1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程乳酸菌高密度培养技术研究一、选题的背景与意义乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品，赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群，而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用，也是传统食品的发展方向。浓缩发酵剂具有活力高、体积小、携带使用方便的特点，可直接用于发酵制品生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化和污染。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养。高密度培养不仅可减少培养体积，还可以缩短生
2、产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品市场竞争力。因此，通过实验研究探索乳酸菌的高密度培养技术具有重要意义。本实验在优化培养条件起始PH值、接种量、培养时间和培养基成分的基础上，采用高密度培养方法，对乳酸菌高密度培养进行了初步的探索，为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的主要内容1优化乳酸菌高密度培养的条件2优化培养基成分2高密度培养拟解决的问题1单因素优化中缓冲盐及生长因子的选择和量的确定2如何在乳酸菌培养过程中进行分批补料3选择何种成分进行补料4补料量的确定三、研究的方法与技术路线方法1单因素法确定单一因素的优化值2正交试验得出乳酸菌高
3、密度培养的最佳培养条件3补料分批培养法进行高密度培养技术路线菌种活化接种单因素法优化培养条件正交试验补料分批培养四、研究的总体安排与进度201010120101131查阅资料，完成开题报告、文献综述、开题答辩；20101212011215两篇外文翻译，实验准备工作；20112162011420试验操作阶段，处理实验数据，论文初稿；20114212011510整理数据，书写论文，完成预答辩。五、主要参考文献1熊涛,徐立荣,范镭等蔬菜发酵专用乳酸菌的菌体高密度培养J食品科学,200713453492李莹,周剑忠,董明盛乳酸菌高密度培养技术研究进展J乳品加工,2008344463熊晓辉,熊强,陆利霞
4、乳酸菌发酵剂高密度培养的研究J中国调味品,2004517214吴祖芳,翁佩芳,楼佳瑜乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究J食品与发酵工业,2009,3510595陆利霞,熊强,熊晓辉乳酸杆菌半连续式高密度培养的研究J研究与探索,20051247496谷长维,李太元,常巧呈等犬源乳酸菌高密度培养条件的优化J中国微生态学杂志,2007,1932512557吕嘉沥,丁博,浓缩乳酸菌发酵剂的浓缩培养的研究进展J食品科技,20076588叶明,李太元,李艳茹等蝌蚪元乳酸菌的人工高密度培养条件的优化J动物生产,2009,45550529郝林,李平兰,刘子宇德氏乳杆菌保加利亚种高密度培养的研究初探J
5、现代食品科技,200624810李平兰补料分批法高密度培养德氏乳杆菌保加利亚亚种S1J中国乳品工业,2007,3514911EGONBECHHANSENCOMMERCIALBACTERIALSTARTERCULTURESFORFERMENTEDFOODSOFTHEFUTUREJINTJFOODMICROBIO,2002,7811913112DCHARALAMPOPOULOS,SSPANDIELLA,CWEBBEVALUATIONOFTHEEFFECTOFMALT,WHEATANDBARLEEXTRACTSONTHEVIABILITYOFPROBIOTICACIDBACTERIUNDERACID
6、CONDITIONSJINTJFOODMICROBIO2003,8213314113吕兵,张国农乳酸菌发酵剂浓缩培养的研究J中国乳品工业,2001,2937914山丽杰,田洪涛,贾英民等浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技术关键问题的讨论J中国乳品工业,2002,305666915RIESENBERGD,GUTHKERHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFMICROORGANISMSAPPLMICRBIOLBIOTECHOL19995142243016柏建玲,莫树平,郑婉玲等乳酸菌增菌培养基的营养因子优化J食品与发酵工业,2007,332798117黄良昌,吕晓玲,姚秀玲保加利亚乳
7、杆菌浓缩培养的研究J中国乳品工业,2002,301121518李艾黎,代敏,霍贵成浓缩型乳酸菌发酵剂的工业化生产J中国乳品工业,20056505319谭欢,周传云制备浓缩型乳酸菌发酵剂的研究进展J现代食品科技,2005,21411211420RIESENBERGD,GUTHKERHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFMICROORGANISMSAPPLMICRBIOLBIOTECHOL1999,5142243021CHIARAS,VINCENZO,VIVIEN,ETALHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFPROBIOTICSANDLACTICACIDPRO
8、DUCTIONBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,2002,82221322222陈坚,李寅,毛英鹰等培养模式对重组大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响J生物工程学报,1998,14445245523周剑忠,董明盛,江汉湖等液芯包囊乳酸菌细胞释放及浓缩培养的初步研究J食品工业科技,2004,255707224刘云鹤,何煜波肉品发酵剂增殖培养基及培养条件的研究湖南农业大学学报自然科学版,2002,28323423625史嫒英,肖冬光酸奶发酵剂高浓度培养的研究J天津轻工业学院学报,19991202526贺稚非,向瑞玺,李洪军等泡菜活性直投式乳酸菌发酵剂的研究J食品科学,2
9、006,27819119727刘振民,骆承庠乳酸菌发酵剂生产工程技术J食品与发酵工业,2000,2646872毕业论文文献综述食品科学与工程乳酸菌高密度培养技术的研究现状摘要高密度培养技术一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的。本文重点介绍了影响乳酸菌高密度培养的因素及高密度培养原理、方法，并对高密度培养的前景进行了展望。关键字乳酸菌；高密度；影响因素；培养方法。ABSTRACTTHEHIGHDENSITYCULTURETECHNOLOGYGENERALLYREFERSTOTHESTATEOFGROWTHORCULTURETECHNI
10、QUEOFDENSITYOFMORETHAN10TIMESMORETHANCONVENTIONALCULTURE，WHICHIMPROVESTHECELLDENSITYFERMENTATIONTHISPAPERFOCUSESONFACTORSTOAFFECTHIGHDENSITYCULTUREANDHIGHDENSITYCULTUREPRINCIPLE、METHODS,ANDHIGHDENSITYCULTIVATIONPROSPECTKEYWORDSLACTOBACILLUSHIGHDENSITYINFLUENTIALFACTORCULTUREMETHOD乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类
11、无芽孢、革兰染色阳性细菌的总称。乳酸菌在肠道内的大量繁衍可促进并提高人体的全身免疫能力，研究认为酸牛奶中含大量乳酸菌与常饮酸牛奶的人极少患糖尿病、心血管病、肥胖症有关。在我国，伴随着人民生活水平的提高，对酸奶的消费呈现出逐年增加的势头，这也就对酸奶发酵剂的性能和品质提出了新的要求。1乳酸菌高密度培养的意义乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品，赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群，而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用，也是传统食品的发展方向1,2。浓缩发酵剂1,3,4具有活力高、体积小、携带使用
12、方便的特点，可直接用于发酵制品生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化和污染。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养1，4。高密度培养技术HIGHCELLDENSITYCULTURE,HCDC，即高密度发酵技术，一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的5。高密度培养不仅可减少培养体积，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品市场竞争力4。2影响乳酸菌高密度培养的因素影响高密度培养的因素非常多，如菌体生长所需的营养物质、培养过程中生长
13、抑制物的积累、溶解氧浓度、培养温度、培养液的PH值、补料方式及培养液流变学特性等67。然而高密度培养的工艺是比较复杂的，仅仅对营养源、溶氧浓度、PH值、温度、接种量等影响高密度培养的因素单独地加以考虑是远远不够的，因各种因素之间存在协同和（或）抵消作用，需加以综合考虑并对培养条件进行全面的优化。乳酸菌培养过程中生长不仅与培养方式有关，也与所用培养基有直接关系。限制细菌高密度培养的主要因素包括培养基组成、培养温度、PH值及代谢产物或副产物的积累等8。21培养基9培养基为微生物的生长繁殖和积累代谢产物提供营养基质。在进行浓缩培养时，培养基除了要提供微生物生长所必需的碳源、氮源、生长因子等物质外，必
14、须对培养基进行优化，筛选出增殖培养基，以求能获得最大的生物量。筛选时通常要在培养基（如MRS培养基等）的基础上再添加碳源、氮源、生长因子等，最后通过测定菌体数来确定增殖培养基的成分。常添加的碳源有乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及复合糖葡萄糖等，添加的氮源有普通蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠等，常添加的生长因子有番茄汁、玉米浆等，最后通过正交试验来确定添加的物质和量。22温度9温度是控制微生物代谢的重要参数。在一定范围内随着温度的上升，酶的活性会提高，细胞的生物化学反映速度和生长速率会加快，同时营养物质和代谢产物的溶解度提高，细胞膜的流动性增大，有利于营养物质的吸收和代谢产物的排出。每种微
15、生物都有不同的最适生长温度，同种微生物在不同的培养基中生长的最适温度也有差别。因此在其他条件一定的情况下，选择一个适宜的培养温度，对于浓缩培养有重要意义。乳酸菌的最适生长温度一般随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段变化而改变，不同的乳酸菌最适生长的温度范围会有一定的差异。乳酸菌的最适生长温度一般在374210。23PH值11乳酸菌生长的最适PH值为6570，乳酸菌细胞在生长过程中产生大量有机酸，酸积累到一定程度就会抑制细胞的生长。因此，提高培养基的缓冲能力，控制培养基PH值的变化幅度，对细胞的积累有较大的调节作用。PH值的变化是菌体产酸或产碱等生化代谢反应的综合结果，也是确定补料速率的
16、依据，把两者紧密结合起来可实现高密度培养发酵过程的优化。在自动流加新鲜培养基的高密度培养模式中，通过不断补料的方法，可成功调节PH值使菌体达到高密度。24代谢产物11代谢产物的调控是研究高密度培养的一种重要手段。依据对生长曲线的分析，导致微生物停止生长的主要原因之一是代谢产物的积累和反馈抑制作用。高密度培养过程中，乳酸菌细胞在电子传递链和三羧酸循环代谢中都会产生乳酸及其它代谢产物。其中对菌体生长影响最大的就是乳酸。当分批培养中的细胞密度超过一定浓度时，菌体生长会变得缓慢甚至停止。这是由于发酵过程中乳酸盐等盐类对细菌的生长产生了负面影响，抑制了蛋白质合成代谢副产物的积累。目前，国外已有研究希望通
17、过代谢工程改变乳酸菌的代谢途径，从而降低抑制产物的生成。3高密度培养的原理从理论上来讲，只要营养物充足、无生长抑制物积累，微生物的生长在空间上不受限制时微生物将持续生长，即导致微生物生长减速或停止的原因是营养物的枯竭或生长抑制物的积累10。若能克服这两方面的影响，就可以获得较高的菌体密度。在乳酸菌的高密度培养过程当中，主要的限制因素就是代谢产物的影响。在乳酸菌的培养过程中，乳酸菌通过发酵作用对碳源进行分解代谢产生乳酸，其代谢途径分为三类，即同型发酵途径，异型发酵途径和双歧途径。以碳源为葡萄糖为例，1MOL葡萄糖在同型发酵中产生18MOL的乳酸，异型发酵产生08MOL乳酸。乳酸菌对其他糖类（乳糖
18、、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖和戊糖等）发酵也主要产生乳酸12。在发酵过程中一般以同型发酵为主，大约有80的糖会转化成乳酸，大量的乳酸对发酵液的PH又会产较大的影响，当培养液的PH值降低到40以下时，就会对菌体的生长产生较严重的抑制作用。因此，在乳酸菌的浓缩培养过程中，就必须通过追加营养物质，排除代谢产物，调节PH值来解除代谢产物乳酸对菌体生长的抑制作用，获得高浓度的菌体培养物。4高密度培养方法乳酸菌在培养过程中能分解培养基中的糖类而产生以乳酸为主的有机酸。由于代谢产物的积累会抑制菌体生长，采用常规方法培养时，其培养液中的活菌数只能达到107108CFU/ML13。实现微生物（益生菌）菌
19、体高密度培养的核心是保证合理的营养供给、及时去除代谢产物、保持稳定的比生长速率。高密度培养的主要途径有缓冲盐法、化学中和法、透析培养、细胞循环培养、膜过滤培养、补料分批培养、微囊化培养等。41缓冲盐法缓冲盐法是向乳酸菌的培养液中加入对乳酸菌的生长无影响或者有促进作用的缓冲盐，以调节和控制培养液的酸度在一定范围内不升高，促进乳酸菌的生长繁殖。通常所选用的缓冲盐有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和CACO3等，也有研究者直接利用乳本身蛋白质和磷酸盐。美国和意大利已成功研究了向培养基中添加缓冲盐的专利方法。国内学者对此亦有研究，刘云鹤等添加一定量的缓冲剂对发酵乳杆菌和植物乳杆菌细胞的积累有显著的促进作用，3
20、种缓冲盐中，磷酸氢二钾的促进作用最为明显，柠檬酸三铵次之，乙酸钠最弱14。吕兵等15使用质量分数为05的K2HPO4作为缓冲盐进行培养，使培养液中乳酸菌的活菌数达到589109CFUML，较起始培养基的活菌数提高了45倍。目前，研究较多的是缓冲盐法，浓缩培养的效果也比较明显。然而由于缓冲盐的缓冲作用有一定的范围，因此菌液不能达到较高的菌体浓度，另外高盐浓度也会对菌体的生长产生抑制作用。42化学中和法乳酸菌在生长繁殖过程中，代谢乳糖产生乳酸。随着酸度的升高，PH值的降低，菌体生长受到抑制，通过向发酵液中流加碱液从而将发酵过程当中产生的过量乳酸中和，解除PH值的抑制，维持发酵液的PH值在一个恒定的
21、范围内，以促进乳酸菌的生长。由于化学中和法极大地促进了乳酸菌的生长，并且该法简便易行，最终获得高密度的菌体，因此是目前应用最广泛的一种方法。常用的中和剂有NAOH、氨水、NA2CO3等。其中氨水的效果最好，但在中和培养过程中，随着乳酸铵或乳酸钠等盐浓度的不断增加，达到一定水平时仍会抑制菌体的生长繁殖，最高密度仅能到1091010个/ML16。吕兵等人利用质量分数为30的NA2CO3溶液作为中和剂进行浓缩培养，将PH值控制在63，培养67H后，乳酸菌浓度达到589109CFU/ML17。43透析培养通过半透膜有效地去除培养基中有害的低分子量代谢产物，同时向培养液提供充足的营养物质的培养方式称为透
22、析培养。OSBORNE在1977年首次将透析用于乳酸杆菌培养，得了1011个/ML的高菌体密度，相当于3040G（DCW/L）18。透析培养仪器一般有培养罐、培养基储存罐和透析模块三部分组成。透析模块主要有两个作用，一是将生长抑制物质通过透析模块排出培养罐，二是使营养物质从培养基储存罐中的营养物质进入培养罐中19。透析培养主要发展了营养分配补料策略，即将培养基分为浓缩营养液和无机盐溶液2部分，浓缩营养液直接加到培养室，无机盐溶液则加到透析室以维持渗透压。采用这种培养方式，可以增加生物量的积累，大大降低营养物质的损失。与微滤和超滤相比，在透析过程中透析膜不会被阻塞，并且可以长时间维持其渗透性能2
23、0。但是，由于反应器本身需要内嵌的透析膜或外在的透析组件、辅助泵及其它发酵罐等，透析培养的设备投资较大。44细胞循环培养通过某种方式将细胞保留在培养罐中加以循环利用的培养方式就是细胞循环培养。一般通过沉降、离心和膜过滤3种方式进行2122。膜过滤培养是连续培养和超滤的结合。它是在普通培养装置上附加一套膜过滤系统，用泵使培养液流过过滤器，将菌体截留，滤液流出培养体系，并通过液面计控制流加泵添加新鲜的培养基，维持培养基体积不变。细胞循环可以除去抑制性代谢产物，低浓度的培养基可以得到较高的细胞密度并且可以就地分离产物，有利于下游操作。45膜过滤培养膜过滤培养是连续培养和超滤的结合，它是在普通培养装置
24、上附加一套膜过滤装置。用泵使培养液流过过滤器将菌体截留，滤液包括培养过程中的产物一起流出培养体系，并通过液面计控制流加泵添加新鲜的培养基，维持培养基体积不变。膜过滤培养过程中乳酸被完全去除，是目前效果最好的浓缩培养方法。CHIARA曾经使用膜过滤培养法对保加利亚乳杆菌进行培养，获得的细胞干质量达到280G/L23。46补料分批培养补料分批发酵在微生物高密度培养中应用较多，特别是应用在重组大肠杆菌的高密度培养中技术已相当成熟24。在补料分批培养过程中，高密度发酵成功的关键是补料策略的选择。它是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代
25、谢产物的生产时间延长的培养方式。因此，补料分批培养（又称流加培养）比其它培养方法具有更多的优越性。贺稚非等6综合运用缓冲盐法及补料培养法，使培养液中乳酸菌的活菌数达到724109CFU/ML。47乳酸菌微囊化培养乳酸菌液芯微囊化培养是固定化技术中的一种，它是用一层亲水性半透膜将细胞包围在珠状的微囊内，通过连续培养，在囊内可以达到很高的细胞密度。传统的乳酸菌培养采用游离细胞悬浮培养，生产效率低，细胞密度低，细胞分离难，成本高。微囊化乳酸菌避免了传统悬浮发酵剂的缺点和限制，细胞密度可超过1010个/G，从培养基中分离细胞不需经过超滤或冷冻离心，而用普通的离心或过滤就可进行，因此大大降低了生产成本。
26、另外，微囊化细胞技术可以防止氧对双歧杆菌等好氧菌的伤害，防止噬菌体的感染，在冷冻过程中有很好的保护作用，用于浓缩乳酸菌生产效果比较显著。周剑忠等人对液芯包囊乳酸菌（嗜热链球菌保加利亚乳杆菌11）进行了壳聚糖包膜，在MRS中连续培养40H，囊内细胞密度已高达661010个/G25。5乳酸菌高密度培养前景及展望目前，我国超浓缩酸奶发酵剂的制备技术还不完善，商业化超浓缩酸奶发酵剂国内还没有厂家生产，作为发酵剂制备的核心技术，乳酸菌高密度培养的研究及应用势在必行。随着市场需求的日益扩大，乳酸菌高密度培养技术必将广泛地应用于乳酸菌发酵剂的生产中。如此，不仅能改进乳酸菌发酵的工艺，提升其现代化发酵进程，而
27、且对增加单位体积培养液中的菌体数量，提高生产效率，加速乳酸菌发酵剂的商品化进程，更好地满足市场需求，均具有重要而深远的意义26,27。可以预见，乳酸菌高密度培养技术的市场前景十分广阔。参考文献1EGONBECHHANSENCOMMERCIALBACTERIALSTARTERCULTURESFORFERMENTEDFOODSOFTHEFUTUREJINTJFOODMICROBIO,2002,781191312刘振民,骆承庠乳酸菌发酵剂生产工程技术J食品与发酵工业,2000,26468723山丽杰,田洪涛,贾英民等浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技术关键问题的探讨J中国乳品工业,2002,305666
28、94RIESENBERGD,GUTHKERHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFMICROORGANISMSAPPLMICRBIOLBIOTECHOL1999,514224305熊晓辉,熊强,陆利霞乳酸菌发酵剂高密度培养的研究J中国调味品,2004517216贺稚非,向瑞玺,李洪军等泡菜活性直投式乳酸菌发酵剂的研究J食品科学,2006,2781911977史嫒英,肖冬光酸奶发酵剂高浓度培养的研究J天津轻工业学院学报,1999120258熊涛,徐立荣,范镭等蔬菜发酵专用乳酸菌的菌体高密度培养J食品科学,200713453499吕嘉沥,丁博,浓缩乳酸菌发酵剂的浓缩培养的研究进展J
29、食品科技,200765810李艾黎,代敏,霍贵成浓缩型乳酸菌发酵剂的工业化生产J中国乳品工业，2005,336505311李莹,周剑忠,董明盛乳酸菌高密度培养技术研究进展J乳品加工,20083444612陈坚,堵国成,李寅等发酵工程试验技术M北京化学工业出版社13梁勇,杜敏,南庆贤浓缩型乳酸菌发酵荆的制备J中国乳品工业,1995,23213213314刘云鹤,何煜波肉品发酵剂增殖培养基及培养条件的研究湖南农业大学学报自然科学版,2002,28323423615吕兵,张国农,杨瑞欢嗜酸乳杆菌生物学特性及其发酵乳的研究J中国乳品工业,2002,305373916杨洁彬乳酸菌生物学基础及应用北京中国
30、轻工业出版社,199617吕兵,张国农酸奶发酵剂速效干剂制备中保护剂的研究J中国乳品工业,1996,2423518OSBORNERJWPRODUCTIONOFFROZNECONCETRATEDCHEESESTARTERSBYDIFUSIONCULTURESOCDAIRYTECHNOL,197730404419OGBONNAJC,MARKLHNUTRIENTSPLITFEEDINGSYRATEGYFORDIALYSISCULTIVATIONOFECOILBIOTIECHNOLBLOENG,1993,41109220PROTNERRMARKLHDIALYSISCULTURESAPPLMICROBI
31、ALBIOTECHNOL19985040341421KANGBC,LEESY,CHANGHNPRODUCTIONOFBACILLUSTHURINGIENSISSPOREINTOTALCELLRETENTIONCULTUREANDTWOSTAGECONTINOUSCULTRUREUSINGANINTERNALCERAMICFILTERSYSTEMBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,1993421107111222PARKBG,LEEWG,CHANGY,ETALLONGTERMOPERATIONOFCONTINUOUSHIGHCELLDENSITYCULTUREOFSAC
32、CHAROMYCESCERAVISIAEWITHMEMBRANEFILTRATIONANDONLINECELLCONCENTRATIONMONITORINGBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,1999219710023CHIARAS,VINCENZO,VIVIEN,ETALHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFPROBIOTICSANDLACTICACIDPRODUCTIONBIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,2002,82221322224陈坚,李寅,毛英鹰等培养模式对重组大肠杆菌高密度培养生产谷胱甘肽的影响J生物工程学报
33、,1998,14445245525周剑忠,董明盛,江汉湖等液芯包囊乳酸菌细胞释放及浓缩培养的初步研究J食品工业科技,2004,255707226ULRICHKULOZIKANDJURGENWILDERAPIDLACTICACIDPRODUCTIONATHIGHCELLCONCENTRATIONSINWHEYULTRAFILTRATEBYLACTOBACILLUSHELVETICUSBIOTECHOL1999,2136540327AOLMOSDICHARA,FAMPE,JLURIBELARREA,APAREILLEUXANDGGOMAGROWTHANDLACTICACIDPRODUCTIONBY
34、LACTOBACILLUSCASEISSPRHAMNOSUSINBATCHANDMEMBRANEBIOREACTORINUENCEOFYEASTEXTRACTANDTRYPTONEENRICHMENTBIOTIECHNOLBLOENG,1999,3610571065本科毕业设计（20_届）乳酸菌高密度培养技术研究目录中文摘要0英文摘要00前言11材料111菌种112培养基1121培养基（MRS液体培养基）1122计数培养基（MRS固体培养基）113主要仪器设备114主要试剂22实验方法221菌种活化222PH值的测定223吸光值的测定224活菌计数225补料分批培养226培养条件的优化2261
35、接种量2262PH值3263溶氧量3264培养时间327培养基成分的优化3271不同碳源对乳酸菌培养的影响3272不同氮源对乳酸菌培养的影响3273不同缓冲盐对乳酸菌培养的影响3274基础培养基中生长因子的添加328正交试验429补料分批培养4291补料因素的选择42911补料碳源对乳酸菌培养的影响42912补料氮源对乳酸菌培养的影响42913补料一定比例的碳源和氮源对乳酸菌培养的影响5292补料量的优化53结果与讨论531培养条件的单因素试验5311接种量5312PH值6313溶氧量6314培养时间732培养基成分的单因素实验7321碳源7322氮源8323缓冲盐8324生长因子933正交试
36、验10331正交分析10332极差趋势图分析11333方差分析1134补料分批培养12341补料因素选择123411补料碳源对乳酸菌培养的影响123412补料氮源对乳酸菌培养的影响123413补料一定比例的碳源和氮源对乳酸菌培养的影响13342补料量的优化134结论14中文摘要摘要本研究以MRS培养基为细菌增殖基础培养基，在优化培养条件接种量、起始PH值、溶氧量、培养时间和培养基成分碳源、氮源、缓冲盐及生长因子的基础上，采用补料分批培养法进行乳酸菌的高密度培养。实验得出的最佳培养条件是接种量为3，PH值65左右，培养时间为20H，生长因子为VB5和谷酰胺酸，正交试验得出氮源蛋白胨15，碳源葡萄
37、糖2，缓冲盐磷酸氢二钾1为最优条件。在此基础上，通过补料分批培养方式进行高密度培养，得到的优化补料策略为高密度培养时补料碳氮源比单独补料碳源或者碳源要好，而且分批补料一定比例碳氮源（215）的补料总量的最佳值为75，即初始补料25，4H和8H后各补料25，得到的活菌数最高，比常规培养高了5倍，为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定了基础。关键词乳酸菌；高密度；培养条件优化；培养基成分优化；补料分批培养。英文摘要ABSTRACTINTHISSTUDY,BASEDONMRSMEDIUMFORCELLCULTUREMEDIUM,INTHEOPTIMALCULTURECONDITIONSINOCULUMSIZE
38、,PH,DISSOLVEDOXYGEN,CULTURETIME,ETCANDMEDIUMCOMPOSITIONCARBON,NITROGEN,BUFFERSALTSANDGROWTHFACTORS,BASEDONTHEUSEOFFEDBATCHCULTUREMETHODHIGHDENSITYCULTUREOFLACTICACIDBACTERIA,LACTICACIDBACTERIASTARTERFORTHEFURTHERPREPARATIONOFTHEBASISTHEOPTIMUMEXPERIMENTALCULTURECONDITIONSWEREINOCULATIONOF3,PHVALUEOF
39、ABOUT65,INCUBATIONTIMEOF20H,ANDUSINGGLUTAMINEACIDANDVB5ASGROWTHFACTORCONCLUDEDBYTHEORTHOGONALEXPERIMENT,THENITROGENSOURCEOF15PEPTONE,2GLUCOSECARBONSOURCE,DIPOTASSIUMHYDROGENPHOSPHATEBUFFERSALTOF1WERETHEOPTIMUMCONDITIONSONTHISBASIS,FEDBATCHCULTUREBYWAYOFHIGHDENSITYCULTURE,FEEDINGTHEBESTSTRATEGYISCULT
40、IVATIONOFHIGHDENSITYCARBONANDNITROGENSOURCEWEREBETTERTHANFEEDINGASINGLECARBONORCARBONSOURCESANDACERTAINPERCENTAGEOFFEDBATCHCARBONANDNITROGENSOURCE215OFTHETOTALFEEDINGTHEBESTVALUEOF75,WHICHWASTHEINITIALFEEDING25,4HAND8HAFTERFEEDING25OFALLGETTOLIVETHEHIGHESTBACTERIALCOUNTS,HIGHERTHAN5TIMESTHENORMALCUL
41、TURE,FORFURTHERPREPARATIONOFTHISEXPERIMENTLAIDTHEFOUNDATIONFORLACTICACIDBACTERIASTARTERKEYWORDSLACTOBACILLUSHIGHDENSITYCULTURECONDITIONOPTIMIZEOPTIMIZATIONOFMEDIUMCOMPOSITIONFEDBATCHCULTURE0前言乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品，并赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群，而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用
42、，也是传统食品的发展方向1,2。浓缩发酵剂1,2,4具有活力高、体积小、携带使用方便的特点，可直接用于发酵制品生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化和污染。乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现其高活性、高密度的培养2,4。高密度培养技术一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的5。高密度培养不仅可减少培养体积，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品市场竞争力4。因此，研究探索乳酸菌的高密度培养技术具有重要意义。在培养过程中，缓冲盐法和化学中和法应用较多，但
43、菌数较低。而透析法由于对设备和技术要求较高，仅在国外资料中有报道6。补料分批培养作为一种高密度培养手段，应用于重组大肠杆菌的培养较为普遍，而应用于乳酸菌高密度培养鲜有报道7。一般来说，脱脂乳和乳清是乳酸菌的最佳培养基，但是使用乳清基质培养基时，乳清蛋白易发生热变性，产生沉淀，同时乳基质和乳清基质培养基因其增殖慢或不易分离菌体而不易采用，常常要配合其他的生长因子方可使用7。本研究以MRS，在优化培养条件接种量、起始PH值、溶氧量、培养时间等和培养基成分碳源、氮源、缓冲盐、生长因子的基础上，采用补料分批培养法进行乳酸菌的高密度培养，为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定基础。1材料11菌种戊糖乳杆菌，本实验
44、室分离和保藏12培养基121培养基（MRS液体培养基）胰蛋白胨10G牛肉膏10G酵母膏5G磷酸氢二钾2G柠檬酸二铵2G乙酸钠5G葡萄糖20G吐温801MLMGSO7H2O058GMNSOH2O0189G加水至1000ML灭菌20MIN，T115122计数培养基（MRS固体培养基）在液体培养基里加琼脂14G，溶解再灭菌。13主要仪器设备LDAX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂DKY恒温调速回转式摇床上海杜科自动化设备有限公司YP202N型电子天平ACCULAB公司PHS25型数显PH计上海精密科学仪器有限公司分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司SPX型智能生化培养箱宁波江
45、南仪器厂DS高速组织捣碎机上海标本模型厂双层落地恒温振荡器太仓光明实验分析仪器厂HWS26型电热恒温水浴锅14主要试剂番茄汁，胡萝卜汁，平菇汁实验室自制蛋白胨生化试剂上海东海制药厂麦芽糖生化试剂上海丽珠东风生物技术有限公司琼脂BR中国医药（集团）上海化学试剂公司吐温80CR中国医药（集团）上海化学试剂公司蛋白胨生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司牛肉浸膏生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸二氢钾天津市博迪化工有限公司葡萄糖天津市博迪化工有限公司蔗糖广东光华化学厂有限公司乳糖上海试剂二厂2实验方法21菌种活化无菌条件下将实验室保藏的菌种少许接入灭菌的MRS培养基中，37条件下培养24
46、H，即菌液浑浊后连续培养3代，再可进行接种。22PH值的测定采用PH计在室温下测定培养基的PH值8。23吸光值的测定借鉴熊涛等8的实验方法，采用UV8500紫外分光光度计在600NM下比色，以蒸馏水为空白,测定菌液吸光值OD值。24活菌计数取1ML发酵液加入到9ML灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取三个适当的稀释倍数，吸取1ML稀释液注入无菌培养皿中，涂布法在计数培养基上涂布均匀，每个稀释度做三个平行培养皿5。培养基倒置放入37恒温培养箱中，培养24H。选取菌落数在30300之间的培养皿计菌落数。25补料分批培养根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的适当阶段间歇地补加碳氮源，培
47、养24H后测定OD值。26培养条件的优化261接种量根据叶明等9的文献，在100ML三角瓶中倒入70MLMRS液体培养基，杀菌冷却后分别按1、2、3、4、5的接种量接入菌种，于37条件下在摇床中培养24H，取样分别用平板涂布法测定菌落数，用分光光度计测定吸光值的方法测定菌密度。262PH值借鉴文献10上的方法，用氢氧化钠和盐酸调节培养基的初始PH值在75、70、65、60四个点上。在100ML三角瓶中分别装入70MLPH调至以上4个值的液体培养基以及作为空白对照的MRS液体培养基，接种后37条件下在摇床中培养24H，取样分别用平板涂布法和测定吸光值的方法测定活菌落数及菌体密度。263溶氧量在1
48、00ML三角瓶中分别装入70ML的MRS培养基，灭菌接种后分别在0、40、80、120、160R/MIN的恒温摇床上培养24H，取样测定培养液的菌密度，并由此确定最适振荡频率。264培养时间菌种活化扩培后，按最佳培养方式在适宜条件下培养24H，1H取样测定OD值，以培养时间为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制乳酸菌OD值变化曲线。27培养基成分的优化271不同碳源对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，固定除碳源以外的因素，选择乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖四种碳源分别加入培养基中，含量都为211。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS液体培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中
49、培养24H，测定培养液的菌体密度。分别以1、2、3、4、5的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定碳源的最佳加入量。272不同氮源对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，固定除氮源以外的因素，选择蛋白胨、硫酸铵、尿素和硝酸钾四种氮源分别加入培养基中，含量都为111。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS液体培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的菌密度。确定最佳氮源后，分别以05、1、15、2、25的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定氮源的最佳加入量。273不同缓冲盐对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，选择磷酸盐、醋酸钠、磷酸盐和醋酸钠（11）、不加磷酸盐或醋酸钠四种方式分别加入培养基中，总量都为0711。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的菌密度。确定缓冲盐后，分别以04、07、10、15、2、3的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定缓冲盐的加入量。274基础培养基中生长因子的添加（1）平菇浸汁的制备取鲜菇200G，切碎加入适量蒸馏水煮沸5MIN后，移入组织捣碎机捣碎，抽滤过滤，定容到400ML，即为平菇浸汁，分别以5、10、15、20、25的量加入液体培养基中灭菌备用。
