1、本科毕业论文系列开题报告生物技术鳗弧菌卵黄抗体的制备一、选题的背景与意义鳗弧菌是一种对水产鱼类具有严重危害性的细菌病原。目前，鳗弧菌引起的水产养殖动物疾病在世界范围内广泛流行，可感染鱼、虾、鳖类，并常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌在危及水产鱼类的同时，也会通过食物链危害人类健康。因此，研究由鳗弧菌等弧菌引起的细菌性疾病的相关治疗方法具有重要的意义。目前在动物细菌性疾病防治上使用抗生素过多，造成药物残留。破坏环境的同时极大的打击了消费者的信心。而近些年来卵黄抗体的发展为弧菌病的治疗提供了良好建议。卵黄抗体，是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。当用某种抗原免疫产蛋母鸡时，母鸡经免疫
2、应答后，可从其不断产出的鸡卵黄中得到大量均一高效的卵黄抗体IGY。它能预防和治疗多种细菌性和病毒性疾病,无任何毒副作用,在很大程度上可替代抗生素和化学合成药物,同时还具有促生长的作用。卵黄抗体已成为特异性抗体最方便、最廉价的来源，在动物疾病防治上取得了喜人成绩。本实验的目的是借鉴陆生人、畜、禽相关研究的成功经验，以纯培养的鳗弧菌作为抗原，探讨鳗弧菌卵黄抗体的制备技术,并研究其对人工感染的保护作用，以期对水产鱼类的细菌性疾病提供良好的治疗建议，并为水产鱼类的养殖生产提供指导意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、培养鳗弧菌，制作灭活疫苗。2、用鳗弧菌疫苗对蛋鸡多点注射，经初免和加强
3、免疫后，收集鸡蛋。3、由收集的鸡蛋纯化卵黄抗体4、检测纯化的卵黄抗体效价；拟解决的问题借鉴陆生畜禽病原相关研究的成功经验，经多次免疫制备出抗鳗弧菌的高免鸡蛋，建立简易、高效的由鸡蛋纯化鳗弧菌卵黄抗体的技术，建立ELISA鳗弧菌卵黄抗体的技术。三、研究的方法与技术路线1、取实验室已分离、鉴定后保存的鳗弧菌菌种,经活化后扩大培养，离心沉淀、用PBS清洗后悬浮、计数；2、用甲醛对鳗弧菌进行灭活，经涂板检测确定灭活即为抗原鳗弧菌卵黄抗体的制备；3、选择健康蛋鸡，用上述抗原多点注射免疫，免疫34次；4、收集高免鸡蛋，用水稀释法和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体；5、用ELISA进行卵黄抗体的效价检测。技术路线四
4、、研究的总体安排与进度201010201012查阅资料，撰写开题报告和综述。201101201102抗原的制备、蛋鸡免疫。201103201104抗鳗弧菌卵黄抗体的纯化和效价检测。201104201105实验数据的整理、分析，撰写论文，结题、答辩。多点注射免疫蛋鸡收集高免鸡蛋清洗、灭活水稀释法和硫酸铵沉淀法纯化抗鳗弧菌卵黄抗体ELISA法检测卵黄抗体效价鳗弧菌活化、培养五、主要参考文献1杨菲菲卵黄抗体研究进展及应用J现代农业科技，2008，（20）2312322王金洛，徐福州卵黄抗体研究进展J农业新技术，2003，（06）36383张心如，杜干英卵黄抗体的应用与问题J四川畜牧兽医，1996，（
5、01）51524陈连颐卵黄抗体的特性、应用及开发前景J中国禽业导刊，2007，24（21）36375易全茂，谢艳霞鸡卵黄抗体研究进展J动物科学与动物医学，2004，21（02）44456闫佩毅，张立煌卵黄抗体及其在抗感染中的应用J国际流行病学传染病学杂志，2006，33（06）4064087谢献胜，周新民，王锋免疫鸡卵黄抗体研究进展J中国家禽，2005，27（10）41428朱晓东，陈大健，郭永刚等卵黄抗体的提纯及应用J家禽科学，2007，（03）41439房祥军，邹晓庭卵黄抗体的特性及其在仔猪腹泻防治上的应用J中国兽药杂志，2005，（394）242710李沁光，李孟潮，姚金水用免疫方法防治
6、仔猪黄、白痢效果J福建畜牧兽医，1997，5711雷勇，徐有良，李文平WSSV卵黄抗体的制备及在螯虾中的应用J河北渔业，2006，（05）151612詹丽娥，乔忠，孙世兴鸡三联蛋黄抗体研制及应用J中国兽医科技，1994，24（11）303113汪铭书，程安春，陈孝跃应用高免卵黄抗体防治鸭病毒性肝炎的研究J中国畜禽传染病，1997，5141614张毓金，吕殿红，黄庚明番鸭花肝病高免卵黄抗体试验初报J广东畜牧兽医科技，20001242515李肖梁，马有智，方维焕特异性卵黄抗体添加剂对中华鳖摄食和生长的影响J水产学报，2006，（03）42542816周常义，陈晓凤，刘章锦牛蛙嗜水气单胞菌病的病原研
7、究J集美大学学报（自然科学版）2003，8（4）31732117POLSONAISOLATIONOFVIRALIGGANTIBODIESFROMYOLKOFIMMUNIZEDHENSJIMMUNOLCOMMUN,1980,9547518杨帆，张连峰卵黄抗体的分离提取和纯化方法J中国比较医学杂志，2007，（11）6719KIMH,NAKAISSIMPLESEPARATIONOFIMMUNOGLOBULINFROMEGGYOLKBYULTRAFILTRATIONJJFOODSCI,1998,63348549020陈天豹一步洗脱离子交换色谱分离纯化蛋黄中IGYJ福州大学学报，2000，28（2）8
8、11毕业论文文献综述生物技术卵黄抗体的研究进展摘要卵黄抗体IGY是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，它是一种具有较强免疫功能的蛋白质，目前已被广泛应用于动物疾病的诊断及防治。本文对卵黄抗体的形成、性质、作用机理、分离提纯方法及其在检测诊断上和疾病防治方面的应用情况进行了综述，可以预见，随着研究的进一步深入，卵黄抗体的应用将不断扩大。关键词卵黄抗体；应用；研究进展0引言卵黄抗体EGGYOLKIMMUNOGLOBAULI简称IGY指母鸡所产蛋的蛋黄中含有的免疫球蛋白。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初1，自1893年KLEMPERER首次报道鸡蛋中存在抗体以来,人们对卵黄抗体IGY的研
9、究越来越多,认识也越来越深入,应用也日益广泛。目前它已被广泛地用于许多疾病,尤其是近几年来,在家禽传染病的防治上得到广泛应用。现阶段在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究的比较清楚，并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就卵黄抗体的形成、生物学特性、作用机理、提纯方法以及应用等作一综述。1卵黄抗体的形成禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，产生一系列免疫应答反应，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，浆细胞分泌大量特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体主要是IGG在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体2，3。2卵黄抗
10、体的特性与哺乳动物相比,产蛋母鸡生产抗体具有快速、成本低、效率高、产量高的特点。有证据表明,卵黄原抗体对比哺乳动物原抗体有更好的生物学优势4。IGY在结构上类似于哺乳动物的IGG,但在化学结构上有许多不同点。IGY的分子量为180KDA,即6770KDA的重链和2230KDA的轻链，沉降系数为7S，等电点接近525。而IGG分子量为150KDA,即50KDA的重链和2223KDA的轻链。IGY由于结构中比IGG重链多了一个恒定区,但却没有IGG特有的铰链区,所以IGY的摆动性、柔韧性下降,但IGY的分子量较IGG大,所以稳定性较高。IGY具有较强的耐热、耐酸能力,在PH49的环境中稳定,在65
11、下可保持活性24H以上。与哺乳类IGG相比,IGY有更多的疏水性分子,这恰好使它更适于脂类含量丰富的卵黄环境6。卵黄抗体IGY相对于传统哺乳动物的抗体IGG具有以下优点（1）IGY不与哺乳动物补体、FC受体结合，也不与葡萄球菌蛋白A（SPA）或链球菌蛋白G（SPG）结合；IGY还不与血清中的类风湿因子（RF）结合，因而用IGY检测可避免假阳性结果，提高免疫学检测的准确性2。（2）产生免疫反应所需的抗原剂量小，由于禽类与哺乳动物在种系发生史上距离较远,IGY抗体与抗原亲和力高,产生有效免疫应答所需的抗原剂量较小,且不易与哺乳动物的免疫球蛋白发生交叉反应6。（3）每个蛋大约含100MG以上的IGY
12、，一个月可达3G，相当于兔子的1020倍；卵黄中没有其他的IG，易于提纯5。（4）在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多1。3卵黄抗体的作用机理特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽（FAB）部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IGY的稳定区（F
13、E部分）留在肠内7。4卵黄抗体的分离、提纯方法卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为12。大部分蛋白质都是脂蛋白质，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（、）是水溶性的，而IGY是卵黄球蛋白。因此IGY的分离纯化首先需有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IGY4。41卵黄抗体的粗提近二十几年来,已建立了许多较为高效而经济的方法,如聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、水稀释法、辛酸沉淀法CA法等。411聚乙二醇（PEG）沉淀法PEG是非离子型水溶性聚合物,高浓度不引起蛋白质变性,沉淀时间比硫酸铵和乙醇都短,不影响离心处理。该法最早由POLSON报道17。一般用PBS或TBS作缓冲液将卵黄液
14、稀释5倍,加入35的PEG6000或硫酸葡聚糖,10000R/MIN低温离心25MIN后取上清,可得卵黄抗体粗提物。412氯仿抽提法NTAKARUTIMANA在15ML的蛋黄液中加入40MLTBS和40ML氯仿,以10000R/MIN低温超速离心25MIN后保留水层。中间层再用40MLTBS萃取一遍。两步得到的水层均为WSF。有些人还用丙酮作为萃取液。此法去除脂类比较彻底,上清液澄清透明,抗体回收率高,但上清液中残留有机溶剂,对抗体活性有影响,同时有机溶剂造成的环境污染比较严重,因而此法仅适合实验室少量制备。413水稀释法19倍的蒸馏水稀释卵黄,利用01的盐酸调节蒸馏水的PH至50,搅拌15M
15、IN,置4过夜后脂蛋白自然沉淀,通过以10000R/MIN低温超速离心25MIN去除脂类,收集上清液即得WSF18。414辛酸沉淀法CA法辛酸沉淀法CA法则是利用抗体蛋白的化学性质进行分离和纯化。在低离子强度、PH4245的酸性条件下,辛酸可与绝大多数的卵黄蛋白反应,形成不可逆的沉淀,唯有IGY类抗体蛋白不发生反应,仍留在上清中,离心除去沉淀,将上清的PH调整到70左右,用硫酸铵使IGY析出,可得到纯度80以上的IGY,该法经济、简便、快速,不损害抗体活性,回收率高8。42IGY的精细纯化421超滤法超滤法多使用多空纤维超滤膜进行,也可在IGY的多次沉淀或亲和层析后用于研究的进一步纯化。KIM
16、等研究表明19,用AMICONCELL系统,可截取大于一定分子量的蛋白,浓缩倍数可随意调整,对抗体活性无影响,是其中较好的方法。缺点是超滤装置成本较高。422离子交换层析IGY多以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体,磷酸盐缓冲液为吸附,洗脱体系进行分离纯化。陈天豹等用DEAETOYOPEAL650M阴离子交换色谱法分离纯化IGY,总蛋白回收率达9320。423无机物沉淀法该法是蛋白质提取的经典方法,最常用的是硫酸铵或硫酸钠沉淀法。RUAN等用水稀释法粗提卵黄获得水溶性成分后,加入等体积磷酸盐缓冲液PBSPH74稀释,再加入饱和硫酸铵PH6070，使硫酸铵浓度为50,4静置1H,500
17、0R/MIN离心20MIN,弃上清。再用PBS溶解沉淀至原IGY的体积,加入饱和硫酸铵至33饱和度,5000R/MIN离心20MIN,取沉淀。如此重复23次可获高纯度的IGY。424凝胶层析FU等在用水稀释法获得WSF后,再过SEPHADEXG75柱子,进行凝胶层析,可获得高纯度的IGY。CONSTANTINOIU应用TGEL纯化鸡的IGY,回收率为637。5卵黄抗体的应用卵黄抗体作为一种廉价、易获得的抗体，目前已得到越来越广泛的应用。51卵黄抗体在动物疾病诊断、防治方面的应用在免疫诊断方面，由于IGY不激活补体、不结合类风湿因子、不与SPA、SPG、哺乳动物FC受体，与IGG几乎无交叉反应，
18、这使得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，它可作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性5。同时又避免了动物采血的痛苦，受到实验动物的保护者的欢迎。从而使得越来越多的的人倡议用卵黄抗体取代高免血清。在疾病预防方面，由于卵黄抗体能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化，故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的卵黄抗体,以使其获得有效的被动保护免疫力。何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体,对23日龄雏鹅进行预防,其保护率高达1004。房祥军等报道在用不喂初乳的仔猪所做的试验中,不让母猪哺育初生仔猪而代之以代乳料,出生6H内对照组与处理
19、组分别给饲盐溶液或抗大肠杆菌的鸡IGY,结果表明,与对照组相比,饲喂鸡IGY的仔猪死亡率与腹泻率下降,72H后对照组和试验组的死亡率与腹泻率分别为65和85、11和399。李沁光等报道,仔猪出生后口服猪大肠杆菌高免卵黄液,可明显降低仔猪黄痢的发生率10。此外，卵黄抗体还被广泛应用于许多动物疾病的治疗，且效果都较为显著。如詹丽娥等用IBD、ND和EDS76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病,总有效率可达50以上12。汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎DHV的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时,当用1万倍LD50强毒时保护率可达到10013。张毓金等曾对流行于粤闽一带蕃鸭养殖区的花肝病研制出了抗蕃鸭花肝病的卵黄抗体进
20、行治疗试验,结果表明该抗体对于花肝病的早期预防与治疗效果明显14。张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群,治愈率为952。目前国内广泛应用于禽类疾病防治方面的有抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗鸡减蛋综合症等卵黄抗体。用卵黄抗体治疗疾病,安全、高效且无公害,我国已有商品化的卵黄抗体供应,如农业部已批准四川畜牧兽医学院研制的IBD精制蛋黄抗体为二类新生物制品。52卵黄抗体在水产养殖方面的应用卵黄抗体除了对以上陆生动物疾病诊断、预防、治疗方面的应用外，对于水生生物，特别是水产养殖方面也具有重要的作用。在水产动物，GUTIERREZ等1993报道日本鳗鱼通过口服特异性IGY,可降低死亡
21、率,清除肠道病原菌,从而减少对肝和肾的侵害5。在水产养殖方面，白斑综合症是当前全球对虾养殖业所面临的危害性最大、影响范围最广的病害之一,并成为目前制约养虾业发展的主要瓶颈之一。目前,在畜禽生产中已经成功运用口服抗特定病原微生物的卵黄抗体来防治动物肠道微生物的感染。但未见用抗WSSV白斑综合症病毒的卵黄抗体来防治对虾白斑综合症。闫东春21等曾报道，轮虫细胞膜可与白斑综合症病毒特异性结合，为探讨WSSV的治疗方法提供的一定依据。雷勇等以螯虾为动物模型,制备了可大规模生产的抗WSSV卵黄抗体制剂,并在螯虾上作应用效果试验,证实饲料中02的IGY含量具有良好的保护作用,为WSS的预防与治疗提供了一种全
22、新的思路,并为WSSV卵黄抗体的开发应用提供关键的实验数据和理论依据，预计该种口服卵黄抗体在螯虾养殖中将会发挥越来越重要的作用11。此外，作为主要水产养殖品种的中华鳖也面临着一些疾病的困扰。其中以嗜水气单胞菌引起的中华鳖出血性败血症尤为严重。SZILVIAL等22针对支原体16SRRNA基因的特异PCR进行探针检测，基于16SRRNA基因的部分序列的分析可知，华丽闭壳龟内的支原体似乎与最近描述东部箱龟中的支原体相同。李肖梁等利用含有抗嗜水气单胞菌鸡卵黄免疫球蛋白IGY的添加剂饲喂中华鳖,观察其对中华鳖生长和免疫功能的影响15。通过攻毒试验表明,特异性IGY抗体的饲料添加剂对该病具有较好的预防作
23、用,与对照组和饲喂非特异性IGY抗体组相比,死亡率可降低808和792,肾脏中细菌总数也明显减少。这种通过被动免疫的途径为该菌引起的动物疾病预防和控制提供了科学依据。据报道,嗜水气单胞菌亦可引起软体动物、鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染,常致动物大量死亡16,尤其是人工密集养殖和水温较高的条件下最为常发,该病的安全防治现已成为规模化人工养殖场的主要目标之一。口服卵黄抗体的出现将为该菌带来的疾病提供更多的救治机会，减少了养殖场的经济损失。由此可见，卵黄抗体已在水产养殖方面发挥了不可替代的作用，它的高效与安全已逐渐取代了原有的药物治疗，作为一种绿色的新型添加剂，其作用不
24、可估量。6小结卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加剂正在引起人们的关注,卵黄抗体取代抗生素用作生长促进剂,不会产生药物残留,是一种安全的绿色添加剂。生产技术较为成熟用鸡卵黄大量生产、制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。另外卵黄抗体产量高,价格低廉。使用卵黄抗体技术生产免疫球蛋白,可以减少对动物的应激,提高动物的福利。综上所述，卵黄抗体作为抗体家族的重要成员，较哺乳动物抗体有独特优势，因而具有广阔的开发前景。然而目前卵黄抗体在诸多方面存在问题，如没有统一的标准和成熟的方法；保存及运输问题；卵黄抗体中含有大量蛋白质、磷脂等大分子物质,注入机体后,可能出现过敏反应；可能会干扰常规免疫
25、；若在卵黄抗体生产过程中感染病原微生物,对产品又未进行无菌检验、外源病菌检验,这样的产品用于动物后,必将给动物带来感染各种疾病的机会,尤其是垂直传播疾病。这些问题,在一定程度上影响了卵黄抗体的开发和应用3。今后应尽快制订该类产品质量标准,进一步改善产品性状,提高产品质量,以使它在更多领域发挥更大的作用。参考文献1杨菲菲卵黄抗体研究进展及应用J现代农业科技，2008，（20）2312322王金洛，徐福州卵黄抗体研究进展J农业新技术，2003，（06）36383张心如，杜干英卵黄抗体的应用与问题J四川畜牧兽医，1996，（01）51524陈连颐卵黄抗体的特性、应用及开发前景J中国禽业导刊，2007
26、，24（21）36375易全茂，谢艳霞鸡卵黄抗体研究进展J动物科学与动物医学，2004，21（02）44456闫佩毅，张立煌卵黄抗体及其在抗感染中的应用J国际流行病学传染病学杂志，2006，33（06）4064087谢献胜，周新民，王锋免疫鸡卵黄抗体研究进展J中国家禽，2005，27（10）41428朱晓东，陈大健，郭永刚等卵黄抗体的提纯及应用J家禽科学，2007，（03）41439房祥军，邹晓庭卵黄抗体的特性及其在仔猪腹泻防治上的应用J中国兽药杂志，2005，（394）242710李沁光，李孟潮，姚金水用免疫方法防治仔猪黄、白痢效果J福建畜牧兽医，1997，5711雷勇，徐有良，李文平WSS
27、V卵黄抗体的制备及在螯虾中的应用J河北渔业，2006，（05）151612詹丽娥，乔忠，孙世兴鸡三联蛋黄抗体研制及应用J中国兽医科技，1994，24（11）303113汪铭书，程安春，陈孝跃应用高免卵黄抗体防治鸭病毒性肝炎的研究J中国畜禽传染病，1997，5141614张毓金，吕殿红，黄庚明番鸭花肝病高免卵黄抗体试验初报J广东畜牧兽医科技，2000，1242515李肖梁，马有智，方维焕特异性卵黄抗体添加剂对中华鳖摄食和生长的影响J水产学报，2006，（03）42542816周常义，陈晓凤，刘章锦牛蛙嗜水气单胞菌病的病原研究J集美大学学报（自然科学版）2003，8（4）31732117POLSO
28、NAISOLATIONOFVIRALIGGANTIBODIESFROMYOLKOFIMMUNIZEDHENSJIMMUNOLCOMMUN,1980,9547518杨帆，张连峰卵黄抗体的分离提取和纯化方法J中国比较医学杂志，2007，（11）6719KIMH,NAKAISSIMPLESEPARATIONOFIMMUNOGLOBULINFROMEGGYOLKBYULTRAFILTRATIONJJFOODSCI,1998,63348549020陈天豹一步洗脱离子交换色谱分离纯化蛋黄中IGYJ福州大学学报，2000，28（2）81121DONGCHUNYAN,SHUYINGFENG,JIEHUANG,
29、ETCROTIFERCELLULARMEMBRANESBINDTOWHITESPOTSYNDROMEVIRUSWSSVJSCIENCEDIRECT,2007,27342342622SZILVIALFARKAS,JANOSGALADENOVIRUSANDMYCOPLASMAINFECTIONINANORNATEBOXTURTLETERRAPENEORNATAORNATAINHUNGARYJVETERINARYMICROBIOLOGY,2009138169173本科毕业设计（20_届）鳗弧菌卵黄抗体的制备目录目录141引言22试验材料及仪器321试验材料及试剂3211母鸡3212鳗弧菌抗原3213
30、卵黄抗体纯化用试剂3214SDSPAGE电泳试剂3215ELISA试剂3216透析液322试验仪器及耗材43试验方法431高免鸡蛋制备432卵黄分离433卵黄液稀释434抗体沉淀435抗体透析436抗体含量测定437抗体纯度检验438抗体效价检测54结果与分析541抗体纯度检测结果542抗体含量测定结果643卵黄抗体效价检测结果644分析与讨论75小结9致谢错误未定义书签。参考文献10摘要本实验的目的是制备抗鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）鸡卵黄抗体IGY并进行效价检测。具体方法是将蛋鸡经鳗弧菌三次免疫接种后，收集高免鸡蛋，4下保存备用；经稀释去脂、盐沉淀抗体法提取卵黄中IGY卵黄
31、液用005MOLL1，PH50的乙酸乙酸钠缓冲液作10倍稀释，充分搅拌20MIN后，4下静置10小时，10000G离心20MIN去除脂质，取上清液加入适量饱和（NH4）2SO4，使饱和度达到40，盐析沉淀抗体，10000G离心20MIN，除去上清液，将沉淀用PBS透析；采用紫外分光光度法测定蛋白含量，SDSPAGE电泳检测IGY纯度，ELISA法检测IGY效价。结果获得了较为纯净的IGY，ELISA效价为110240。关键词鳗弧菌；卵黄抗体；制备；效价ABSTRACTTHEPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOPRODUCEEGGYOLKIMMUNOGLOBULINIGYAGAINST
32、VIBRIOANGUILLARUMANDEVALUATETHETTITEROFITTHEMETHODSWEREASFOLLOWINGLAYINGHENSWEREVACCINATEDWITHFORMALDEHYDEKILLEDVANGUILLARUMFOR3TIMESANDTHEEGGSWERECOLLECTEDEGGYOLKWASDILUTED10TIMESBYACETICBUFFER005MOLL1,PH50,STIRRED20MIN,EXTRACTED10HAT4THEEXTRACTINGSOLUTIONWASCENTRIFUGED10000GFOR20MINAT4THESUPERNATA
33、NTSOLUTIONWASPRECIPITATEDWITH40AMMONIUMSULFATETHEIGYPRECIPITATEWASRESOLVEDANDDIALYZEDWITHPBSBUFFERIGYPURITYWASDETECTEDWITHSDSPAGEELECTROPHORESISIGYTITERWASDETECTWITHELISARESULTRELATIVELYPUREIGYWASOBTAINED,THETITEROFANTIVANGUILLARUMIGYWAS110240KEYWORDSVIBRIOANGUILLARUMIGYPRODUCTIONTITER1引言卵黄抗体（EGGYOL
34、KIMMUNOGLOBAULI简称IGY），是指从经特异性免疫的禽蛋卵黄中提取出的针对特定抗原的一种抗体。当用某种抗原免疫产蛋母鸡时，母鸡经免疫应答后，可从其不断产出的鸡卵黄中得到大量均一、高效的卵黄抗体IGY。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初1，1893年KLEMPERER2首次报道了鸡蛋中存在抗体。WILLIANMS等1962年发现卵黄免疫球蛋白（EGGYOLKIMMUNOGLOBULIN,IGY）主要存在于禽类的卵黄中3。卵黄抗体跟哺乳动物血清抗体相比，有许多独特的优点，主要表现在绿色环保且无残留；高产低耗、低价且容易获得；性质稳定；识别力及鉴别力强；便于贮存且不易失效4，在较长
35、时间内可保持稳定。4下，IGY甚至可保存510年；室温条件下，可保持抗体活性6个月，甚至在37条件下，也可保持活性1个月5。卵黄抗体能预防和治疗多种细菌性和病毒性疾病，无任何毒副作用，在很大程度上可替代抗生素和化学合成药物，同时还具有促生长的作用。目前在动物细菌性疾病防治上使用抗生素过多，造成药物残留，破坏环境的同时极大的打击了消费者的信心。近年来卵黄抗体技术的发展为细菌性疾病的治疗提供了更佳选择，它已成为特异性抗体最方便、最廉价的来源，是最佳抗生素替代物。目前它已被广泛地用于许多传染病的防治，尤其是近几年来在人、畜、禽疾病防治上取得了喜人成绩。例如SUGITA等（1996）用甲醛灭活的26种
36、病原细菌免疫母鸡后，其产生的IGY，在抑制假单孢菌的生长以及肠炎沙门氏菌的粘附的同时，还可减少葡萄球菌肠毒素A的产生量，有效地预防了多种肠道疾病的发生6；目前，口服IGY已成功地用于细菌、病毒引起的胃肠道感染，如幽门螺旋杆菌（HP）、沙门氏菌、肠毒性大肠杆菌、耶尔森鼠疫杆菌、腺病毒、轮状病毒（HRV）、葡萄球菌等的检测和治疗中7,8；同时也用于紧急预防和治疗传染性法氏囊病、新城疫病等9。抗肠道细菌IGY的作用机理已初步阐明，特定病原菌的IGY能直接黏附在病原菌的细胞壁上，抑制其生长，针对细菌鞭毛或菌毛的IGY则可以黏附在细菌的鞭毛和菌毛上，使细菌失去黏附功能，妨碍其游动。此外，IGY在肠道中被
37、消化后降解成可结合片段，经肠道吸收后进入血液与特定的病原菌黏附因子结合，使细菌失去致病性10。在水产动物方面，卵黄抗体的相关研究报道较少11。但也有成功的报道，例如GUTIERREZ等曾在1993年报道，通过口服特异性IGY，日本鳗鱼可明显降低死亡率，清除肠道病原菌，从而减少对肝和肾的侵害6。据报道，以灭活处理的爱德华氏菌体为抗原对产蛋鸡进行免疫，制备抗爱德华氏菌的IGY，然后将IGY混入喂鳗鱼的人工饲料中，对人工感染发病的鳗鱼进行治疗试验，观察IGY对鳗鱼爱德华氏菌症的治疗效果。结果表明，用IGY治疗鳗鱼的爱德华氏菌症，效果显著12。鳗弧菌是一种对水产鱼类具有严重危害性的细菌病原。目前，鳗弧
38、菌引起的水产养殖动物疾病在世界范围内广泛流行，可感染鱼、虾、鳖类，并常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌在危及水产鱼类的同时，也会通过食物链危害人类健康。因此，研究由鳗弧菌等弧菌引起的细菌性疾病的相关治疗方法具有重要的意义。本实验拟借鉴陆生人、畜、禽相关研发的成功经验，探索鳗弧菌鸡卵黄抗体的制备及纯化技术，以期为病害防治奠定基础。2试验材料及仪器21试验材料及试剂211母鸡SPF海兰蛋鸡，购自宁波慈溪益大养殖场。212鳗弧菌抗原鳗弧菌由本实验室从香鱼体内分离并保存（史雨红老师提供），挑取菌种接种LB平板于28需氧条件下，倒置培养18H，挑取单菌落于LB液体培养基28振荡培养7小时后稀释平板
39、计数，调整菌量为2109CFUML1，离心去除培养基后用09生理盐水重悬，按05加入甲醛，放37水浴锅灭活2448H，取100UL涂LB平板28倒置培养18H检测灭活情况，经检测无活菌后放4备用。213卵黄抗体纯化用试剂005MOLL1，PH50的乙酸乙酸钠缓冲液，配制1L加286ML乙酸，乙酸钠2324G，以1000ML双蒸水溶解，用20NAOH调PH至50。饱和NH42SO4配制60条件下向双蒸水中边搅拌边加入NH42SO4至不能溶解，冷却后有晶体析出，过滤除去杂质。214SDSPAGE电泳试剂电泳缓冲液TRIS碱（MR12114）302G、甘氨酸（MR7507）144G、SDSMR288
40、3810G，加双蒸水至1000ML即为10电泳缓冲液，稀释10倍即为1电泳缓冲液。5浓缩胶4ML水27ML、30丙烯酰胺溶液067ML、10MOLL1TRISPH6805ML、10SDS004ML、10过硫酸铵004ML、TEMED0004ML。12分离胶10ML水33ML、30丙烯酰胺溶液40ML、15MOLL1TRISPH8825ML、10SDS01ML、10过硫酸铵01ML、TEMED0004ML。染色液01G250，40乙醇，10乙酸，其余为双蒸水。脱色液40乙醇，10乙酸，其余为双蒸水。215ELISA试剂包被缓冲液005MPH96碳酸盐缓冲液（CBS），NA2CO3159G，NAH
41、CO3239G定容至1000ML；洗涤液（PH74PBST）NACL80G，KCL02G，KH2PO402G，NA2HPO412H2O29G，TWEEN2050L定容至1000ML；封闭液（1BSA）10G牛血清白蛋白加100ML洗涤液；磷酸盐柠檬酸缓冲液（PH50）柠檬酸192G，NA2HPO412H2O712G，定容至1000ML；底物邻苯二胺（OPD）40MG加100ML磷酸盐柠檬酸缓冲液，用时加30H2O2150L；终止液2MH2SO4溶液。216透析液PBS母液配制A液称取NA2HPO412H2O312G加双蒸水至1000ML溶解；B液称取NA2HPO412H2O71632G加双蒸水
42、至1000ML溶解。001MOLL1PBS（PH72）使用液配制取28MLA液和72MLB液，充分混合，用双蒸水稀释20倍。22试验仪器及耗材滤纸、烧杯、透析袋（MWCO10万，宽44MM，上海捷瑞生物公司，上海），透析袋在使用前应用碳酸氢钠和EDTA煮沸处理并用蒸馏水清洗干净，洗净后放20乙醇中于4下保存、透析袋夹（44MM）、酶标板、磁力搅拌器、移液器、电子天平、PH计、注射器（25ML）、核酸蛋白定量测定仪、酶标仪、UVP凝胶成像分析系统。3试验方法31高免鸡蛋制备将彻底灭活的抗原按11加入弗氏佐剂，振荡乳化。取SPF海兰蛋鸡3只，进行腿部肌肉多点注射，每只12ML，于15D和30D后进
43、行加强免疫，剂量相同。初免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，进行常规饲养。于第3次免疫后10天开始收集鸡蛋，放4暂存。32卵黄分离用酒精棉擦拭鸡蛋表面污物，敲碎鸡蛋，将蛋清蛋黄释放于滤纸上，滚动蛋黄充分吸净蛋清。33卵黄液稀释用针头将卵黄刺一小口，取掉针头，直接用针筒吸取卵黄液盛于烧杯中（每只鸡蛋取10ML卵黄液）。每10ML卵黄液加入100MLPH50乙酸乙酸钠缓冲液放磁力搅拌器上搅拌20MIN，放4冰箱中静置过夜后，分装于50ML离心管中离心4，10000G，20MIN，弃脂质沉淀，合并上清。34抗体沉淀向上述上清中加入适量饱和NH42SO4使终饱和度为40，搅拌均匀后放入4冰箱放
44、置过夜。次日于4、10000G离心20MIN，沉淀用100MLPH72001MOLPBS重悬。在搅拌的同时，按140GL1加入NA2SO4，充分溶解后静置10H。35抗体透析将卵黄液于4、10000G离心20MIN，弃上清，合并沉淀并用15MLPBS缓冲液悬浮。将蛋白液装入透析袋，放入装有PBS缓冲液的烧杯中透析过夜。开启磁力搅拌器增加透析速度，次日更换透析液2次。36抗体含量测定以PBS调零，将透析袋内样品（约20ML）取30L稀释10倍后，以核酸蛋白定量测定仪测蛋白含量。蛋白含量MGML1145OD280074OD260样品稀释度37抗体纯度检验以SDSPAGE测抗体纯度取20L透析后蛋白
45、液，按11加入2LOADINGBUFFER，于100煮沸10MIN，置冰上冷却后取30L上样。浓缩胶浓度5，分离胶浓度12，在浓缩胶中电泳时电压100V，然后在分离胶中调整电压至120V。电泳结束后，以考马斯亮蓝染色，染色液量没过两块胶厚度，染色30MIN以上，至整个凝胶深蓝色，可轻易看到目的条带。弃去染色液，用双蒸水冲洗，加脱色液摇床脱色，视目标带清晰度更换脱色液。最后用UVP凝胶成像系统拍照并根据条带分析纯度。38抗体效价检测本实验采用ELISA方法13,14对卵黄抗体进行效价检测。抗原制备鳗弧菌于28振荡培养过夜后，用5000G离心5MIN沉淀，弃上清，沉淀用20MLPH74PBS重新悬
46、浮，超声波处理。其中超声条件为间隔时间2S，超声时间1S，全程15MIN。超声波破碎液低温离心（4、8000G、20MIN）后取上清，得到鳗弧菌超声粉碎抗原，测定抗原蛋白浓度。抗原包被用包被液稀释抗原，按每孔100L加于聚苯乙烯96孔反应板中，4放置过夜，其中抗原蛋白量为10NG/孔。洗涤次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。封闭每孔加入100L封闭液，室温放置05H。洗涤用洗涤液洗3次。加入IGY样品先将IGY在另一反应板板上用PBS按1640，11280，12560，15120，110240倍比稀释，分别加入包被板反应孔中，每个稀释度2孔，每孔100L。设未经鳗弧菌免疫的鸡蛋的IGY为阴性对
47、照，以PBS为空白。加盖37温育1H。洗涤用洗涤液洗3次。加入酶标抗抗体用封闭液110000稀释羊抗鸡IGGHRP，每孔加入100L，37温育1H。洗涤用洗涤液洗5次。显色每孔加入OPD底物溶液100L，37显色15MIN，显棕黄色。终止反应每孔加50L2MH2SO4终止反应，在酶标仪上读取波长为492NM的吸光度（A）值。结果判断测定孔A值阴性对照孔均值21倍以上者判为阳性，阳性反应的最大稀释度即为待测样品的效价。4结果与分析41抗体纯度检测结果用UVP凝胶成像系统拍照，获得SDSPAGE图，如图1。在电泳图中可以看出，在66KD和30KD附近有两条明显的色带，分别为卵黄抗体的重链和轻链。与
48、相关文献报道15一致，证明本实验分离得到的蛋白质为目的特异性免疫抗体，也说明了在分离卵黄液时脂肪去除得较彻底。此外，在43KD附近略有杂带出现，说明该样品中还含有少量的蛋白杂质。图1分离纯化的IGYSDSPAGE图FIG1SDSPAGEELECTROPHORESISMAPOFPURIFIEDIGYLINE1ISMARKER,LINE2ISPURIFIEDIGY42抗体含量测定结果用核酸蛋白定量测定仪测样品的蛋白含量，结果如表1。表1蛋白质浓度测定结果TAB1THERESULTSOFPROTEINCONCENTRATIONDETERMINATIONOD260OD280蛋白含量（MGML1）样品0
49、27304274171由上表可知，每个鸡蛋IGY含量约为80MG（204171），与文献报道5每只鸡蛋约含卵黄抗体40180MG相符，说明母鸡受到了足够的抗原刺激，产生了大量的卵黄抗体。43卵黄抗体效价检测结果经间接ELISA检测鳗弧菌卵黄抗体效价见表2。表2ELISA检测效价值TAB2THEIGYTITERDETECTEDWITHELISA项目IGY（A492）阴性对照（A492）/PBS0144839015184701533740135825项目IGY（A492）阴性对照（A492）/样品116401265501915471184180176306样品2112800849782015695409252580162275样品31256008332240137
