1、1本科毕业论文系列开题报告生物工程环境废物净化芽孢杆菌的筛选及其代谢特性初步研究一、选题的背景与意义芽孢杆菌是一群需氧或兼性厌氧、G目前发现有G一的并在一定条件下形成芽孢的化能异常杆菌。它们广泛分布于空气、土壤、水及动物肠道中，在各个空间各个领域发挥着自己的作用。芽孢杆菌可制成适宜菌剂掺入饲料作为饲料添加剂喂养家禽家畜，使其分解食物利于消化并可降解代谢的废物，从而起到最大限度地利用资源及最大可能地减少环境污染的作用，还可提高畜禽生产性能及防治疾病。本课题中所用样品来源于自然界中，是包括杂质、细菌的混合样品，要专一地研究其内芽孢杆菌的特性，就需要在混合样品中筛选出单一纯种菌。样品中的菌与猪饲料混
2、合，并进行喂养，喂养过程中，因猪会拱食，从而会把饲料与菌种更充分混合，随着饲料进入消化道内，在肠道内可分解猪进食的食物，并且猪的粪便等代谢物也将与菌混合，从而此菌剂还起到分解代谢废物的作用，从而净化环境。此课题任务主要是分离出此混合菌剂中的芽孢杆菌，并加以纯化，考察其对生物大分子分解代谢的能力，探索其在环境净化过程中的作用机制，为后续混合菌处理环境废物的研究提供一定的基础。其研究结果可以对后续联合菌代谢实验起到一定帮助作用。故而对此课题进行研究。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1从环境样品经过生理盐水溶液中加热煮沸10MIN分离、再划线纯化筛选出芽孢杆菌2菌体的收集、保存及通
3、过菌落形态观察、显微观测、生理生化实验、序列鉴定多方法鉴定菌种3所筛选出芽孢杆菌的代谢特性的研究，包括淀粉水解特性、酪素水解特性、明胶水解特性、油脂水解特性、产吲哚特性、纤维素水解特性、过氧化氢特性。2拟解决的问题1筛选出一株或若干株芽孢杆菌；2对所筛选的菌种进行初步鉴定并保藏；3考察其发酵代谢特性，考察其在环境废物净化中的作用三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1菌种分离纯化及保藏（1）制备样品悬液采用环境样品及菌剂等许多样中取5G，迅速倒入带玻璃珠的45ML无菌水瓶中，震荡5MIN，使菌剂充分扩散，100下恒温处理10MIN，冷却静置，得到菌体悬液。（2）涂布用移液枪吸取100UL菌悬液
4、上清液至2个纤维素培养基（磷酸二氢钠01，硫酸镁005，硫酸铵15，琼脂20，纤维素粉0510，PH值为70）平板中，分别编号一和二，涂布均匀。（3）培养及划线37恒温培养一号和二号纤维素培养基，直至长出长势良好的菌落，观察菌落形态，通过比较选取适当的可疑菌落挑菌，在其它纤维素培养基中划线培养，分别记录好编号，37培养。本步后的结果应该分离得到较多的不同菌株为目标。（4）保藏取划线平板中最后端菌线转接至LB（05酵母抽提物，1蛋白胨，1NACL，15琼脂，PH7678，121高压蒸汽灭菌20MIN）培养基斜面中，37培养至长出长势良好的菌，对应编号，4保存待用。2菌种鉴定（1）转接至生孢培养基
5、在生孢培养基（01蛋白胨，01葡萄糖，007酵母粉，002MGSO47H20，002（NH4）2SO4，01K2HPO43H20,15琼脂，PH7678，121高压蒸汽灭菌20MIN）上转接上述可疑菌种，37培养。（2）肉眼观察肉眼观察其长出菌的菌落特点，比较筛选，描述菌落形态，拍好照片。（3）显微观察3取肉眼筛选后的菌落挑菌分别进行革兰氏染色和芽孢染色各两组，在显微镜下观察，同时注意伴孢晶体是否存在，并拍好照。从而可以筛选出芽孢杆菌。（4）生理生化实验分别配制蛋白胨水培养基（蛋白胨20G，NZCL5G，蒸馏水1000ML，PH调为76，121灭菌20MIN）、葡萄糖蛋白胨水培养基（蛋白胨5G
6、，葡萄糖5G，K2HPO42G,蒸馏水1000ML，调PH为7072，过滤，分装每管10ML，112灭菌30MIN）与糖发酵培养基（蛋白胨水培养基1000ML，16溴甲酚紫乙醇溶液12ML，调PH76，另加20糖溶液（葡萄糖、乳糖、蔗糖）各10ML，按规定方法配制。）吲哚试验将菌接入蛋白胨水培养基，37培养48H，加入34滴乙醚，援数次，静置1MIN，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物的为阳性反应。甲基红试验将菌接入葡萄糖蛋白胨水培养基，37培养48H，将一支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。VP
7、试验将菌接入葡萄糖蛋白胨水培养基中，37培养48H，将另一支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入510滴40KOH，然后加入等量的5萘酚溶液，用力振荡，再放入37温箱中保湿1530MIN，以加快反应速度，若培养物呈红色者，为VP反应阳性。糖发酵培养基试验将菌接入糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、蔗糖）中，37培养2448H，观察颜色变化及气泡产生情况，变色则产酸，气泡产生则产气。3菌种代谢特性（1）淀粉水解试验将灭菌后的淀粉培养基（肉汤蛋白胨琼脂中添加02的可溶性淀粉，分装三角瓶，于121灭菌20MIN备用）冷却到50左右，倒成平板，凝固后，取1824H的纯培养物点于平板上，每皿可点种35个菌株，适温培养24
8、D，形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液（碘片LG，碘化钾2G，蒸馏水300ML，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容），以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验为阳性，否则为阴性。透明圈大小说明水解淀粉能力。4（2）酪素水解试验取5G脱脂奶粉加人到50ML蒸馏水中，另称15G琼脂置于50ML蒸馏水中，将两液分开灭菌；待冷至4550时，将两液混匀倒成平板，即成牛奶平板，过夜。取菌点种于培养皿中，37培养48H，观察菌落周围和下面是否有无色透明圈出现，透明圈的大小说明水解酪素能力的大小。（3）明胶水解试验取1218G明胶加入
9、到100ML牛肉膏蛋白胨液中，水浴锅中将其溶化，不断搅拌。溶化后调PH为7274，121灭菌30MIN。然后取菌接种于培养基中，37培养48H，观察明胶有无液化，液化说明可水解明胶，无液化则不可水解明胶。（4）吲哚试验取蛋白胨10G,NACL5G于1000ML蒸馏水中，调PH为76后121灭菌20MIN得蛋白胨水培养基，取菌点种于培养基中，37培养48H，后在此培养基中加入34滴乙醚，数次，静置1MIN，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。（5）油脂水解试验取蛋白胨10G，牛肉膏5G，NACL5G,香油或花生油10G，16中性红水溶液1ML，
10、琼脂1520G于1000ML蒸馏水中，调PH为72，121灭菌20MIN。取菌点种于培养基，37培养24H，观察菌苔颜色，如果出现红色斑点，则脂肪水解，否则则不水解（6）过氧化氢试验过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。将芽孢杆菌接种于肉汤培养基斜面上，适温培养1824H。取干净的载玻片，在上面滴L滴35的H2O2，挑取L环培养1824H的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡氧气出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接加到菌种斜面上，观察气泡的产生。（7）纤维素水解试验以不溶于水的微晶纤维为唯一碳源纤维试验。将接种了菌种的纤维素酶试验培养基平板，37温箱培养2
11、4H后，取出，观察以微晶纤维为底物的培养基中的纤维素的水解情况（二）技术路线5四、研究的总体安排与进度20105指导老师毕业论文题目下达2010520106进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和实验方案。2010620107实验相关原料、药品的采购和相关仪器安装。2010720113芽孢杆菌的分离鉴定及发酵特性研究的实验阶段及结果的观察记录与分析2011320114完成2篇外文翻译，论文撰写、提交2011420115开题答辩。五、主要参考文献1CLAUSDBERLDEYRCWBERGEYSMANNUALOFSYSTERMATICSBACTERIOLOGYM198621
12、10511402韩延平,杨瑞馥需氧芽孢杆菌分类学研究进展J微生物免疫学进展显微观测现象观察，论文撰写肉眼观测生理生化涂布菌悬液制备鉴定培养甲基红吲哚VP糖发酵菌种保藏淀粉代谢特性酪素明胶油脂吲哚纤维素过氧化氢62001473783黄素芳，朱育菁，刘波,等苏云金芽孢杆菌LSZ9408伴孢晶体的形态特征研究J武夷科学2006137404马丹丹分解纤维素霉菌的分离，纯化与鉴定J价值工程2010161441455陈晓春产乳酸芽孢杆菌分离以及生物学特性研究J中国牧业通讯2006367686王艳萍,陈莹,赵虎山,等一株同型乳酸发酵芽孢杆菌的分离和鉴定N天津轻工业学院学报19961157邹伟,赵玉军，陈晓月
13、,等土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定J四川畜牧兽医2008224258王立，刘利檬，张思雅土壤中苏云金芽孢杆菌的分离纯化与初步鉴定J养殖技术顾问201071191209张国庆，董晓芳，佟建明,等一株益生芽孢杆菌的分离与鉴定J安徽农业科学2010137095709710李荣杰纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化J畜牧与饲料科学2009691211孔庆军，任雪艳，陆江红,等新疆棉花芽孢杆菌的筛选及纯化J安徽农业科学200835154701547612RE布坎南,NE吉本斯伯杰细菌鉴定手册,第8版M北京科学出版社198472975813周德庆微生物学实验手册M上海科学技术出版社19867916314宋
14、大新,范长胜,徐德强,等微生物实验技术教程M上海复旦大学出版社199320626215沈萍,秀容,李广武,等微生物学实验,第3版M北京高等教育出版社1999698916安弋,刘新育，芦鹏,等1株酸性淀粉酶产生菌的鉴定及发酵条件优化M安徽农业科学201041709171117李峰,郭瑞雪,张林普芽孢杆菌属一新种的鉴定N淮北煤炭师范学院学报20052624447718李辉，张国芳，石璐,等耐镉蜡状芽孢杆菌SY的筛选鉴定及其培养条件优化湖北农业科学201061353135519刘桂君,朱婷婷,刘红霞,等清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定J酿酒科技20101313620柏建玲,莫树平,郑婉玲,等地
15、衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的比较J饲料研究200374621吴敏峰,耿秀蓉,祝小,等产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定J饲料工业200620212422黄鹭强，谢必峰，黄建忠,等芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质N云南民族大学学报自然科学版2010429029323李彪，熊焰猪粪中除臭微生物的筛选和鉴定N家畜生态学报20081747624宋峻峰,李彪,王绍辉福邦枯草芽孢杆菌在商品肉鸭养殖中的应用J中国牧业通讯20109343525肖凤平枯草芽孢杆菌在生猪养殖中的应用J今日畜牧兽医201032426HKHERSTAD,BBNESHEIM，TLABIDELUND，ETA1EFECTSOFAPR
16、OBIOTICINTERVENTIONINACUTECANINEGASTROENTERITISACONTROLLEDCLINICALTRIALJJOURNALOFSMALLANIMALPRACTICE20091343827翟继鹏,张金枝枯草芽孢杆菌在养殖业中的应用研究进展J浙江畜牧兽医201037828李野,张小平,张克强,等蜡质芽孢杆菌DLSL2发酵条件探讨及培养基优化微生物学通报N20052454929刘莹，孙荣丹，杨翔华,等5株芽孢杆菌的分离鉴定、拮抗性试验与抑菌效价测定N中国农学通报20065323430贺刚，何力，谢从新,等草鱼肠道一株产纤维素酶的分离纯化及性质研究J水生态学杂志20
17、08610711031范俊娟3株蜡样芽孢杆菌产酶特性的检测J畜牧与兽医20099737532郭兴华益生菌一基础应用M科学技术出版社20021427933李松彪，秦翠丽，张许科等动物微生态制剂的生产及其应用J河南畜牧兽医820011013149毕业论文文献综述生物工程环境废物净化芽孢杆菌的筛选及其代谢特性初步研究摘要通过对芽孢杆菌的菌体特征、分类、芽孢特性进行简单介绍，介绍并比较现有的芽孢杆菌分离纯化及鉴定方法，对芽孢杆菌产酶特性与芽孢杆菌在养殖业及杀虫方面的应用做了简单介绍。关键词芽孢杆菌分离鉴定代谢特性应用芽孢杆菌是一大群需氧或兼性厌氧、G目前发现有G一的并在一定条件下可形成芽孢的化能异常杆
18、菌1。1芽孢杆菌的分类90年代以来，芽孢杆菌的分类已由原来的2个属发展到目前的13个属，130多个种。13个属分别为芽孢杆菌属（72种）、芽孢乳杆菌属（5种）、兼性芽孢杆菌属（1种）、硫化芽孢杆菌属（3种）、耐热芽孢杆菌属（1种）、脂不酸芽孢杆菌属（4种）、类芽孢杆菌属（27种）、喜盐芽孢杆菌属（3种）、短芽孢杆菌属（10种）、解硫胺素芽孢杆菌属（3种）、枝芽孢杆菌属（2种）、需盐芽孢杆菌属（1种）、薄壁芽孢杆菌属（2种）。其中后八个属是1992年到1999年间从芽孢杆菌属中独立出来的新属2。2芽孢杆菌的芽孢芽孢是某些细菌在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休
19、眠体。它们对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在7080时10分钟就死亡，而芽孢在120140还能生存几小时，营养细胞在5苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。21芽孢形态结构不同细菌中，芽孢所处的位置不同有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形或椭圆形。而且时常在芽孢附近产生伴孢晶体3。22芽孢形成一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全如此。决定芽孢形成的根本原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制10芽孢
20、形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。芽孢形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段核物质融合成轴丝状（杆状）。在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁
21、的溃溶而释放出来。23芽孢作用或应用231分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。232科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。233保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。234分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。235生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质
22、毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。3芽孢杆菌的分离纯化方法芽孢杆菌有很多分离纯化方法，各有优劣。31芽孢杆菌的分离方法一般方法为配制完整营养成分比例恰当的分离平板培养基，通过采用梯度稀释涂布平板法进行菌种的分离。4普通方法为配制有一定限定因素的完整营养成分分离平板培养基，仍旧是梯度稀释涂布11平板法分离。如产乳酸芽胞杆菌，则配制酸性培养基PH为55，这种PH条件下，可抑制许多其他杂菌生长，然后再梯度稀释涂布平板法分离得到数量更少的菌落5。除了一般分离方法、普通分离方法外，还可根据其独有特征芽孢而进行分离。上面已经提到，芽孢可耐高温而仍旧存活，普通菌体则不然，据此提出了高温处理菌液而
23、分离出芽胞再促芽孢萌发形成芽孢杆菌的方案。这种方法可先对样品进行分离，方法同上，挑选到单个菌落再在生理盐水中水浴加热一定时间6。也可先对样品进行加热再去分离单菌落，从而再对单菌落有目的有针对性的去鉴定菌种7。两者相比较，在我看来，结果应差不多。但前者难以避免地就要重复多次，有很大的盲目性，可能在分离单菌落时因浓度梯度选择不合适而没有挑出而导致最后结果不如人意，后者则是通过高温而对其内所有菌种进行杀灭仅留其芽孢，再提供适宜的环境使残留下来的芽孢萌发而得到纯种，相对来说优于前者。比较上述一般分离方法、普通分离方法、特殊分离方法这三种分离方法后，很明显的可以看出特殊分离方法，即优先加热杀灭普通菌体，
24、促其芽孢在特定培养条件萌发为菌体更为可靠及简捷，同时也是专门适用于芽孢杆菌分离的方法，有很大的优势。此方法在筛选芽孢杆菌时被很多人采用89。除了以上的盲目的筛选，还可以在特殊分离方法基础上，采用唯一碳源为纤维素的专一培养基进行联合筛选。此种定向分离方法可以为后面纤维素水解试验作成功的保证10。32芽孢杆菌的纯化方法芽孢杆菌的纯化方法与其他菌没有什么太大的不同，如果不纯则可继续用梯度稀释涂布平板法分离再划线纯化或直接进行划线纯化，如连续划线、分区划线11。4芽孢杆菌的鉴定41鉴定方法的比较上面已提到，最近发现至少130种芽孢杆菌，它们彼此之间既有着某些共同的性质，如均可在一定条件下产生芽孢，大多
25、数都为革兰氏阳性菌；但同时却也有着不小的差异，如各个生理生化特性都不尽相同。如果进行菌种鉴定的话，最可靠的还是尽量能做16SRDNA序列分析，比较同源性而鉴定具体为哪种芽孢杆菌，从而可针对性地查出其他的所有特征，如菌落形态、菌种显微形态、生理生化结果等。但考虑到经费消耗不菲，时间耗费太久，并且最根本的是在本实验中对具体菌体要求没12有严格到鉴定出具体种属，仅仅需要确定所筛选菌种为芽孢杆菌以满足课题基本要求即可，所以16SRDNA序列分析不是必须的。在实验室条件下，可以很简单的完成菌落形态的肉眼观察、单个菌的显微观察、以及利用实验室药品配置生理生化培养基进行生理生化实验，通过这些指标已经基本可以
26、确定是否为芽孢杆菌。方法主要参照伯杰细菌鉴定手册第八版12、微生物学实验手册13、微生物学实验技术教程14及微生物学实验15，并按其基本方法进行。42菌种鉴定指标经过多个文献的查看及检察必要性，发现对芽孢杆菌的鉴定主要在以下几个方面。菌落形态包括其形状、表面特征、边缘、光学特征、颜色等方面16。个体形态采用革兰氏染色，然后在光学显微镜下观察细菌的形状；用芽孢染色法在光镜下观察芽孢的形状17生理生化鉴定15进行糖发酵（葡萄糖、蔗糖、乳糖）试验、吲哚试验、甲基红试验、VP试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、酪素水解试验等一系列试验，对其进行鉴定。序列鉴定如果条件允许的话，可做16SRDNA序列分析，
27、比较同源性而鉴定是否为芽孢杆菌18。5芽孢杆菌的产酶研究已分离到的纯种芽孢杆菌的代谢特性，因为生物体的代谢过程就是吸收有机物释放代谢废物过程，其实就是对其一些产酶特性做一些研究，也就是说对生物体摄取的有机物的一些成分的分解及对代谢废物一些成分的分解的研究。芽孢杆菌可产生蛋白酶1920，纤维素酶21、淀粉酶20、脂肪酶22、过氧化氢酶19等等。同时其有不错的除臭功能23，故有些菌很可能没有水解色氨酸产生吲哚的能力，也就是缺乏色氨酸酶，此可考虑为以后重点关注的指标。6芽孢杆菌的应用芽孢杆菌广泛分布于空气、土壤、水及动物肠道中，在各个空间各个领域发挥着自己的作用。61芽孢杆菌在养殖业中的应用芽孢杆菌
28、可制成适宜菌剂掺入饲料作为饲料添加剂喂养家禽24家畜25。芽孢杆菌在养殖业中，可提高畜禽生产性能，防治畜禽疾病26，净化养殖环境。它们可调节消化道微生态平衡，提高畜禽消化能力，提高畜禽免疫力，产生营养素27。13蜡样芽孢杆菌微生态制剂已在养殖业上得到应用28。蜡样芽孢杆菌以孢子状态进入动物消化道后,生长繁殖、支持厌氧菌的生长繁殖,保持肠内微生物与动物之间处于微生态平衡状态,同时参与肠道内的物质代谢,从而达到抗菌、促进生长、提高饲料利用率的作用29。动物的正常新陈代谢过程中，淀粉、脂肪、蛋白质等在体内不能完全的利用，而或多或少有一部分随着粪便进入肠道，不免造成资源的浪费，而且这些有机物在体外的环
29、境下很容易腐败变质，发臭造成环境的污染与破坏。芽孢杆菌如果能对其进行利用，则即能节约资源又可保护净化环境。不少动物体内都缺乏纤维素酶，所以食入体内的植物中的丰富的纤维素都随着粪便排出，纤维素是植物材料的主要成分，是地球极为丰富的可再生资源。纤维素的结构复杂，自然界中在纤维素酶的作用下纤维素可彻底水解成葡萄糖。充分利用这些纤维素又是课题的一个基本内容30。且芽孢杆菌产生的过氧化氢酶可以分解肠道内的过氧化氢生成游离氧，对肠道内的多种病原菌有杀灭作用，如果芽孢杆菌不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，可有效降低血液及粪便中吲哚的浓度，起到净化环境的作用31。而幼仔动物肠道中消化酶的分泌不足消化能力差，而
30、且肠道内的大肠杆菌等腐败菌增多，会产生一些有害物质如吲哚、氨和硫化氢等，这些物质能潜在抑制生长和致癌作用。需氧的芽孢杆菌在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡，它在肠道中短时间定植后，可以消耗大量氧气，维持肠道的厌氧环境，为消化道中的乳杆菌、肠球菌和乳球菌等兼性厌氧菌及拟杆菌等厌氧菌提供更为理想的生长环境，增强肠道对厌氧菌的定植能力3233。参考文献1CLAUSD,BERLDEYRCWBERGEYSMANNUALOFSYSTERMATICSBACTERIOLOGYM1986110511402韩延平,杨瑞馥需氧芽孢杆菌分类学研究进展J微生物免疫学进展,2001,29473783黄素芳,朱育菁,
31、刘波,等苏云金芽孢杆菌LSZ9408伴孢晶体的形态特征研究J武夷科学,2006,22137404马丹丹分解纤维素霉菌的分离，纯化与鉴定J价值工程,2010,42161441455陈晓春产乳酸芽孢杆菌分离以及生物学特性研究J中国牧业通讯,2006,12367686王艳萍,陈莹,赵虎山,等一株同型乳酸发酵芽孢杆菌的分离和鉴定J天津轻工业学院学报,1996,311157邹伟,赵玉军,陈晓月,等土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定J四川畜牧兽医,2008,35224258王立,刘利檬,张思雅土壤中苏云金芽孢杆菌的分离纯化与初步鉴定J养殖技术顾问,2010,127119120149张国庆,董晓芳,佟建明,等一
32、株益生芽孢杆菌的分离与鉴定J安徽农业科学,201017137095709710李荣杰纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化J畜牧与饲料科学,2009,25691211孔庆军,任雪艳,陆江红,等新疆棉花芽孢杆菌的筛选及纯化J安徽农业科学20083635154701547612BUCHANANRE,GIBBONSNE伯杰细菌鉴定手册,第8版M北京科学出版社,198472975813周德庆微生物学实验手册M上海科学技术出版社,19867916314宋大新,范长胜,徐德强,等微生物实验技术教程M上海复旦大学出版社,199320626215沈萍,秀容,李广武,等微生物学实验,第3版M北京高等教育出版社,1
33、999698916安弋,刘新育，芦鹏,等1株酸性淀粉酶产生菌的鉴定及发酵条件优化M安徽农业科学,20103841709171117李峰,郭瑞雪,张林普芽孢杆菌属一新种的鉴定J淮北煤炭师范学院学报,2005,262444718李辉,张国芳,石璐,等耐镉蜡状芽孢杆菌SY的筛选鉴定及其培养条件优化湖北农业科学,2010,4961353135519刘桂君,朱婷婷,刘红霞,等清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定J酿酒科技,2010,151313620柏建玲,莫树平,郑婉玲,等地衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的比较J饲料研究,2003,1374621吴敏峰,耿秀蓉,祝小,等产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定J
34、饲料工业,2006,2720212422黄鹭强,谢必峰,黄建忠,等芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质J云南民族大学学报自然科学版,2010,19429029323李彪,熊焰猪粪中除臭微生物的筛选和鉴定J家畜生态学报,2008,291747624宋峻峰,李彪,王绍辉福邦枯草芽孢杆菌在商品肉鸭养殖中的应用J中国牧业通讯,2010,189343525肖凤平枯草芽孢杆菌在生猪养殖中的应用J今日畜牧兽医,2010,1132426HERSTADHK,NESHEIMBB，LUNDTL，ETCEFECTSOFAPROBIOTICINTERVENTIONINACUTECANINEGASTROENTERIT
35、ISACONTROLLEDCLINICALTRIALJJOURNALOFSMALLANIMALPRACTICE,2009,511343827翟继鹏,张金枝枯草芽孢杆菌在养殖业中的应用研究进展J浙江畜牧兽医20103537828李野,张小平,张克强,等蜡质芽孢杆菌DLSL2发酵条件探讨及培养基优化J微生物学通报,2005,21245491529刘莹,孙荣丹,杨翔华,等5株芽孢杆菌的分离鉴定、拮抗性试验与抑菌效价测定J中国农学通报,2006,225323430贺刚,何力，谢从新,等草鱼肠道一株产纤维素酶的分离纯化及性质研究J水生态学杂志,2008,1610711031范俊娟3株蜡样芽孢杆菌产酶特性
36、的检测J畜牧与兽医,2009,219737532郭兴华益生菌一基础应用M科学技术出版社,20021427933李松彪,秦翠丽,张许科等动物微生态制剂的生产及其应用J河南畜牧兽医,2001,2210131416本科毕业设计（20_届）环境废物净化芽孢杆菌的筛选及其代谢特性初步研究17目录中英文摘要引言11材料和方法211材料2111样品来源2112原料2113仪器设备4114主要培养基及试剂配制412方法5121菌株分离纯化和保存5122菌株最适生长温度与PH测定6123菌株鉴定6124试验菌的代谢特性初步实验6125试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定72结果和分析821菌株筛选822最适生长温度
37、与PH探索9221最适生长温度测定9222最适生长PH测定923菌株的鉴定1024试验菌的代谢特性初步实验10241酪素分解实验10242色氨酸分解实验10243油脂分解实验10244过氧化氢分解实验11245淀粉分解实验1225试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定12251纤维素分解实验12252酪蛋白分解实验133讨论134结论145建议14致谢14参考文献16附录17摘要为探索自然界中芽孢杆菌在环境废物净化方面和有机物分解代谢能力方面的特性。从环境样品中分离并鉴定得到三株实验用芽孢杆菌Y1、Z1、Z2，经过最适生长条件探索后确定三株菌最适生长温度分别为32、32、37，最适生长PH值分别为7
38、、7、75。后在此基础上对其一些产酶特性作了初步的定性与定量探索。主要包括对酪素、色氨酸、油脂、过氧化氢和淀粉代谢的定性实验以及对纤维素、酪蛋白分解特性的定量实验。结果表明，三株菌均可分解油脂、过氧化氢，对色氨酸均无代谢能力，淀粉透明圈比值分别为1823，1168，1826。Y1、Z2菌株纤维素酶活力分别为21034U/G与17370U/G，Z1菌株无分解纤维素能力；Z1、Z2菌株酪蛋白酶活力分别为1115U/G与392U/G，Y1菌株无分解酪蛋白能力。关键词芽孢杆菌分离纯化；代谢特性ABSTRACTTHISSTUDYISTOEXPLOREBACILLUS，ABILITYOFPURIFYING
39、ENVIRONMENTALWASTEANDDECOMPOSINGORGANICMATTERTHREESTRAINSOFBACILLUS,NAMEDASY1,Z1ANDZ2WEREOBTAINEDANDIDENTIFIED,WHICHWEREISOLATEDFROMENVIRONMENTALSAMPLESAFTEREXPLORINGTHEOPTIMALGROWTHCONDITIONS,THEOPTIMUMGROWTHTEMPERATUREOFTHETHREESTRAINSOFBACTERIAWAS32,32,37,THEOPTIMUMGROWTHPHVALUESWERE7,7,75ONTHISB
40、ASIS,PRELIMINARYQUALITATIVEANDQUANTITATIVETOEXPLORETHECHARACTERISTICSOFITSENZYMEPRODUCTIONMAINLYINCLUDINGCASEIN,TRYPTOPHAN,GREASE,HYDROGENPEROXIDE,STARCHMETABOLISMQUALITATIVEEXPERIMENTSANDCELLULOSE,CASEINDECOMPOSITIONCHARACTERISTICSQUANTITATIVEEXPERIMENTSRESULTSSHOWTHATTHREESTRAINSOFBACTERIACANBEDEC
41、OMPOSEDOILANDHYDROGENPEROXIDE,BUTEXCEPTTRYPTOPHANTHERATIOOFSTARCHCLEARZONESEPARATELYARE1823,1168,1826CELLULASEACTIVITYOFY1,Z2STRAINSSEPARATELYARE21034U/GAND17370U/G,Z1STRAINSBEWITHOUTABILITYTOBREAKDOWNCELLULOSECASEINPROTEASEACTIVITYOFZ1,Z2STRAINSSEPARATELYARE1115U/GAND392U/G,Y1STRAINHAVENOABILITYTOB
42、REAKDOWNCASEINPROTEINSKEYWORDSBACILLUS，PURIFICATION，METABOLICCHARACTERISTICS2引言芽孢杆菌是一群需氧或兼性厌氧、G目前发现有G一的并在一定条件下可形成芽孢的化能异常杆菌12。它们广泛分布于空气粉尘3、土壤4、水5及动物肠道6中，在各个空间各个领域发挥着自己的作用。A芽孢杆菌的分类90年代以来，芽孢杆菌的分类已由原来的2个属发展到目前的13个属，130多个种。13个属分别为芽孢杆菌属（72种）、芽孢乳杆菌属（5种）、兼性芽孢杆菌属（1种）、硫化芽孢杆菌属（3种）、耐热芽孢杆菌属（1种）、脂不酸芽孢杆菌属（4种）、类芽孢杆
43、菌属（27种）、喜盐芽孢杆菌属（3种）、短芽孢杆菌属（10种）、解硫胺素芽孢杆菌属（3种）、枝芽孢杆菌属（2种）、需盐芽孢杆菌属（1种）、薄壁芽孢杆菌属（2种）。其中后八个属是1992年到1999年间从芽孢杆菌属中独立出来的新属2。B芽孢杆菌的芽孢芽孢是某些细菌在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭球形的休眠体。它们对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在7080时10MIN就会死亡，而芽孢在120140情况下还能生存几个小时，营养细胞在5苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15D，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽
44、孢是抵抗外界不良环境的休眠体。一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全如此。决定芽孢形成的根本原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制芽孢形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。芽孢形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面变化。芽孢作为芽孢杆菌的特有结构，因其特点可有很多用途。如其可用于分类鉴定，是因为不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，可以作为分类鉴定的依据或参考。可用于科研材料，由于芽孢独特的产生
45、方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。还可以用作保存菌种和分离菌种，因芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料；而且芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离，将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。其他方面还有些可用于生物杀虫，有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。C芽孢杆菌的产酶芽孢杆菌可产生多种多样的酶，如蛋白酶78、纤维素酶9、淀粉酶8、脂肪酶10、过氧化氢酶7等等。同时其有不错的除臭功能1
46、1，故有些菌很可能没有水解色氨酸产生吲哚的能力，也就是缺乏色氨酸酶导致有除臭功能。D芽孢杆菌的应用芽孢杆菌可制成适宜菌剂掺入饲料作为饲料添加剂12喂养家禽13家畜6。3芽孢杆菌在养殖业中，可提高畜禽生产性能，防治畜禽疾病14，净化养殖环境。它们可调节消化道微生态平衡，提高畜禽消化能力，提高畜禽免疫力，产生营养素15。蜡样芽孢杆菌微生态制剂已在养殖业上得到应用16。蜡样芽孢杆菌以孢子状态进入动物消化道后,生长繁殖、支持厌氧菌的生长繁殖,保持肠内微生物与动物之间处于微生态平衡状态,同时参与肠道内的物质代谢,从而达到抗菌、促进生长、提高饲料利用率的作用17。动物的正常新陈代谢过程中，淀粉、脂肪、蛋白
47、质等在体内不能完全的利用，而或多或少有一部分随着粪便进入肠道，不免造成资源的浪费，而且这些有机物在体外的环境下很容易腐败变质，发臭造成环境的污染与破坏。芽孢杆菌如果能对其进行利用，则即能节约资源又可保护净化环境。不少动物体内都缺乏纤维素酶，所以食入体内的植物中的丰富的纤维素都随着粪便排出，纤维素是植物材料的主要成分，是地球极为丰富的可再生资源。纤维素的结构复杂，自然界中在纤维素酶的作用下纤维素可彻底水解成葡萄糖。充分利用这些纤维素又是课题的一个基本内容18。且芽孢杆菌产生的过氧化氢酶可以分解肠道内的过氧化氢生成游离氧，对肠道内的多种病原菌有杀灭作用，如果芽孢杆菌不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚
48、，可有效降低血液及粪便中吲哚的浓度，起到净化环境的作用19。而幼仔动物肠道中消化酶的分泌不足消化能力差，而且肠道内的大肠杆菌等腐败菌增多，会产生一些有害物质如吲哚、氨和硫化氢等，这些物质有潜在抑制生长和致癌的作用。需氧的芽孢杆菌在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡，它在肠道中短时间定植后，可以消耗大量氧气，维持肠道的厌氧环境，为消化道中的乳杆菌、肠球菌和乳球菌等兼性厌氧菌及拟杆菌等厌氧菌提供更为理想的生长环境，增强肠道对厌氧菌的定植能力2021。E本论文的研究目标本论文通过从从自然界即包括杂质与芽孢杆菌的混合样品中专一地分离出芽孢杆菌。通过一系列的产酶实验及酶活性测定实验来考察其对生物大分
49、子分解代谢的能力和探索其在环境净化过程中的作用机制，从而使该菌株产生实际意义。1材料和方法11材料111样品来源本实验的样品有两个，从舟山猪舍饲养槽得到的混合样品编为1号样品，从宁大旧体育场周围提取的泥土样品编号为2号样品。112原料试剂出厂地址酵母抽提物生化试剂国药集团化学试剂有限公司蛋白胨鱼粉生化试剂国药集团化学试剂有限公司氯化钠（NACL）分析纯宜兴市第二化学试剂厂琼脂粉细菌级杭州微生物试剂有限公司葡萄糖C6H12O6分析纯广东省化学试剂工程技术研究开发中心4七水合硫酸镁MG2SO47H20分析纯上海化学试剂公司硫酸铵NH42SO4分析纯上海试四赫维化工有限公司三水合磷酸氢二钾K2HPO43H20分析纯上海化学试剂公司脱脂纯奶粉食品级河北三元牛奶粉石蕊国药集团化学试剂有限公司乙醚C4H10O分析纯杭州双林化工试剂厂对二甲基氨基苯甲醛C9H11NO分析纯上海化学试剂公司95乙醇CH3CH2OH杭州双林化工试剂厂浓盐酸HCL分析纯中国杭州化学试剂有限公司牛肉膏生化试剂上海化学试剂公司花生油食品级山东省烟台市鲁花花生油3氨基7甲氨基2甲基吩嗪盐酸盐（中性红）上海化学试剂公司过氧
