动型、细胞骨架结构动力学重排过程中的信号转导、细胞凋亡的控制，甚至是肿瘤发生过程的调节等方面都发挥着重要作用6。凝溶胶蛋白由3个或者6个同源的结构相似的片段组成8。目前，已获得的大多数物种的凝溶胶蛋白有6个相似的结构域。其中，G1和
16、G4可以结合肌动蛋白单体，G2只能结合肌动蛋白微丝。G1、G4和G6存在CA2的结合位点，G2存在PIP2的结合位点9。存在血浆凝溶胶蛋白和胞质凝溶胶蛋白两种形式。这两种形态的蛋白都是由9号染色体上的同1个基因所编码。通过不同的转录起始点以及不同的剪接方式，产生2种不同编码的MRNA，从而最终导致胞浆凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白的差异。凝溶胶蛋白在多种类型细胞中也均有表达，在胚胎期肌肉表达量最多10。凝溶胶以及家庭的其他切割蛋白，切断蛋白能够结合两种单体和聚合物肌动蛋白11。2凝溶胶蛋白和细胞的运动凝溶胶蛋白常常定位于细胞富含肌动蛋白丝的部位，比如正在迁移中的动物细胞边缘或处于生长时期的植物细胞
17、中。体外实验中，当肌动蛋白丝活动时，体外实验中，当肌动蛋白丝活动时，凝溶胶蛋白通过切断肌动蛋白丝，增加肌动蛋白单体在肌丝末端的解聚合发挥作用11。而该解聚过程正是细胞发生迁移的分子机制。研究表明，培养的小鼠成纤维细胞，可因凝溶胶蛋白的过表达而使其迁移效率增加125。因为细胞运动速度取决于肌动蛋白的更新率，凝溶胶蛋白是通过肌动蛋白的更新来加速细胞运动的，因此是肌动蛋白转换的重要调节因素12。凝溶胶蛋白基因敲除的小鼠，破骨细胞运动性会显著降低，从而阻碍了破骨细胞形成细胞黏附结构，这也表明凝溶胶蛋白与细胞的运动性是相关的13。一种钙调节蛋白钙调蛋白通过与凝溶胶蛋白相结合形成高亲和力的复合体而抑制凝溶
18、胶蛋白的成核活性14。最新研究表明，凝溶胶蛋白的活化与细胞的运动性高度相关，缺失凝溶胶蛋白的培养细胞运动性下降，过表达凝溶胶蛋白的细胞运动性增加10。凝溶胶蛋白基因剔除的小鼠具有正常的胚胎发育和寿命，但在止血血小板功能下降、炎症反应中性粒细胞迁移迟缓以及创伤愈合成纤维细胞移动变慢等方面有变化，说明该蛋白质在细胞的运动性快速变形方面具有调节作用。3凝溶胶蛋白与癌症癌细胞的重要特征包括无序生长和高迁移能力是转移性，而这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架的解聚与重排。已报道凝溶胶蛋白在人类多种恶性肿瘤中表达明显降低，其表达水平与肿瘤大小、侵袭性生长等密切相关，如在人膀胱癌中，凝溶胶蛋白在6个膀胱癌细胞
19、系和778的膀胱癌组织中表达缺失和明显降低12。人们对凝溶胶蛋白在肿瘤中表达明显降低的现象进一步进行了深入研究，发现将外源凝溶胶蛋白CDNA全长转入癌细胞系过表达后，可抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性13，14。重组腺病毒编码的野生型凝溶胶蛋白转入膀胱癌细胞系后可以使细胞停滞于G2/M期，原位膀胱癌动物模型经ADGSN治疗后，肿瘤体积缩小到10，显示出了凝溶胶蛋白具有明显的肿瘤抑制作用15，16。4凝溶胶蛋白与细胞凋亡细胞凋亡过程是半胱天冬酶所激活的，半胱天冬酶是一种在细胞凋亡期间大量出现的细胞核受动器蛋白酶。在活体外的实验环境下，凝溶胶蛋白是良好的CPP3培养基17
20、，18。已知在哺乳动物中共有14种此类蛋白家族的成员，其中半胱天冬氨酸3是细胞凋亡过程中关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的多种关键蛋白，其目标之一就是凝溶胶蛋白19。而且在凝溶胶蛋白基因敲除的小鼠神经元细胞中，缺氧引起的细胞凋亡作用的增强，支持了凝溶胶蛋白能抑制细胞凋亡的假设。磷酸磷脂酰肌醇与凝溶胶蛋白的紧密结合，能够消除由凝溶胶蛋白介导的抑制细胞凋亡的作用，这说明了凝溶胶蛋白抑制凋亡的作用可能主要取决于它构象和与肌动蛋白结合的能力20。凝溶胶蛋白在细胞凋亡的多种病理过程中发挥了一定的作用。比如，在老年痴呆症中，淀粉样肽可以诱导线粒体的机能紊乱和半胱天冬酶的活化，从而之势神经元凋亡2
21、1。5凝溶胶蛋白的研究现状以及其展望凝溶胶蛋白可以直接作用在肌动蛋白，对很多生理活动的重要影响不言而喻。随着分子遗传学和体外分析技术的发展与应用，凝溶胶蛋白各个结构域的结构分析得到广泛研究，但是整个的凝溶胶蛋白分子对体内肌动蛋白作用的结构和调控并没有完全的明确下来。其对肌肉的功能性作用和作用的机制等都需要进行进一步的研究。成肌纤维细胞是主要的伤口愈合和各种组织纤维中起细胞，在伤口的正常愈合中，成肌纤维细胞很短时间的纯在，可以促进收缩，加快结缔组织的生长，但是在纤维化病变的组织中，成肌纤维细胞却不能按时的从病变的地方退出来，导致细胞外的基质持续过量分泌，造成组织结构的重塑，最终功能衰竭，这种特征
22、是组织的纤维化22，23。肌动蛋白作为一个重要的肌肉细胞收缩的蛋白，也是构成细胞骨架的主要成分，其表达量的多少能直接反应成肌纤维细胞的分化、增值及凋亡情况，而凝溶胶蛋白又在肌动蛋白纤丝聚合及解聚的动态变化中发挥重要的调节作用，因此研究凝溶胶蛋白对成肌纤维细胞的功能性作用具有重要的理论意义，可通过分子生物学技术阻断其分化、增殖的信号通路及基因转录，通过药物或重组蛋白促进成肌纤维细胞的凋亡，抑制其分化和增殖，促其恢复转化前细胞表型，从而阻断纤维化进程，根治组织纤维化疾病24。这些问题的解决，对于在分子的水平中预防并且治疗人类某些疾病有重要理论意义，而且通过研究凝溶胶蛋白对肿瘤细胞的影响，还可以开发
23、新的抗癌药物和抗癌的食品，在人类与肿瘤作斗争的过程中发挥重要作用。在本实验中，通过在培养的胃癌细胞中加入凝溶胶蛋白，以MTT比色法和荧光染色法来观察其对胃癌细胞生长起到的影响。1材料和方法参考文献1韩晓曦，王继红，李庆伟凝溶胶蛋白的结构与功能J中国生物化学与分子生物化学报，2007，23（5）3313372LEEWM，GALBRAITHRMTHEEXTRACELLULARACTINSCAVENGERSYSTEMANDACTINTOXICITYJNENGLJMED，1992，326133513413YINHL，STOSSELTPCONTROLOFCYTOPLASMICACTINGELSOLTRA
24、NSFORMATIONBYGELSOLIN，ACALCIUMDEPENDENTREGULATORYPROTEINJNATURE，1979，2815835864SNABESMC，BOYDAE，BRYANJDETECTIONOFACTINBINDINGPROTEINSINHUMANPLATELETSBY125IACTINOVERLAYOFPOLYACRYLAMIDEGELSJJCELLBILO，1981，90（3）8098125HARRISHE，BAMBURGJR，WEEDSAGACTINFILAMENTDISASSEMBLYINBLOODPLASMAJFEBSLETT，1980，121（1）17
25、51776MCGOUGHAM，STAIGERCJ，MINJK，ETALTHEGELSOLINFAMILYOFACTINREGULATORYPROTEINSMODULARSTRUCTURES，VERSATILEFUNCTIONSJ，FEBSLETT，2003，552（23）75817王旭涛，张新超凝溶胶蛋白和危重病JCHINESEGENERALPRACTICE，2009，12（11）208820918SILACCIP，MAZZOLAIL，GAUCIC，ETALGELSOLINSUPERFAMILYPROTEINSKEYREGULATORSOFCELLULARFUNCTIONSJCELLMOLLI
26、FESCI，2004，611920261426239倪晓光凝溶胶蛋白的结构和功能及其抑制肿瘤的作用J实用癌症杂志，2007，22110510710汪勇沛，詹永乐日本血吸虫凝溶胶蛋白基因在虫体不同发育阶段的转录水平分析上海畜牧兽医通讯，2010，1484911潘有福，王新宇，张大伟，等烟草花粉母细胞减数分裂前期肌动蛋白的免疫细胞化学定位J实验生物学报，2000，33327328112CUNNINGHAMCC,STOSSELTP,KWIATKOWSKIDJENHANCEDMOTILITYINNIH3T3FIBROBLASTSTHATOVEREXPRESSGELSOLINJSCIENCE,1991,
27、25149981233123613CHELLAIAHM,KIZERN,SILVAM,ETALGELSOLINDEFICIENCYBLOCKSPODOSOMEASSEMBLYANDPRODUCESINCREASEDBONEMASSANDSTRENGTHJJOURNALOFCELLBIOLOGY,2000,148466567814FERJANII,FATTOUMA,MACIVERSK,ETALADIRECTINTERACTIONWITHCALPONININHIBITSTHEACTINNUCLEATINGACTIVITYOFGELSOLINJBIOCHEMJOURNAL,2006,396346146
28、815孟宪敏，曹慧青，王震等NELIN的肌动蛋白结合特性及与其相互作用蛋白质的筛选J科学通报，2004，49（21）2173217716江奇峰，蔡绍皙，晏小清，等钙调蛋白结合蛋白及其磷酸化对癌细胞迁移能力的影响研究J生物化学与生物物理进展，2010，37332633617徐国恒细胞骨架肌动蛋白纤维J生物学通报，2005，4024318倪晓光凝溶胶蛋白的结构和功能及其抑制肿瘤的作用J实用癌症杂志，2007，22110510719TANAKAM,MULLAUERL,OGISOY,ETALGELSOLINACANDIDATEFORSUPPRESSOROFHUMANBLADDERCANCERJCANC
29、ERRES,1995,5515322820PHILCHENKOVAACASPASESASREGULATORSOFAPOPTOSISANDOTHERCELLFUNCTIONSJBIOCHEMISTRYMOSC，2003，68436537621MEJILLANOM,YAMAMOTOM,ROZELLEAL,ETALREGULATIONOFAPOPTOSISBYPHOSPHATIDYLINOSITOL4,5BISPHOSPHATEINHIBITIONOFCASPASES,ANDCASPASEINACTIVATIONOFPHOSPHATIDYLINOSITOLPHOSPHATE5KINASESJJBIO
30、LCHEM,2001,27631865187222QIAOH,KOYARC,NAKAGAWAK,ETALINHIBITIONOFALZHEIMERSAMYLOIDBETAPEPTIDEINDUCEDREDUCTIONOFMITOCHONDRIALMEMBRANEPOTENTIALANDNEUROTOXICITYBYGELSOLINJNEUROBIOLAGING,2005,26684985523高绪霞，黄海长，李晓玫成肌纤维细胞在纤维化过程中的作用及其调控J生理科学进展，2007，381788024胡永斌，曾庆富，彭劲武，等二氧化硅影响人肺成纤维细胞平滑肌肌动蛋白表达的实验研究J中华劳动卫生职业
31、病杂志，2006，24952352525YUKIOOHTSUKA,HIROKINAKAE,HIROSHIABE,ETALFUNCTIONALCHARACTERISTICANDTHECOMPLETEPRIMARYSTRUCTUREOFASCIDIANGELSOLINJBIOCHIMICAETBIOPHUSICAACTA,1998,13832219231本科毕业设计（20_届）凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响目录0引言21材料和方法311凝溶胶蛋白的NI柱纯化312SDSPAGE电泳分析纯化情况313培养基的配置4131准备和安装过滤器5132合成培养基的配制5133小牛血清的处理5134生长培养基的配
32、制514细胞培养515MTT法测定凝溶胶蛋白对癌细胞的生长影响5151MTT的配制5152MTT染色与观察616细胞凋亡荧光HOECHST33342/PI双染62操作要点721细胞培养中要注意的事项722MTT法测吸光度7MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检73实验结果和讨论731凝溶胶蛋白的纯化7凝溶胶蛋白纯化电泳图见图1，图中由左至右四个泳道标号为1、2、3、4、5、6，分别为标准电泳732MTT法测凝溶胶蛋白对胃癌细胞的影响8321MTT法测得凝溶胶蛋白处理胃癌细胞原始数据8322根据MTT法测得光照密度计算不同浓度凝溶胶蛋白溶液对胃癌细胞的抑制率933荧光染色
33、法检测凋亡细胞的形态学变化10选取的加入20G/ML凝溶胶蛋白溶液处理的胃癌细胞进行荧光染色实验，在荧光显微镜下可见，随着凝溶胶蛋白给药剂量的增加，呈亮蓝色细胞的比率逐渐增加，并呈剂量依赖关系，提示10致谢错误未定义书签。参考文献12附录错误未定义书签。摘要凝溶胶蛋白GELSOLIN是凝溶胶蛋白超家族的成员之一，是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，许多研究发现凝溶胶蛋白（GELSOLIN）在多种肿瘤中表达明显降低。本实验在培养的胃癌细胞中加入凝溶胶蛋白，通过MTT（34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐）比色法和荧光染色法观察凝溶胶蛋白对胃癌细胞的作用，探究加入凝溶胶蛋白的胃癌细胞生长是否受到了
34、抑制。结果显示，与未加入凝溶胶蛋白培养的胃癌细胞相比，加入凝溶胶蛋白培养的胃癌细胞中出现凋亡期的细胞和已死亡的细胞，表明凝溶胶蛋白对胃癌细胞的生长起到了抑制作用，且加入凝溶胶蛋白的浓度越大，抑制作用越明显。关键词凝溶胶蛋白；肌动蛋白结合蛋白；肌动蛋白；MTT比色法；荧光染色ABSTRACTGELSOLINISONEOFMEMBERSOFTHEGELSOLINSUPERFAMILYANDISANIMPORTANTACTINBINDINGPROTEINMANYSTUDIESHAVEFOUNDTHATGELSOLININAVARIETYOFTUMORSWASSIGNIFICANTLYREDUCEDI
35、NTHISSTUDY,GASTRICCANCERCELLSINCULTUREBYADDINGGELSOLINWEREOBSERVEDBYMTT（34,5DIMETHYLTHIAZOL2YL2,5DIPHENYLTETRAZOLIUMBROMIDE）ASSAYANDFLUORESCENTSTAINING,ANDEXPLORETHEADDEDGELSOLINWHETHERGASTRICCANCERCELLGROWTHWASINHIBITEDTHERESULTSSHOWEDTHATCOMPAREDTOGASTRICCANCERCELLSWITHOUTGELSOLIN,CULTUREDCANCERCE
36、LLSBYADDINGGELSOLINAPPEAREDAPOPTOSISANDDEATH,WHICHINDICATINGTHATGELSOLINONGASTRICCANCERCELLGROWTHINHIBITIONPLAYED,ANDJOINEDTHEHIGHERTHECONCENTRATIONOFGELSOLIN,THEMOREOBVIOUSINHIBITIONKEYWORDSGELSOLINACTINBINDINGPROTEINACTIN；MTTCOLORIMETRYFLUORESCENCEDYEING0引言凝溶胶蛋白是一种普遍存在且进化高度保守的肌动蛋白结合蛋白。细胞能在特定的时间、空间
37、调节肌动蛋白的聚合解聚过程。能与肌动蛋白结合兵调节其聚合解聚作用的一类蛋白统称为肌动蛋白结合蛋白1。目前，在生物界里已经发现几十个种类，凝溶胶蛋白是在其中探究的比较清楚的一个种类。且凝溶胶蛋白最早于1979年2在兔的肺巨噬细胞中发现，证实了凝溶胶蛋白能以钙以来的方式调节肌动蛋白重组的功能，因而将这个蛋白命名为凝溶胶蛋白3。之后，人们在血小板细胞中4和血清中5也发现了此类蛋白。凝溶胶蛋白是细胞骨架蛋白的重要组成成分之一，生物活性和功能多种多样，在诸如细胞运动型、细胞骨架结构动力学重排过程中的信号转导、细胞凋亡的控制，甚至是肿瘤发生过程的调节等方面都发挥着重要作用6,7。凝溶胶蛋白由3个或者6个同
38、源的结构相似的片段组成8。目前，已获得的大多数物种的凝溶胶蛋白有6个相似的结构域。肌动蛋白微丝的排列与组装受到大约100种肌动蛋白结合蛋白的调控。凝溶胶蛋白便是其中之一9。凝溶胶蛋白在多种类型细胞中也均有表达，在胚胎期肌肉表达量最多10。凝溶胶以及家庭的其他切割蛋白，切断蛋白能够结合两种单体和聚合物肌动蛋白11。癌细胞的重要特征包括无序生长和高迁移能力是转移性，而这两个过程都涉及到细胞肌动蛋白骨架的解聚与重排。已报道凝溶胶蛋白在人类多种恶性肿瘤中表达明显降低，其表达水平与肿瘤大小、侵袭性生长等密切相关，如在人膀胱癌中，凝溶胶蛋白在6个膀胱癌细胞系和778的膀胱癌组织中表达缺失和明显降低12。人
39、们对凝溶胶蛋白在肿瘤中表达明显降低的现象进一步进行了深入研究，发现将外源凝溶胶蛋白CDNA全长转入癌细胞系过表达后，可抑制肿瘤细胞的生长，降低肿瘤细胞的集落形成能力和裸鼠致瘤性13,14。重组腺病毒编码的野生型凝溶胶蛋白转入膀胱癌细胞系后可以使细胞停滞于G2/M期，原位膀胱癌动物模型经ADGSN治疗后，肿瘤体积缩小了90，这些实验证据提示凝溶胶蛋白具有明显的肿瘤抑制作用15,16。细胞凋亡过程是半胱天冬酶所激活的，半胱天冬酶是一种在细胞凋亡期间大量出现的细胞核受动器蛋白酶。在活体外的实验环境下，凝溶胶蛋白是良好的CPP3培养基17,18。已知在哺乳动物中共有14种此类蛋白家族的成员，其中半胱天
40、冬氨酸3是细胞凋亡过程中关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的多种关键蛋白，其目标之一就是凝溶胶蛋白19。而且在凝溶胶蛋白基因敲除的小鼠神经元细胞中，缺氧引起的细胞凋亡作用的增强，支持了凝溶胶蛋白能抑制细胞凋亡的假设。磷酸磷脂酰肌醇与凝溶胶蛋白的紧密结合，能够消除由凝溶胶蛋白介导的抑制细胞凋亡的作用，这说明了凝溶胶蛋白抑制凋亡的作用可能主要取决于它构象和与肌动蛋白结合的能力20。凝溶胶蛋白在细胞凋亡的多种病理过程中发挥了一定的作用。比如，在老年痴呆症中，淀粉样肽可以诱导线粒体的机能紊乱和半胱天冬酶的活化，从而之势神经元凋亡21。凝溶胶蛋白可以直接作用在肌动蛋白，对很多生理活动有着重要的影
41、响。伴随着分子遗传学和体外分析技术的发展，对凝溶胶蛋白在各个领域也进行了广泛的试验来进行研究，但是凝溶胶蛋白对肌动蛋白的作用机制和调节作用并没有真正的了解完善。其对肌肉的功能性作用和作用的机制等都需要进行进一步的研究。成肌纤维细胞是主要的伤口愈合和各种组织纤维中起细胞，在伤口的正常愈合中，成肌纤维细胞很短时间的纯在，可以促进收缩，加快结缔组织的生长，但是在纤维化病变的组织中，成肌纤维细胞却不能按时的从病变的地方退出来，导致细胞外的基质持续过量分泌，造成组织结构的重塑，最终功能衰竭，这种特征是组织的纤维化22，23。肌动蛋白作为一个重要的肌肉细胞收缩的蛋白，也是构成细胞骨架的主要成分，其表达量的
42、多少能直接反应成肌纤维细胞的分化、增值及凋亡情况，而凝溶胶蛋白又在肌动蛋白纤丝聚合及解聚的动态变化中发挥重要的调节作用，因此研究凝溶胶蛋白对成肌纤维细胞的功能性作用具有重要的理论意义，可通过分子生物学技术阻断其分化、增殖的信号通路及基因转录，通过药物或重组蛋白促进成肌纤维细胞的凋亡，抑制其分化和增殖，促其恢复转化前细胞表型，从而阻断纤维化进程，根治组织纤维化疾病24。这些问题的解决，不只是在分子的水平中预防并且治疗肿瘤有重要意义，而且通过研究凝溶胶蛋白对肿瘤细胞的影响，还可以开发新的抗癌药物和抗癌的食品，在预防肿瘤，防止癌症的发生上同样意义重大。在本实验中，通过在培养的胃癌细胞中加入凝溶胶蛋白
43、，以MTT比色法和荧光染色法来观察其对胃癌细胞生长起到的影响。1材料和方法材料3000ML锥形瓶，250ML或500ML培液瓶，翻帽塞，饭盒，PH试纸，孔径022M的微孔滤膜，酒精灯，移液枪，离心管。药品NAH2PO4溶液，NACL溶液，IMIDAZOLEPH80，30ACR/BIS，15MOL/LPH88TRIS，05MOL/LPH68TRIS，10SDS，10AP，TEMED，盐酸，无离子水，小牛血清，合成培养基RPMI1640或DMEM，青霉素，链霉素，NAHC03。修哈四氮唑蓝，HOECHST染色试剂盒，胃癌细胞株。仪器滤泵1套，滤器1套，蒸馏器，高压灭菌锅，离心机，磁力搅拌器，XSZ
44、D2型荧光显微镜，BIORAD680型酶标仪，DYY12型三恒电泳仪。11凝溶胶蛋白的NI柱纯化由于重组表达的凝溶胶蛋白是以可溶性的形式存在于细胞质中，所以采用NINTA，在非变性条件下进行分离纯化。具体过程如下1）菌体用LYSISBUFFER（50MMNAH2PO4，300MMNACL，10MMIMIDAZOLE，PH80）悬浮，超声破碎仪破碎后，收集可溶性上清。2）NINTA离心后，用LYSISBUFFER洗涤两次。加入细菌可溶性上清，在冰上轻微混匀1H，使重组蛋白充分地与NINTA相作用。3）12，000G，离心10SEC后，NINTA用WASHBUFFER（50MMNAH2PO4，30
45、0MMNACL，40MMIMIDAZOLEPH80）充分洗涤两次，弃上清。4）12，000G，离心10SEC后，NINTA用ELUTIONBUFFER（50MMNAH2PO4，300MMNACL，250MMIMIDAZOLEPH80）洗涤三次，上清为含有重组蛋白的洗脱液。12SDSPAGE电泳分析纯化情况1）安装玻璃板；2配置分离胶；按照表1中的顺序加入所需的溶液，加完TEMED后聚合反应开始，立刻混匀溶液灌胶。3灌胶；将分离胶灌至两层玻璃板之间的间隙中，注意要给浓缩胶流出一定的空间（齿梳长再加1CM）。然后用吸管在分离胶上覆盖一层异丙醇（丙烯酰胺浓度为10左右）或者是01SDS（丙烯酰胺浓度
46、为8左右）。置于室温或者是37。4聚合完成后（约30MIN），用滤纸将覆盖液吸走，用去离子水清洗凝胶的顶部数次（3次）以去除为聚合的丙烯酰胺。再用滤纸将水吸走。5按照表1中的体积制备浓缩胶。6将浓缩胶直接灌装在聚合好的分离胶上，立即在其中插入一块干净的齿梳，注意不要混入气泡。置于室温或者是37聚合30MIN左右。7聚合后，将齿梳取出，用去离子水将未聚合的丙烯酰胺清洗。表1SDSPAGE电泳的配置TAB1CONFIGURATIONOFSDSPAGEELECTROPHORESIS贮液分离胶（10）浓缩胶（5）30ACR/BIS67ML（335ML）083ML15MOL/LPH88TRIS5ML（2
47、5ML）05MOL/LPH68TRIS126MLWATER79ML（345ML）277ML10SDS02ML（01ML）005ML10AP200L（100L）50LTEMED8L（5L）5LTOTALVOLUME20ML（10ML）5ML8安装电泳装置。9点样。每个样品上样10ML。10电泳。先在凝胶上加8V/CM电压，待染料前沿进入分离胶后将电压调节到15V/CM继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，然后关闭电源。注这里的长度指的是分离胶和浓缩胶的总长。11卸下玻璃板，小心撬开玻璃板，标注凝胶的方向。12考马斯亮蓝染色和脱色将凝胶置于装有考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R2501G，250ML异
48、丙醇，100ML冰醋酸，加650去离子水）大平皿中，摇床上过夜。第二天将凝胶置于脱色液（100ML甲醇，100ML冰醋酸，800ML去离子水）中脱色，第三天来观察结果。将结果在凝胶成像系统上扫描，保存结果。13培养基的配置组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。
49、故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清10。20。131准备和安装过滤器清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径022M的微孔滤膜，用布包装好，15磅20MIN进行高压灭菌处理。在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。用滤泵做正压过滤，压力数字为2。过滤后要检查滤膜是否完好无损。132合成培养基的配制1）去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏去除无机和有机杂质，制3000ML三蒸水。三蒸水应及时使用，如果放置一段时间，则使用前须高压处理15磅20MIN。2）待水温降至1530，加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间24H使之充分溶解。3）配制RPMLL640培养基时应通入适量C02或加入6MOLL盐酸调PH至60左右，这样才能充分溶解。4）加入一定量NAHCO，调节PH至70左右。5）加水至最终体积。6）在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250ML或500ML玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。7）瓶口封好，4冰箱贮存RPMI1640培养基可以20贮存。133小牛血清的处理市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。1）将血清加热至56并保持30MIN，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。2）处理后的血清贮存于4。13
