1、1本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程牛皮胶原蛋白酶解条件优化一、选题的背景与意义胶原蛋白与胶原多肽的生物功能和药用、保健功能正在逐渐被人们认识，这方面的研究也逐渐成为人们研究的热点。食品加工业每年产生大量的动物皮和骨等废弃物，其中含有大量胶原蛋白，弃之可惜，又造成环境污染，利用其开发新功能食品、保健品、化妆品、医药品和化工产品等具有广阔的发展前景。胶原肽是采用先进的定向酶切、变性、干燥、萃取等技术，从胶原中提取得到的产物，胶原肽的平均分子量在1000DA左右，相对胶原蛋白复杂的三级超螺旋结构，胶原肽的线状结构使其消化吸收率高达80。与普通胶原蛋白20003000DA的分子量相比，胶原肽无需
2、分解即可被人体吸收和利用。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题一研究的基本内容1通过单因素实验选择合适的酶2复合酶的合成3根据相关资料通过复合酶对胶原蛋白进行酶解4测量水解度（二）拟解决的主要问题1解决酶解条件（PH、温度、水解时间、底物浓度、酶用量）对水解度的影响。2通过对水解度的测量找到酶解胶原蛋白的最佳条件三、研究的方法与技术路线1研究的基本方法（1）酶活力的测定福林酚试剂（2）单因素试验法选酶2（3）正交试验酶解条件优化（4）水解度测定甲醛滴定法2研究的技术路线酶的选择酶的复合酶解水解度测定酶解条件优化（PH值、温度、水解时间、底物浓度、酶用量）四、研究的总体安排与进度1、2010年1
3、0月至2011年12月实验前的准备工作；查阅相关的文献，完成开题报告、任务书及文献综述。2、2011年1月至2011年4月实验研究阶段。1酶制剂的选择和复合2研究不同实验条件对胶原蛋白酶解的影响3水解度的测定（4）酶解条件的优化3、2011年4月至2011年5月整理实验阶段，并完成毕业论文。五、主要参考文献1SRFAHNESTOCK,ASTEINHIICHE1BIOPOLYMERS8POLYAMIDESANDCOMPLEXPROTEINACEOUSMATERIALSM，20052PIEZKA，EIGNEREA，LEWISMSTHECHROMATOGRAPHICSEPARATIONANDAMIN
4、OACIDCOMPOSITIONOFTHESUBUNITSOFSEVERALCOLLAGENSJBIOCHEMISTRY1963，258663蒋挺大，张春萍肢原蛋白M化学工业出版社，20014菅景颖，张志胜酶解胶原蛋白研究进展J浙江化工，2007，38118205曹健，李卫林，张磊等酶解胶原蛋白产物分子量的控制研究J食品工业科技，2006，27885886李彦春，祝德义，侯立杰等酶解胶原蛋白多肽的制备与分析J中国皮革，2004，33322267蒋寅，翟青，郭桦，等壳聚糖对锌铁离子的配位特性及其配合物的应用J现代食品科技，2007，23989918安广杰，徐清萍NEUTRASE蛋白酶降解骨胶原蛋
5、白制备水解明胶J食品与机械，2007，5，23339409韩风杰，赵征酶法制取比目鱼皮胶原蛋白寡肽J食品研究与开发，2006，27810410710刘海英，李丁，李双祁等斑点叉为尾鲴鱼皮明胶水解方法的研究J食品工业科技，2007，282176178311郑巧东，林东强，姚善泾等胶原蛋白水解为胶原多肽的动力学研究J中国皮革，2005，3411212712BOLI，FENGCHEN，XIWANG，ETA1ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFANTIOXIDATIVEPEPTIDESFROMPORCINECOLLAGENHYDROLYSATEBYCONSECUTIVECHROMA
6、TOGRAPHYANDELECTROSPMYIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJFOODCHEMISTRY,2007，102113511413VSEMRLKOSMACAGANTAR,IANZURMODIFICATIONOFCOLLAGENHYDROLYSATESJRESOURCES，CONSERVATIONANDRECYCLING，1995，139710414RUUDABANK,MARIANNEKXIKKEN，B0BBECKMANETA1ASIMPLEFIEDMESUREMENTOFDEGRADEDCOLLAGENINTISSUESAPPLICATIONINHTHY，FIBR
7、ILLATEDANDOSTEOARTHRITICCARTILAGEJMATRIXBIOLOGY,1997，1623324315SRLTEMEL,BKSIMPSONCHARACTERIZATIONOFTHECOLLAGENOLYTICENZYMEFRACTIONFROMWINTERFLOUNDER（PSEUDOPLEURONECTESAMERICANUSJCOMPBIOCHEMPHYSIO11995，LI2B113113616MASATOHIYAMA，MASAAKISHINOZUKA,MASAMIIZUKAETA1DEGRADATIONOFGELATINANDCOLLAGENBYSERINEPR
8、OTEINASEOFASPERGILLUSSYDOWIJJOURNALOFFERMENTATIONANDBIOENGINEERING,1996，81546446517SIRIPOMDAMRONGSAKKUL，KONGPOBRATANATHAMMAPAKITTINANKOMOLPISETA1ENZYMATICHYDROLYSISOFRAWHIDEUSINGPAPAINANDNEUTRASEJJOURNALOFINDUSTRIALANDENGINEERINGCHEMISTRY,2008，1420220618常虹，李远志，等菠萝粉干燥特性的研究J现代食品科技，2008，12415719曾名勇，李八方
9、，陈胜军等红非鲫鱼皮胶原蛋白酶解条件的研究J中国海洋药物杂志2005，245242920薛勇，薛长湖，杜世振等岩藻聚糖硫酸酯寡糖CEIV配合物水解胶原蛋白的研究J_中国海洋大学学报，2006，36227327621孙爱梅，张贵锋，倪文等胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析J中国生物工程杂志2005，252667222陈秀金，曹健，魏明等碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解物的研究J中国皮革，2004，331424623李彦春酶法提取牛皮胶原蛋白中国皮革，2002，312361024魏世林，许雯用537酸性蛋白酶软化处理削匀山羊蓝湿皮的研究中国皮革，1991，2020121825YOSHIOYA
10、MAKAWA，TAMOTSUOMORISATHOA，DIETRICHMEBSHEMORRHAGICPRINCIPLESINTHEENOM4OFBIFSARIETANS，AVIPEROUSSNAKEIIENZYMATIC，PROPERTIESWITHSPECIALREFERENCETOSUBSTRATESPECIFICITYJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA，1995，1247172326ACRISTINASARMENTO，C1AUDIASOLIVEIRA，ARMSDUARTEETA1EVALUAFONOFCARDOSINAASAPROBEFORLIMITEDPROTEOLY
11、SISINONAQUEOUSENVIRONMENTSCOMPLEXSUBSTRATESHYDROLYSISJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2006，3841542127ERICDUFOUR,MICHLEDALGALARRONDO，GUYHERV6ETA1PROTEOLYSISOFTYPEIIICOLLAGENBYCOLLAGENASEANDCATHEPSINBUNDERHI曲HYDROSTATICPRESSUREJMEATSCIENCE1996，42，32612695毕业论文文献综述食品科学与工程酶解法提取小分子胶原肽的研究现状摘要胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于
12、被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能。胶原蛋白的水解方式主要分化学降解法和酶解法。本丈介绍了酶解法水解胶原蛋白的优点，重点阐述目前国内外在酶解胶原蛋白领域的研究成果，包括胶原蛋白质的水解方法、胶原蛋白的酶解工艺条件和胶原蛋白酶的水解特性与作用机理等方面的研究。关键词胶原蛋白胶原肽酶解法前言胶原蛋白是一类结构相关的蛋白质家族，广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其主要的结构蛋白，起着支持结构器官、保护机体的作用。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分
13、解，因此难被人体吸收，食用利用率较低1。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高蛋白质消化吸收率几乎达100，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等2。因此，胶原蛋白的水解及胶原多肽的利用一直是科学工作者研究的一个热门课题。1酶解胶原蛋白11酶解的优点蛋白质水解产物的生产方式通常有两种化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定温度下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质的方法。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应，反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，得到的多肽分子质量分布不
14、均匀，色氨酸完全被破坏，该法目前已逐渐被淘汰；碱法水解会因为不对称碳原子经过中间状态的过度阶段，发生消旋现象，即产生D型和L一型的等摩尔混合物，使氨基酸大多消旋，其中，D一型氨基酸不能作为有效的氨基酸源，有些还具有毒性甚至有致癌、致畸和致突变作用3。20世纪80年代，随着酶制剂工业和食品工业的迅猛发展，人们发现酶法水解反应条件温和，反应时间短，无环境污染，产品营养价值高，产物以多肽和L型游离氨基酸为主，易于人体消化吸收，因而利用酶水解胶原蛋白逐渐受到了人们的重视4。12酶的选择6能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等、
15、动物蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶等、微生物蛋白酶如枯草杆菌1398、放线菌166等；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素34。2胶原蛋白酶解的工艺条件21胶原蛋白的酶解方法目前酶解胶原蛋白的
16、工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法或分步酶水解法。酶解胶原蛋白的具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求，要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。从上个世纪80年代我国开始这方面的研究工作，目前已经取得了较多研究成果。例如曹健等在研究影响胶原蛋白水解物分子量和水解度的各种因素时发现复合蛋白酶用量在控制胶原蛋白水解产物分子量方面作用非常明显5。李彦春等以牛皮边角废料为原料，用两步酶解法提取胶原蛋白多肽，并对影响酶水解过程的各个因素进行了分析。通过对水解产物分子量分布和等电点等指标的测定，发现分子量呈不连续分布，主要集中在某些分子量处，分子量
17、的分布主要与所用酶的种类和酶解方式有关【6】。通过酶解其配合物也可有效控制其分子量的分布7。22胶原蛋白的酶解影响胶原蛋白酶解的因素主要包括酶的种类、酶的用量、酶解时间、PH、水解温度等。安广杰和徐清萍以牛骨素为原料，应用NEUTRAES蛋白酶制备水解明胶的工艺。确定最佳水解条件为温度5O、PH为55、加酶量2、底物浓度40、水解时间3H，得到产品的分子质量分布范围为520KDA82_3胶原蛋白的酶解产物特性刘海英等对斑点叉尾鲴鱼皮明胶水解制取抗氧化活性肽的方法进行了研究，比较了不同的水解方法、不同底物、不同的蛋白酶对水解产物抗氧化活性的影响。研究结果表明酶解法适合生产胶原蛋白活性肽，酶解产物
18、具有不连续的分子量分布及较好的抗氧化活性。不同底物酶解制取的产物的抗氧化活力不同【10】。郑巧东等通过全波长扫描和凝胶渗透色谱，对水7解过程动态及其多肽分子质量的变化进行了研究，考察了水解温度、酸用量等因素对水解动态的影响，并对酸法水解的过程动力学进行了分析。结果说明鸭掌胶原蛋白酸法水解得到的多肽分子质量分布不均匀，分子质量大小随反应时同的增大而减小；增大酸用量和提高浓度可使水解反应更彻底，水解过程可用一级反应动力学方程进行描述【11】。此外，对木瓜蛋白酶而言，反应PH为50时水解度最高，反应温度在4060之间时可将胶原水解产物的分子量控制在6520KDA之间。这些研究成果对控制产物分子量具有
19、理论和实践上的指导意义。还有些文献对水解产物的研究进行了报道。BOLI等在进行水解猪皮胶原的实验时发现混合蛋白酶与单酶相比，所得的水解产物具有更强的抗氧化活性。水解的程度会影响水解产物的抗氧化剂的性质，缩氨酸的分子越小金属螯合的能力就越强【12】。VSERNR1KOSMAC等利用碱和酶水解铬革屑制备胶原水解产物，将其与长链的羧酸及它们的氯化物缩合。胶原水解产物和缩合物分别与乙烯和丙烯氧化物嫁接，用化学和分光镜分析其反应程度，认为缩合物的表面活性主要与所使用的酸有关【13】。3胶原蛋白酶的水解特性与作用机理31胶原蛋白酶的水解特性测定A胰凝乳蛋白酶水解完整的胶原蛋白、热处理过的变性的胶原蛋白、以
20、及用人体胶原酶解旋的胶原蛋白得到的碎片的尺寸，通过比较得出胰凝乳蛋白酶不能使完整的三股螺旋的胶原蛋白分子解链，但能使变性的胶原蛋白完全降解成小分子产物【14】SIRIPOMDAMRONGSAKKUL等在用木瓜蛋白酶和应用NEUTRASE蛋白酶水解生牛皮时，发现应用NEUTRASE蛋白酶水解的产物中，胶原蛋白的水解产物的粘度跟水一样低。I一型的人类胶原蛋白是存在于哺乳动物体内最丰富的一种分子，天然的胶原对大多数的胶原蛋白酶都具有抵抗力【17】。JFRIEDRICH等在研究角蛋白酶对天然胶原的水解能力时发现羽毛角蛋白和胶原不能被这种从菌类提取的角蛋白酶水解【18】。32胶原蛋白酶的作用机理对于酶作
21、用机理的研究也很多。MISOOKKIM等利用从生姜的根茎中提取的半胱氨酸蛋白酶GP2水解从小牛皮中提取的I型胶原蛋白时，发现这种酶能作用于胶原分子三条螺旋链上的相同位点，是目前唯一被证明能够水解天然胶原的植物半胱氨酸蛋白酶【23】。运用热力学和动力学参数定量的比较，发现金属胶原蛋白酶对对胶原蛋白分子链的解旋和伸展至少有两种截然不同的机理【25】。ACRISTINASARMENTO等认为存在三种溶胶机理，一种是用裂缝胶原蛋白酶，能够分裂稳定三股螺旋胶原蛋白，第二种是拓宽的精细蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶，能够作用于天然胶原蛋白分子的分裂的肽端，第三种是细菌蛋白酶及组织蛋白酶K【26】。8实验证明高压
22、条件下胶原分子表面一些氨基酸侧链不宜暴露，也不宜被组织蛋白酶B识别。胶原水解的速率随着压力的增大而减小。高压会导致酶和底物的构象发生变化，压力还会改变酶的弹性27。4应用现状由于胶原多肽具有良好的营养功能、理化性能以及生理功能，所以它的应用范围非常广泛。随着年龄的增长，人体对能量的需求量呈下降趋势，但单位体重氮的需求量并不下降，老年人可通过摄入胶原多肽来克服这一矛盾。由于胶原多肽具有保护胃粘膜抗溃疡、抑制血压上升、提高骨骼强度、促进皮肤胶原代谢等功能，同时酶解胶原蛋白制备的胶原多肽具有更小的相对分子质量,并且更易降解,所以在营养保健品和日用化学品开发方面拥有一定的市场，可将其开发成各种美容护肤
23、品、美容饮料或降血压、预防骨质疏松等的功能保健品。除此之外胶原多肽还可应用于运动保健食品中，实验证明由于肤在胃中排空及小肠吸收快，负氮平衡及由此产生的肌肉分解代谢阶段将进一步缩短或消失，胶原水解物可作为在运动或运动结束时的恢复性饮料。由于蛋白水解物属于高蛋白低热量物质，还可应用于减肥食品。参考文献1SRFAHNESTOCK,ASTEINHIICHE1BIOPOLYMERS8POLYAMIDESANDCOMPLEXPROTEINACEOUSMATERIALSM，20052PIEZKA，EIGNEREA，LEWISMSTHECHROMATOGRAPHICSEPARATIONANDAMINOACID
24、COMPOSITIONOFTHESUBUNITSOFSEVERALCOLLAGENSJBIOCHEMISTRY1963，258663蒋挺大，张春萍肢原蛋白M化学工业出版社，20014菅景颖，张志胜酶解胶原蛋白研究进展J浙江化工，2007，38118205曹健，李卫林，张磊等酶解胶原蛋白产物分子量的控制研究J食品工业科技，2006，27885886李彦春，祝德义，侯立杰等酶解胶原蛋白多肽的制备与分析J中国皮革，2004，33322267蒋寅，翟青，郭桦，等壳聚糖对锌铁离子的配位特性及其配合物的应用J现代食品科技，2007，23989918安广杰，徐清萍NEUTRASE蛋白酶降解骨胶原蛋白制备水解
25、明胶J食品与机械，2007，5，23339409韩风杰，赵征酶法制取比目鱼皮胶原蛋白寡肽J食品研究与开发，2006，27810410710刘海英，李丁，李双祁等斑点叉为尾鲴鱼皮明胶水解方法的研究J食品工业科技，2007，282917617811郑巧东，林东强，姚善泾等胶原蛋白水解为胶原多肽的动力学研究J中国皮革，2005，3411212712BOLI，FENGCHEN，XIWANG，ETA1ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFANTIOXIDATIVEPEPTIDESFROMPORCINECOLLAGENHYDROLYSATEBYCONSECUTIVECHROMATOGRA
26、PHYANDELECTROSPMYIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJFOODCHEMISTRY,2007，102113511413VSEMRLKOSMACAGANTAR,IANZURMODIFICATIONOFCOLLAGENHYDROLYSATESJRESOURCES，CONSERVATIONANDRECYCLING，1995，139710414RUUDABANK,MARIANNEKXIKKEN，B0BBECKMANETA1ASIMPLEFIEDMESUREMENTOFDEGRADEDCOLLAGENINTISSUESAPPLICATIONINHTHY，FIBRILLAT
27、EDANDOSTEOARTHRITICCARTILAGEJMATRIXBIOLOGY,1997，1623324315SRLTEMEL,BKSIMPSONCHARACTERIZATIONOFTHECOLLAGENOLYTICENZYMEFRACTIONFROMWINTERFLOUNDER（PSEUDOPLEURONECTESAMERICANUSJCOMPBIOCHEMPHYSIO11995，LI2B113113616MASATOHIYAMA，MASAAKISHINOZUKA,MASAMIIZUKAETA1DEGRADATIONOFGELATINANDCOLLAGENBYSERINEPROTEIN
28、ASEOFASPERGILLUSSYDOWIJJOURNALOFFERMENTATIONANDBIOENGINEERING,1996，81546446517SIRIPOMDAMRONGSAKKUL，KONGPOBRATANATHAMMAPAKITTINANKOMOLPISETA1ENZYMATICHYDROLYSISOFRAWHIDEUSINGPAPAINANDNEUTRASEJJOURNALOFINDUSTRIALANDENGINEERINGCHEMISTRY,2008，1420220618常虹，李远志，等菠萝粉干燥特性的研究J现代食品科技，2008，12415719曾名勇，李八方，陈胜军等
29、红非鲫鱼皮胶原蛋白酶解条件的研究J中国海洋药物杂志2005，245242920薛勇，薛长湖，杜世振等岩藻聚糖硫酸酯寡糖CEIV配合物水解胶原蛋白的研究J_中国海洋大学学报，2006，36227327621孙爱梅，张贵锋，倪文等胶原蛋白降解物高效液相色谱质谱联用分析J中国生物工程杂志2005，252667222陈秀金，曹健，魏明等碱性蛋白酶水解脱铬革屑制备胶原水解物的研究J中国皮革，2004，331424623李彦春酶法提取牛皮胶原蛋白中国皮革，2002，31236101024魏世林，许雯用537酸性蛋白酶软化处理削匀山羊蓝湿皮的研究中国皮革，1991，2020121825YOSHIOYAMAK
30、AWA，TAMOTSUOMORISATHOA，DIETRICHMEBSHEMORRHAGICPRINCIPLESINTHEENOMOFBIFSARIETANS，AVIPEROUSSNAKEIIENZYMATIC，PROPERTIESWITHSPECIALREFERENCETOSUBSTRATESPECIFICITYJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA，1995，1247172326ACRISTINASARMENTO，C1AUDIASOLIVEIRA，ARMSDUARTEETA1EVALUAFONOFCARDOSINAASAPROBEFORLIMITEDPROTEOLYSISI
31、NONAQUEOUSENVIRONMENTSCOMPLEXSUBSTRATESHYDROLYSISJENZYMEANDMICROBIALTECHNOLOGY,2006，3841542127ERICDUFOUR,MICHLEDALGALARRONDO，GUYHERV6ETA1PROTEOLYSISOFTYPEIIICOLLAGENBYCOLLAGENASEANDCATHEPSINBUNDERHI曲HYDROSTATICPRESSUREJMEATSCIENCE1996，42，326126911本科毕业设计（20_届）牛皮胶原蛋白酶解条件优化目录1前言32材料与方法321材料与仪器3211材料421
32、2主要仪器和设备422方法4221测定方法42211酶活力的测定42222水解度的测定4222试验方法52221酶解用酶种类的选择52222酶解工艺优化53结果与讨论531蛋白酶活力的测定532酶解用酶的选择633木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的工艺条件优化7331木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验73311酶解温度的确定73312酶解PH的选择83313酶解时间的选择83314木瓜蛋白酶加酶量的选择9332木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的正交试验1034复合酶酶解工艺优化11341复合蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验113411加酶量的选择113412PH值的选择123413酶解温度的选择13
33、3414酶解时间的选择13342复合酶酶解牛皮胶原蛋白正交试验144结论15致谢错误未定义书签。参考文献15摘要本文研究了酶解法提取牛皮胶原蛋白小分子肽的工艺条件。以牛皮胶原蛋白的水解度作为指标，分别研究木瓜蛋白酶和复合蛋白酶对牛皮胶原蛋白的酶解效果，通过采用单因素试验和正交试验得到优化的工艺条件。正交试验表明，两种酶分别酶解时，酶解时间、温度、PH值、加酶量对牛皮胶原蛋白水解度的影响顺序均为温度PH值加酶量时间；木瓜蛋白酶酶解的优化条件是温度55。C、PH值65、时间6H、加酶量6000U/G，在该优化条件下牛皮胶原蛋白的水解度可以达到231；复合蛋白酶酶解的优化条件是温度55。C、时间8H
34、、PH值80、加酶量8000U/G，在该优化条件下牛皮胶原蛋白的水解度可以达到359。复合蛋白酶的对牛皮胶原蛋白的酶解效果优于木瓜蛋白酶。关键词胶原蛋白；胶原肽；酶解法；水解度ABSTRACTTHISESSAYSTUDIESONTHEEXTRACTIONCONDITIONSOFCOWHIDECOLLAGENSMALLPEPTIDESUSINGENZYMATICMETHODUSINGDEGREEOFHYDROLYSISOFCOWHIDECOLLAGENASINDICATORS,STUDYTHEENZYMATICEFFECTCAUSEDBYPAPAINANDCOMPLEXPROTEASERESPE
35、CTIVELYANDTHENDERIVEOPTIMIZEDCONDITIONSBYSINGLEFACTOREXPERIMENTANDORTHOGONALEXPERIMENTORTHOGONALEXPERIMENTSHOWSTHATWHENTWOENZYMESWORKINGRESPECTIVELY,THEORDEROFINFLUENCECAUSEDBYENZYMOLYSISTIME、TEMPERATURE、PHNALUEANDADDINGQUANTITYOFENZYMEONHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENTEMPERATUREPHVALUEADDINGQUANT
36、ITYOFENZYMETIMETHEOPTIMIZEDCONDITIONSOFPAPAINENZYMOLYSISISTEMPERATUREOF55、PHVALUEOF65、TIMEOF6H、ENZYMECONCENTRATIONOF6000U/GANDUNDERTHISCONDITIONTHEHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENCANACHIEVE231THECOMPLEXPROTEASEENZYMOLYSISCONDITIONISTEMPERATUREOF55、TIMEOF8H、PHVALUEOF80、ENZYMECONCENTRATIONOF8000U/GAN
37、DUNDERTHISCONDITIONTHEHYDROLYSISDEGREEOFCOWHIDECOLLAGENCANACHIEVE359THEENZYMOLYSISEFFECTCAUSEDBYCOMPLEXPROTEASEISBETTERTHANTHATOFPAPAINKEYWORDSCOLLAGENCOLLAGENPEPTIDEENZYMATICDEGREEOFHYDROLYSIS1前言我国是皮革生产大国之一，每年生产30万吨以上的皮革废渣，利用这些工业废弃物酶解来制备胶原多肽，使其变废为宝，不仅减少环境污染，还能带来良好的社会效益和经济效益。但是由于酶自身的缺点，如高度的底物专一性，易变敏
38、感性，水解率偏低等，导致工业化生产的成本较高，产品价格昂贵。所以寻找热稳定性好的胶原蛋白酶，改进各种水解工艺条件，提高胶原蛋白酶解为胶原多肽的酶解效率，将成为水解胶原蛋白领域的研究重点1。由于胶原多肽具有良好的营养功能、理化性能以及生理功能，所以它的应用范围非常广泛。随着年龄的增长，人体对能量的需求量呈下降趋势，但单位体重氮的需求量并不下降，老年人可通过摄入胶原多肽来克服这一矛盾25。由于胶原多肽具有保护胃粘膜抗溃疡、抑制血压上升、提高骨骼强度、促进皮肤胶原代谢等功能，同时酶解胶原蛋白制备的胶原多肽具有更小的相对分子质量,并且更易降解,所以在营养保健品和日用化学品开发方面拥有一定的市场，可将其
39、开发成各种美容护肤品、美容饮料或降血压、预防骨质疏松等的功能保健品67。除此之外胶原多肽还可应用于运动保健食品中，实验证明由于肤在胃中排空及小肠吸收快，负氮平衡及由此产生的肌肉分解代谢阶段将进一步缩短或消失，胶原水解物可作为在运动或运动结束时的恢复性饮料710。由于蛋白水解物属于高蛋白低热量物质，还可应用于减肥食品。胶原蛋白是一类结构相关的蛋白质家族，广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极其主要的结构蛋白，起着支持结构器官、保护机体的作用1014。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难
40、使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低1519。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高蛋白质消化吸收率几乎达100，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等。因此，胶原蛋白的水解及胶原多肽的利用一直是一个热门课题20。本文主要介绍了酶解条件（温度、PH、酶解时间、加酶量）对胶原蛋白水解度的影响，以及研究木瓜蛋白酶和复合蛋白酶对牛皮胶原蛋白酶解的最优条件，从而得到有较高水解度的酶解用酶和酶解条件21。2材料与方法21材料与仪器211材料牛皮胶原溶液以新鲜牛皮为原料、对牛皮进行去脂、去
41、杂，以05MOL/L的乙酸为提取介质，采用胃蛋白酶酶解，提取液经过过滤初步分离得。胃蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司木瓜蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司胰蛋白酶生物试剂上海源聚生物科技有限公司复合蛋白酶生物试剂广西东恒华道生物科技有限公司氢氧化钠分析纯国药试剂干酪素化学试剂广东医药站化学试剂综合公司乙醇分析纯国药试剂其它均为实验室常规试剂212主要仪器和设备DKS22型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司TDL5台式低速大容量离心机江苏金坛市医疗仪器厂分光光度计北京普析通用仪器有限公司PHS25型数显PH计上海精密科学有限公司其它为实验室常用设备22方法221测定方法2211酶活
42、力的测定福林酚法，按照SB/T103171999测定2222水解度的测定水解度（DH）的定义在水解过程中降解的肽键占蛋白质肽键总数的百分比。当蛋白质全部水解生成游离氨基酸时，DH100；未水解时，DH022。甲醛定位滴定法，测定原理甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用酸度计对电位的变化进行定量测定，根据PH值判断和控制滴定终点。操作步骤1将酶解液在4000R/MIN下离心10MIN，吸取5ML上层清置于100ML容量瓶中，加蒸馏水至标线吸取200ML上述溶液于烧杯中，加60ML蒸馏水，1酚酞指示剂02ML；用01M氢氧化钠标准液滴定至刚显微红色PH值约82记录消耗氢氧化钠的体积V1；2加入
43、50ML37中性甲醛溶液（甲醛溶液先用氢氧化钠滴定至82），混匀。再用01M氢氧化钠标准溶液继续滴定至深红色PH值约85记录消耗氢氧化钠的体积V2；3另取一不加入蛋白酶，其它条件完全一样，作为对照试验；水解度蛋白水解后消耗的NAOH体积（ML）蛋白未经水解消耗的NAOH体积（ML）蛋白彻底水解所耗的NAOH体积（ML蛋白未经水解所耗的NAOH体积（ML）222试验方法2221酶解用酶种类的选择选取复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，按每克胶原溶液选择相同的酶活力单位，在各自最适的酶解条件下进行酶解，以水解度为主要指标，确定两种比较适宜的水解用酶对胶原蛋白进行酶解。2222酶解工艺优化对
44、选定的两种用酶先进行单因素试验研究，以水解度为主要指标。分别参考加酶量、温度、PH值、时间对水解度的影响。再在单因素试验的基础上选择通过正交试验的方法，以水解度DH为指标，优化酶解条件。3结果与讨论31蛋白酶活力的测定按照SB/T103171999的方法，绘制酪氨酸标准曲线，结果如图31所示。FIG31TYROSINESTANDARDCURVE以每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸为1个蛋白酶活力单位，测定样品吸光值，再通过图31标准曲线上找出相应的酪氨酸浓度，最后计算出蛋白酶活力，实验测得所选用的几种蛋白酶活力测定的结果见表31所示。表31蛋白酶活力的测定结果TAB31THEMEASUREDRES
45、ULTSOFPROTEASEVIGOR酶种类缓冲液酶活力U/G胃蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶复合蛋白酶PH25乳酸缓冲液PH72磷酸缓冲液PH100硼砂氢氧化钠缓冲PH65磷酸缓冲液39610313110413910476510432酶解用酶的选择参照各种酶的使用说明书。分别在选择的几种酶的适宜条件下酶解2H，以水解度为主要指标，确定最适的水解用酶。其中胶原浓度料液比选择120，浓度太大的话会形成粘稠的胶原粘液，不利于酶解的进行。因此本文所有的酶解底物浓度均为120，不再对底物浓度进行单独分析。水解度的测定按照甲醛定位滴定法，结果见表32所示。表32不同酶对牛皮胶原的酶解效果TAB32DIFFER
46、ENTENZYMESCOLLAGENENZYMESOLUTIONOFCOWHIDEEFFECT酶种类加酶量（U/G）时间（H）温度（）PH值水解度DH（）胃蛋白酶40002372731木瓜蛋白酶400026060132胰蛋白酶40002507592复合蛋白酶400025580194从表32中可以看出，三种酶对牛皮胶原的水解效果为复合蛋白酶木瓜蛋白酶胰蛋白酶胃蛋白酶，其中木瓜蛋白酶的要明显高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。其中复合蛋白酶跟木瓜蛋白酶水解效果要明显高于另外两种酶。复合蛋白酶一般由枯草杆菌深层液体发酵产生，经浓缩提取精制复合而成，是一种杆菌蛋白酶的复合体。此外，也有根据生产或研究直接对蛋白酶进
47、行复配而成的复合酶。复合酶与其它单一的酶比较，其组成成分更为复杂，酶切位点也更多，因而其对底物的适应性要更强。木瓜蛋白酶一般由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提炼而得。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解能力，还还具有凝乳、解脂和溶菌活力，是一种能作用于各类蛋白质的纯天然产物。并且具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特性，此外对PH变化不是很敏感，因此应用比较广泛。从本试验结果来看，木瓜蛋白酶对牛皮胶原的作用也比较强，其中水解度DH132，高于胰蛋白酶和胃蛋白酶。根据实验结果综合考虑，本实验选择木瓜蛋白酶和复合蛋白酶作为牛皮胶原酶解的水解用酶。33
48、木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的工艺条件优化331木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白的单因素试验3311酶解温度的确定分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液，调节初始PH至60，酶用量为4000U/G，在温度分别为45、50、55、60、65条件下，提取4H测定其水解度，考察温度对木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原的影响。实验结果见图3111所示FIG3111THEINFLUENCEOFTEMPERATUREONHYDROLYSISDEGREE温度对酶解反映的影响比较复杂，不但能影响水解反应的速度，还能直接影响酶的活力。从图1中可知，当水解温度低于55时，随温度的增加牛皮胶原的水解程度增加；当在55和60之间时水
49、解程度变化不是很明显；当大于60时，水解度反而有所下降；分析可能是温度升高导致木瓜蛋白酶活力降低。在55时候，木瓜蛋白酶酶解牛皮胶原有较高的水解度。3312酶解PH的选择分别用五个三角瓶各取100ML牛皮胶原溶液，加酶量为4000U/G、温度60的条件下水解4H，调节初始PH值分别为45、50、55、60及65，考察PH值对水解度的影响。结果见表2所示FIG2THEINFLUENCEOFPHONHYDROLYSISDEGREEPH值得大小直接影响酶的活力，每一种酶都有其适宜的PH值范围。从图2可知，当PH值小于60时，水解度随PH值的升高而增加；当PH值大于60时，水解度随PH值的升高而降低；PH值为60时，水解度较高。表明木瓜蛋白酶在PH值60时的弱酸性条件下对牛皮胶原蛋白的水解达到了一个较好的效果，在酸或过碱的环境下，木瓜蛋白么酶的活性会受到不同程度的抑制，此外，不适宜的PH环境还会影响酶
