1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程浒苔多糖磷酸化条件的优化一、选题的背景与意义浒苔多糖有降血脂、抗脂质氧化作用、提高SOD酶活力、消炎、抑制皮肤癌以及对非特异性免疫功能的作用等生理功能。但是浒苔多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。分子修饰可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其理化性质、生物活性、功能特性产生影响。通过对其多糖分子进行磷酸化可提高其生物活性、降低毒性并可以扩大浒苔多糖在食品中的应用。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题在浒苔中进行浒苔粗多糖的提取与分离，并用磷酸化试剂进行磷酸化修饰，在温度、PH值、反应时间、添加量等4因素水平上设计正交试验，测定修
2、饰后的多糖的抗氧化活性优化磷酸化工艺条件。三、研究的方法与技术路线热水浸提法磷酸化试剂抗氧化活性四、研究的总体安排与进度2010/102010/11查阅相关文献，进行外文翻译，了解基本操作规程。2010/112010/12查阅资料，编写开题报告开题答辩。2011/22011/5浒苔多糖磷酸化条件优化研究实验进行。浒苔浒苔粗多糖磷酸化反应最优工艺条件2011/52011/6数据处理、分析，得出结论。撰写毕业论文。五、主要参考文献1张难,吴远跟,莫莉萍等磷酸化香菇多糖制备工艺的研究J食品科技,2008,281852李灿鹏，陈德义，赵逸云等食品蛋白质磷酸化改性的研究进展J食品科学,2009,1130
3、2522553袁怀波,刘国庆,陈宗道磷酸化改性玉米蛋白的性质J食品科学,2007,102850524张智芳,林文庭,陈灿坤浒苔水溶性多糖提取工艺研究J中国食物与营养,2009,339415周蕙萍,朱海燕,陈琼华浒苔多糖的分离、纯化和分析J生物化学杂志,1995,11191936林文庭,张智芳浒苔多糖降血脂及抗脂质过氧化作用J中国公共卫生,2009,2555675707徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔多糖对扇贝SOD和溶菌酶活力的影响J水利渔业,2005,25322238陈立贵,袁新强,王忠等三偏磷酸三钠对魔芋葡甘聚糖的改性研究J安徽农业科学,2008,365176717699高梦祥,叶森海带多糖的
4、提取工艺研究J长江大学学报,2005,25767910周家春,张达力,曾瀚权淀粉磷酸化及其抗冷冻脱水的研究J广州食品工业科技,1999,161434511康鹏,张坤生,任云霞酪蛋白磷酸化工艺技术的研究J食品研究与开发,2007,289212412李志军多糖脱蛋白质方法的比较J农家之友,2009,2242513阳佛送,李雪华多糖结构研究的方法和进展J食品安全与检测,2008,320120314高续春,多糖提取纯化方法研究进展J榆林学院报,2009,1946567毕业论文文献综述食品科学与工程磷酸化浒苔多糖概述摘要浒苔多糖作为一种生物活性大分子，具有提高SOD酶活力、抗脂质氧化、降血压等功效。但受
5、其分子结构的的影响大大限制了其在食品工业中的应用，通过对多糖的分子修饰从而改变其分子结构提高它的应用范围。对浒苔多糖的磷酸化，是采用磷酸试剂并通过设计单因素4水平的正交因素表格来优化其实验条件关键词浒苔多糖分子修饰磷酸化1浒苔多糖多糖作为生命活动四大基本物质之一,在生命活动中发挥着重要作用。多糖不仅参与细胞识别、分子识别、生物体受精生长发育以及免疫过程,而且还发现了其与炎症、自身免疫、肿瘤细胞的恶性转化等生理、病理过程密切相关1浒苔ENTERMORPHA为绿藻门CHLOROPHYTA、石莼目ULVALES、石莼科ULVALEAE藻类,在我国野生藻类中属资源丰富的品种,尤其是在浙江沿海有优势种2
6、。浒苔营养丰富,含有多种人体必需的氨基酸、脂肪酸、维生素和矿物质,其中铁含量为我国食物之最。浒苔自古以来就是我国沿海居民食、药用藻类,有清热解毒、消炎之效。据本草纲目记载浒苔可“烧末吹鼻止衄血,汤浸捣敷手背肿痛”。此外,它还有软坚散结、降低胆固醇的功效,可用于预防和治疗甲状腺肿。据报道,浒苔多糖有降血脂、抗脂质氧化作用3、提高SOD酶活力4、消炎、抑制皮肤癌以及对非特异性免疫功能的作用5等生理功能。11浒苔粗多糖提取多糖的提取方法很多，主要有热水浸提法、酶法提取、超声法提取、超临界萃取法等6但由于热水浸提法工艺简单，操作方便，得率较高等优点，目前国内提取多糖大多采用热水浸提法，如高梦祥7等对海
7、带多糖的提取中运用了此方法，徐大伦等8用热水浸提法通过单因素实验确定其最佳提取工艺条件为浸提时间4H,温度90,固液比为175此外张智芳等9也用热水浸提法对浒苔多糖进行工艺优化，设计了单因素四水平的正交实验研究PH、温度、浸提时间和固液比对多糖得率的影响。12多糖的分离活性多糖的分离纯化是指获得粗的活性多糖后,除去共存杂质,得到纯度较高多糖产品根据高续春多糖研究进展6中提到的多糖纯化的方法有很多包括透析法、分级沉淀法、凝胶柱层析法、纤维素柱层析法、离子交换树脂法等。121脱蛋白质多糖与蛋白质两种高分子成分共存，且两种物质分子量相近，另外多糖常常与蛋白形成糖蛋白复合物，脱蛋白质成为多糖纯化的一个
8、重要步骤主要用到的是SEVEAGE法，三氯乙酸法、酶法等10此外发现还有酶法与SEVEAGE法联用，如刘成梅等在百合多糖脱蛋白方法的研究10中对几种方法的比较见表1从表中知酶法与SEVEAGE法相对于其他方法来说得率较高。郭玉东等在苦瓜多糖脱蛋白方法的比较研究12中也论证了此结论的正确性此外姚文华在大枣多糖的脱蛋白研究13中则通过对几种酶的比较对酶工艺进行优化。122去色素此外浒苔多糖中还含有大量的色素，色素的取出常采用吸附法（纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等）、离子交换法14、金属络合物法等。14提取流程浒苔干品粉碎过筛热水浸提抽滤超滤酶法脱蛋白双氧水脱色抽虑浓缩4倍体积95乙醇沉淀真空冷冻
9、干燥浒苔粗多糖152天然生物分子磷酸化21天然多糖的分子修饰分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得众多结构类型衍生物的方法。已完成的研究证实16,多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。分子修饰可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其理化性质、生物活性、功能特性产生影响。由此可分析多糖构效关系，并为多糖类药物及其他多糖产品的设计提供理论依据。选择合适的方法对多糖进行分子修饰，可改善其功能特性，提高其生物活性或降低其毒副作用。因此，对多糖进行分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是开发多糖产品的重要途径17。211常见的多糖修饰方法及
10、实例分析分子修饰可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其活性产生影响。将多糖或寡糖进行衍生化,如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等,有可能大大提高多糖的生物活性。其它修饰方法,如磷酸酯化、硬脂酰化、棕榈酰化、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羧乙基化、碘化、氨化等18如对灵芝多糖进行硒化研究中将无机硒转化成有机硒不仅提高了吸收硒的能力19而且李庆伟等在小鼠试验中发现灵芝硒多糖可明显增加小鼠血浆和肝GSHPX、SOD的活性,降低小鼠血浆和肝脏脂质过氧化产物含量,其作用效果明显强于灵芝多糖20。22食品中磷酸化的研究进展与其它化学修饰一样,多糖的磷酸化分子修饰是一种共价修饰。多
11、糖经过磷酸化分子修饰后,支链上的羟基被磷酸根取代,从而增强多糖抗肿瘤和抗凝血的生物活性21食品中对蛋白分子磷酸化修饰以及对玉米淀粉的磷酸化修饰较多。221蛋白质磷酸化食品蛋白通过磷酸化引入了大量带有负电荷的磷酸基团，增加了蛋白质分子之间的静电斥力，在溶液中更易分散，从而增加其溶解度；降低了乳化液的表面张力，增加乳化性和乳化稳定性；改变了等电点，有效地拓宽了其在食品的应用范围。国内外的研究结果也表明磷酸化后的蛋白质在表面疏水性、乳化性、热稳定性、起泡性、凝胶形成性等性质都有明显改善，另外，磷酸基的导入能增加磷酸钙的可溶能力，有利于钙的吸收；研究结果还表明酪蛋白磷酸肽还能起到免疫调节和抗脂肪氧化的
12、作用22李灿鹏22等在蛋白质磷酸化中对几种磷酸化方法做出了比较见表2表2各种磷酸化方法的比较TABLE2CHARACTERISTICSOFVARIOUSPHOSPHORYLATIONONMETHODS除此之外1994年TAILLAR等23发表了在磷酸盐存在时，在干燥加热的条件下，具有具有羟基的糖、氨基酸、蛋白质及糖蛋白能被磷酸化，其反应为OHH3PO4OH2PO3H2O根据TAILLAR的方法除了对蛋白质的研究有利外，还可以找到多糖磷酸替代的羟基的工艺条件而磷酸化蛋白的应用已经相当普遍，无论是在大豆分离蛋白、玉米蛋白24还是在花生25等植物蛋白丰富的天然大分子上尤其是在酪蛋白磷酸化26上的应用
13、，对于扩大酪蛋白这一重要蛋白在食品领域中的应用有着极为重要的作用222植物体内淀粉的磷酸化植物中的淀粉磷酸酯化,使其在黏度、渗透性、凝胶性和吸水性等理化性能上有显著的特点。工业上所需的磷酸酯淀粉都是经过物理或化学等方法加工而成的变性淀粉,其成本高,加工过程产生的污水对环境的污染较大。因此,通过基因工程等生物技术手段,加强植物体内的淀粉磷酸化作用,直接合成淀粉磷酸酯,将会给变性淀粉行业带来革命性的转变27。谢淑蓉等阐述了淀粉磷酸化的机制，主要是利用一种叫做葡聚糖水合二激酶GLUCANWATERDIKINASE,GWD的酶下发生反应葡聚糖ATP水葡聚糖PAMPPI而完成淀粉的磷酸化周家春28等则以
14、淀粉冷冻状态下的持水能力为主要指标,研究了可用于冷冻食品的淀粉磷酸醋的最适合成条件。从磷酸盐添加量、反应温度、反应时间、PH值等方面初步研究了淀粉磷酸化制备的工艺条件。223多糖的磷酸化DANA29等研究了纤维素多糖的磷酸化研究。对多糖的磷酸化这方面国内进行的研究较少，张难等采用混合磷酸盐试剂（三偏磷酸钠和三聚磷酸钠）对香菇多糖进行磷酸化修饰,并对其工艺条件进行了初步的探索研究，以修饰后香菇多糖的磷酸根接枝量、黏度为考察指标,通过单因素和正交实验,考察磷酸化试剂、温度、时间、PH值对修饰后香菇多糖磷酸根接枝量、黏度的影响。结果确定最佳磷酸化工艺条件为8混合磷酸化试剂、温度80、时间5H、PH值
15、80,所得磷酸化香菇多糖衍生物的磷酸根接枝量为777,黏度测定表明香菇多糖经磷酸化后黏度几乎没有变化30，31。主要的工艺流程是香菇多糖水浴（50度）除杂磷酸化反应（加入一定量的磷酸化实际，主要是三篇磷酸钠和三聚磷酸钠，调节PH、温度、反应时间等）3倍乙醇沉淀24H冷冻干燥香菇多糖磷酸化衍生物钼蓝比色法测磷酸跟含量。并对修饰后的香菇多糖进行化学性质、物理性质以及对红外光谱的分析得出修饰后的香菇多糖未受损伤且活性增加32。224浒苔多糖的磷酸化国内外对浒苔多糖的磷酸化这方面研究较少，根据前面提到的蛋白磷酸化、玉米磷酸化以及香菇多糖的磷酸化可以按照常规的化学方法（添加三偏磷酸酸钠和三聚磷酸钠）、酶
16、磷酸化法等（陈世琼33等）然后设计单因素四水平（反应温度、反应时间、PH值、磷酸试剂浓度）的正交实验，根据方差分析等数据处理得出最优工艺条件，完成浒苔多糖的磷酸化，对保健品及功能性食品的开发有重要意义。3总结与展望浒苔多糖作为一种生物活性分子多糖，具有降血压、增强免疫力等功能而且浒苔作为一种丰富的海洋资源，原料来源广泛，开发前景广阔，可用于保健品市场，亦可作为功能性食品添加物。但由于多糖分子的各个方面的性质大大缩小了其应用范围，磷酸化通过改变多糖的水溶性等因素同时还可增加其活性，因而大大增加了浒苔多糖在食品中的应用。参考文献1阳佛送,李雪华多糖结构研究的方法和进展J食品安全与检测,2008,3
17、2012032徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔多糖的分离纯化及其对非特异性免疫功能的体外实验研究J中国食品学报,2006,6517203林文庭,张智芳浒苔多糖降血脂及抗脂质过氧化作用J中国公共卫生生,2009,2555675704徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔多糖对扇贝SOD和溶菌酶活力的影响J水利渔业,2005,25322235徐大伦,黄晓春,杨文鸽等浒苔多糖的分离纯化及其对非特异性免疫功能的体外实验研究J食品科学,2005,2562322356高续春多糖提取纯化方法研究进展J榆林学院报,2009,19465677徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔水溶性多糖提取的工艺研究J浙江海洋学院学报自然科学版,2
18、005,24166688高梦祥,叶森海带多糖的提取工艺研究J长江大学学报,2005,2576799张智芳,林文庭,陈灿坤浒苔水溶性多糖提取工艺研究J中国食物与营养,2009,3394110李志军多糖脱蛋白质方法的比较J农家之友,2009,2242511刘成梅,万茵,涂宗财百合多糖脱蛋白方法的研究J食品科学,2002,231899012郭育东,单斌,李敏仪苦瓜多糖脱蛋白方法的比较研究J安徽农业科学,2009,3773225322713姚文华大枣多糖脱蛋白的研究J食品研究与开发,2009,355495114陈辉,李永辉,姚曲峋离子交换技术在多糖分离纯化中的应用J河北农业科学,2008,127168
19、169,17215徐大伦,欧昌荣,黄晓春浒苔多糖脱蛋白方法的研究J水产科学,2005,245262716王兆梅,李琳,郭祀远等多糖结构修饰研究进展J中国医药工业杂志,2002,331261661817赵晓燕,王长云分子修饰在多糖构效关系究中的应用J海洋湖沼通报,20033101318赖萍,林跃鑫天然多糖分子修饰研究进展J生命的化学,2003,23318318519和朝军,李景原,秦广雍灵芝硒多糖的研究进展J河南农业科学,2006,391120李庆伟,尚德静,崔乔,等灵芝硒多糖SEGLP1抗氧化与抗肿瘤作用的研究J营养学报,2002,24324925121张难,吴远根,周剑丽,等多糖的分子修饰及
20、其在功能性食品中的应用展望J食品研究与开发,2007,28815916122李灿鹏,陈德义,赵逸云,等食品蛋白质磷酸化改性的研究进展J食品科学，2009，301125225523TARELLIE,WHEELERSFDRYINGFROMPHOSPHATEBUFFEREDSOLUTIONSCANRESULTINTHEPHOSPHORYLATIONOFPRIMARYANDSECONDARYALCOHOLGROUPSOFSACCHARIDES,HYDROXLYATEDAMINOACIDS,PROTEINS,ANDGLYCOPROTEINSJANALBIOCHEM,1994,22219620124袁怀波
21、,刘国庆,陈宗道磷酸化改性玉米蛋白的性质J食品科学,2007,2810515325沈宁,杨光,孙亦鸣花生蛋白磷酸化改性的研究J中国食品添加剂,2007,59698,10126康鹏,张坤生,任云霞酪蛋白磷酸化工艺技术的研究J食品研究与开发发,2007,289212427谢淑蓉,浦跃武,张本山植物体内的淀粉磷酸化J农产品加工,20065575928周家春,张达力,曾瀚权淀粉磷酸化及其抗冷冻脱水的研究J广州食品工业科技,1999,161434529DANAMIHAELASUFLET,GABRIELLECHARLOTTECHITANU,VALENTINIPOPAPHOSPHORYLATIONOFPOL
22、YSACCHARIDESNEWRESULTSONSYNTHESISANDCHARACTERISATIONOFPHOSPHORYLATEDCELLULOSEJSCIENCEDIRECT,2006661240124930张难,吴远跟,莫莉萍等磷酸化香菇多糖制备工艺的研究J食品科技,2008,2818531张难,邱树毅,莫莉萍等磷酸化香菇多糖的工艺优化J工艺技术,2008,29518732张难,邱树毅,吴远跟等磷酸化香菇多糖的制备及其部分理化性质的研究J食品研究与开发,2008,298212433陈世琼一种高温细菌葡聚糖磷酸化酶的性质研究JCHINABREWING,2009,47476本科毕业设计（
23、20_届）浒苔多糖磷酸化工艺条件的优化目录1引言132材料与方法1421材料14211原料14212试剂1422仪器1523实验方法15231粗多糖的提取与制备15232磷酸化反应16233样品磷酸根的测定16234磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响17235单因素实验工艺优化172351反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响172352反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响172353反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响172354磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响18236浒苔粗多糖磷酸化正交试验工艺优化183结果与讨论1831粗多糖的提取1832样品磷酸根测定1933磷酸化试剂对浒苔
24、粗多糖磷酸化的影响2034单因素实验工艺优化21341反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响21342反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响22343反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响22344磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响23345单因素实验结论2335浒苔多糖磷酸化正交试验工艺优化24351实验结果及分析24352验证试验244结论255展望25致谢错误未定义书签。参考文献25附录错误未定义书签。附录1文献综述错误未定义书签。附录2中英文翻译错误未定义书签。摘要本文研究了磷酸化浒苔多糖，采用混合磷酸盐（三聚磷酸钠三偏磷酸钠61）作为磷酸化试剂对浒苔粗多糖进行磷酸化，并通过单因素实
25、验来确定影响磷酸化反应的因素，继而设计正交试验优化磷酸化工艺条件。根据测定经修饰后的粗多糖的磷酸根含量来确定结果。主要研究了反应温度、反应时间、PH和混合磷酸盐浓度对磷酸化反映的影响。单因素实验结果温度80，反应时间5H，反应PH为90混合磷酸盐浓度010G/ML，在此条件下可获得最大磷酸根接枝量9386。而经过正交优化后确定影响反应的因素主次顺序为磷酸化试剂浓度反应PH反应时间反应温度,其最优组合为反应温度90，反应时间6H，反应PH90，磷酸化试剂浓度010G/ML，此时最大接枝量可大于等于9965。关键词浒苔多糖；磷酸化；工艺优化ABSTRACTINTHISPAPER,THEPHOSPH
26、ORYLATEDPOLYSACCHARIDEWASSTUDIEDMIXEDPHOSPHATESTPPSTMP61WASUSEDASTHEPHOSPHORYLATIONREAGENTINTHEREACTIONOFTHEPHOSPHORYLATIONOFENTEROMORPHAPOLYSACCHARIDESANDTHESINGLEFACTOREXPERIMENTSWEREDONETODETERMINETHEFACTORSOFAFFECTINGPHOSPHATEREACTION,FOLLOWEDBYORTHOGONALTESTTOOPTIMIZEPHOSPHORYLATIONCONDITIONSTH
27、ERESULTSWEREDETERMINEDBYTHEQUANTITYOFPHOSPHATEINTHEMODIFIEDANDUNMODIFIEDPOLYSACCHARIDESEVERALFACTORS，SUCHASTEMPERATURE,TIME,PHANDTHEQUANTITYOFPHOSPHORYLATEDREAGENTSWEREINVESTIGATEDANDTHEQUANTITYOFPHOSPHATEINTHEMODIFIEDANDUNMODIFIEDPOLYSACCHARIDEWEREEVALUATEDASWELLRESULTSOFSINGLEFACTOREXPERIMENTSTEMP
28、ERATURE80，TIME5H，PH90，THEPHOSPHATECONCENTRATION010G/MLUNDERTHESECONDITIONS,THEGRAFTQUANTITYOFPHOSPHATEWAS9386THEORDEROFTHESEFACTORSAFFECTINGTHEREACTIONTHATDETERMINEDTHROUGHORTHOGONALTESTWASPHOSPHORICACIDREAGENTCONCENTRATIONSREACTIONPHREACTIONTIMETHEREACTIONTEMPERATURE,THEOPTIMUMCOMBINATIONWASREACTIO
29、NTEMPERATURE90,REACTIONTIME6H,REACTIONPH90,PHOSPHORYLATIONREAGENTCONCENTRATION010G/ML,THENTHEMAXIMUMAMOUNTOFTHEQUANTITYOFPHOSPHATECANBEGREATERTHANOREQUALTO9965KEYWORDSENTEROMORPHAPOLYSACCHARIDE；PHOSPHORYLATION；OPTIMIZATIONOFPROCESSING1引言多糖作为生命活动四大基本物质之一,是一种重要的生物活性成分，在生命活动中发挥着重要作用。多糖不仅参与细胞识别、分子识别、生物体
30、受精生长发育以及免疫过程,而且还发现了其具有重要的医疗价值，有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等多种药理作用。随着糖生物学和糖化学的发展，多糖的生物活性越来越受到人们的重视，有关多糖生物活性的研究有了长足的进步和发展。据研究表明，浒苔水溶性多糖是药理活性很强的成分,具有很好的降血脂、抗疲劳、抗菌、抗病毒及增强免疫力等多种生物学活性。富含浒苔水溶性多糖的浒苔ENTERMORPHA为绿藻门CHLOROPHYTA、石莼目ULVALES、石莼科ULVALEAE藻类，是野生藻类资源中的优势种。浒苔营养丰富，含多种人体必需的氨基酸、脂肪酸、维生素和矿物质。同时，它还含有多种活性功能成分如脂氧合酶和多糖类等，药用价
31、值较高，开发潜力巨大。自古以来，浒苔即为食用和药用藻类，本草纲目中记载，浒苔可“烧末吹鼻止衄血；汤浸捣敷手背肿痛”14。虽然浒苔多糖具有丰富的来源并且具有较高的药用和食用价值，但由于它的生物活性受分子结构的的影响而大大限制了其在食品工业中的应用，因此可以通过通过对多糖的分子修饰改变其分子结构以提高它的应用范围。分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得众多结构类型衍生物的方法。已完成的研究证实,多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。分子修饰可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其理化性质、生物活性、功能特性产生影响。由此可分析多糖构效关系，
32、并为多糖类药物及其他多糖产品的设计提供理论依据。选择合适的方法对多糖进行分子修饰，可改善其功能特性，提高其生物活性或降低其毒副作用。因此，对多糖进行分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是开发多糖产品的重要途径。将多糖或寡糖进行衍生化,如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等,有可能大大提高多糖的生物活性5。其它修饰方法,如磷酸酯化、硬脂酰化、棕榈酰化、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羧乙基化、碘化、氨化等。如对灵芝多糖进行硒化研究中将无机硒转化成有机硒不仅提高了吸收硒的能力而且经修饰后的灵芝硒多糖抗肿瘤和抗氧化活性均大大提高6。李庆伟等还在在小鼠试验中发现灵芝硒多糖可明显增加小鼠血浆和肝G
33、SHPX、SOD的活性,降低小鼠血浆和肝脏脂质过氧化产物含量,其作用效果明显强于灵芝多糖7。而在对分子进行磷酸化的研究中，蛋白分子磷酸化修饰以及对玉米淀粉的磷酸化修饰较多。食品蛋白通过磷酸化引入了大量带有负电荷的磷酸基团，增加了蛋白质分子之间的静电斥力，在溶液中更易分散，从而增加其溶解度；降低了乳化液的表面张力，增加乳化性和乳化稳定性；改变了等电点，有效地拓宽了其在食品的应用范围。植物中的淀粉磷酸酯化,使其在黏度、渗透性、凝胶性和吸水性等理化性能上有显著加强的特点。谢淑蓉4等阐述了淀粉磷酸化的机制，主要是利用一种叫做葡聚糖水合二激酶GLUCANWATERDIKINASE,GWD的作用下完成淀粉
34、的磷酸化。周家春8等则以淀粉冷冻状态下的持水能力为主要指标,从磷酸盐浓度、反应温度、反应时间、PH值等方面初步研究了磷酸化淀粉制备的工艺条件。以上均是针对蛋白质以及淀粉等大分子磷酸化的研究，而国内外在多糖磷酸化的研究甚少，因此对蛋白质和淀粉的磷酸化研究方法为后面我们探讨磷酸化浒苔多糖的工艺条件提供了借鉴意义。与其它大分子的化学修饰一样,多糖的磷酸化分子修饰也是一种共价修饰。多糖经过磷酸化分子修饰后,支链上的羟基被磷酸根取代,从而增强多糖抗肿瘤和抗氧化等的生物活性。DANA等10利用微晶纤维素与熔融尿素中的磷酸反应，介绍了水溶性纤维素磷酸化后在合成和表征上的一些新的研究成果,由该方法可获得的DS
35、的最大值约为1。对多糖的磷酸化这方面国内进行的研究较少，张难等1113采用混合磷酸盐试剂（三偏磷酸钠和三聚磷酸钠）对香菇多糖进行磷酸化修饰,并对其工艺条件进行了初步的探索研究，以修饰后香菇多糖的磷酸根接枝量、黏度为考察指标,通过单因素和正交实验,考察磷酸化试剂、温度、时间、PH值对修饰后香菇多糖磷酸根接枝量、黏度的影响。结果确定最佳磷酸化工艺条件为8混合磷酸化试剂、温度80、时间5H、PH值80,所得磷酸化香菇多糖衍生物的磷酸根接枝量为777,黏度测定表明香菇多糖经磷酸化后黏度几乎没有变化。并对修饰后的香菇多糖进行化学性质、物理性质以及对红外光谱的分析得出修饰后的香菇多糖未受损伤且活性增加，最
36、后通过正交试验确定最佳磷酸化工艺条件。此外宋玥等15研究并优化了磷酸化壳寡糖的制备工艺，通过单因素试验,考察磷酸化试剂、温度、时间、PH值对磷酸化壳寡糖磷酸根含量的影响。但是对于浒苔多糖磷酸化的报道到目前为止还没有，鉴于浒苔在食品中广泛的应用，经磷酸化后的浒苔多糖将有更大应用空间。本实验拟采用热水浸提法提取浒苔粗多糖，继而从反应温度、反应时间、PH和混合磷酸化试剂浓度等4个对浒苔多糖磷酸化反应有影响的方面进行单因素实验，并探讨浒苔多糖磷酸化反应的条件，通过正交实验优化浒苔多糖磷酸化反应的工艺条件。2材料与方法21材料211原料浒苔干品,由浙江省奉化市腾宇养殖有限公司提供。212试剂木瓜蛋白酶分
37、析纯上海蓝季科技发展有限公司双氧水分析纯宜兴市第二化学试剂厂无水乙醇分析纯浙江中星化工试剂有限公司四水合钼酸铵分析纯合肥工业大学化学试剂厂对苯二酚分析纯上海展云化工有限公司亚硫酸钠分析纯上海硫酸厂磷酸二氢钾分析纯天津市博迪化工有限公司邻苯三酚分析纯上海展云化工有限公司浓硫酸分析纯兰溪市六洞山化工试剂厂浓硝酸分析纯兰溪市六洞山化工试剂厂浓盐酸分析纯浙江中星化工试剂有限公司三聚磷酸钠分析纯天津市博迪化工有限公司三偏磷酸钠分析纯上海晶纯试剂有限公司TRISHCL缓冲液22仪器PL4002电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司PL403电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司AL204电子分
38、析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司DKS26电热恒温水浴锅宁波江南仪器厂DK8D三孔电热恒温水槽宁波一恒科技仪器有限公司SHBA循环水式多用真空泵陕西太康生物科技有限公司超滤实验装置北京旭邦膜设备有限责任公司旋转蒸发仪上海爱郎仪器有限公司H2500R2湘仪离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司KD723可见分光光度计上海科登精密仪器有限公司DB2电热板常州国华电器有限公司PHS3C酸度计梅特勒托利多仪器（上海）有限公司WH3微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司3HE通风柜三和实验室UNICO紫外可见分光光度计尤尼柯上海仪器有限公司其他仪器烧杯、透析袋，超滤
39、离心管、容量瓶、移液枪、锥形瓶、试管、量筒、离心管、玻璃棒、冰箱等等。23实验方法231粗多糖的提取与制备本实验采取热水浸提法提取粗多糖，并用木瓜蛋白酶脱蛋白，30双氧水脱色纯化粗多糖。具体流程如下浒苔干品热水浸提抽滤超滤酶法脱蛋白双氧水脱色抽虑浓缩4倍体积95乙醇沉淀真空冷冻干燥浒苔粗多糖苯酚硫酸法测多糖含量具体步骤浒苔干品粉碎过筛后取2040目部分,用热水浸提，。取容积为1L的烧杯，称取15G浒苔粉，加水溶解，175的固液比，并放入温度为90的水浴锅中水浴4H。4H后取出置于通风处冷却，进行抽滤后过3000DA膜超滤。将超滤后的样液置于温度为60的水浴锅中，并加入木瓜蛋白酶水浴35H，目的
40、是脱蛋白。此处是经过考马斯亮蓝法测定蛋白含量确定使用木瓜蛋白酶来脱蛋白。然后加入30双氧水脱色并放入温度为60的水浴锅中水浴4H。离心过滤取浸提液并旋转蒸发浓缩,然后加4倍体积的无水乙醇沉淀,将醇沉后的多糖醇溶液离心，参数为5000R/MIN，20MIN。将离心后的多糖加水复溶后再冷冻干燥后即可得到浒苔粗多糖。称取一定量浒苔粗多糖溶解于蒸馏水中，在恒温水浴中溶解得到待反应液。232磷酸化反应向制备好的待反应液中加入一定量的磷酸化试剂，在恒温水浴锅中充分溶解冷却后调节PH，在一定温度下反应一定时间，反应后样液用4倍体积乙醇醇沉24H。将醇沉多糖冷冻干燥，再于60水浴锅中加水复溶，接着将复溶后的溶
41、液放在透析袋中（截留分子量为10000DA）中用蒸馏水透析2D，透析过程中每隔12H更换透析液，以加快透析速度，将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得到浒苔粗多糖磷酸化衍生物。233样品磷酸根的测定2331磷酸根标准曲线的绘制采用钼蓝比色法,原理样品经灰化后，在酸性溶液中，磷酸盐与钼酸铵作用产生淡蓝色的磷钼酸铵，遇还原剂后产生亮蓝色络合物钼蓝，比色测定，则可测定出样品中的磷含量。步骤以磷酸二氢钾为标准物，做两个平行组，分别置于25ML的比色管中,依次加入520ML的钼酸铵溶液,摇匀,静置几秒后,分别加入210ML亚硫酸钠溶液和0510ML的对苯二酚溶液,摇匀,加水至刻度,静置30MIN后
42、,以参比调零,在660NM处测定吸光度,以磷酸根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2332样品磷酸根含量的测定取适量的样品于烧杯中,分别加入1ML的浓硝酸和浓硫酸,在电炉上加热至冒烟,待冷却后加入1ML的30的过氧化氢,再缓慢加热,重复以上的步骤直至瓶内不再冒烟,溶液呈无色透明或淡黄色冷却后加入1ML6MOL/ML的盐酸,在电炉上加热使酸彻底分解,用蒸馏水稀释到50ML的容量瓶中。取5ML按照钼蓝比色法的步骤测定磷酸根含量。234磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响磷酸化试剂不同可能导致多糖磷酸化反应的磷酸根接枝量的差异，将三聚磷酸钠和三偏磷酸钠选择为磷酸化试剂，在总量相同的情况下两者
43、按照不同比例与多糖进行磷酸化反应，测定接枝量后选择最优组合，步骤如下准备8个空离心管，编号，浒苔粗多糖并加水溶解制成多糖反应样液，按照以下质量比分别加入三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的混合物7/0,0/7,1/6,2/5,3/4,4/3,5/2,6/1。在温水浴中溶解，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，反应时间2H，反应PH60，用4倍乙醇醇沉24H。冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，消化，将溶液中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷含量。235单因素实验工艺优化影响浒苔粗多糖磷酸化修饰的因素很多。如反应温度、反应时间、反应PH、磷酸化试剂浓度等。为提高浒
44、苔粗多糖的磷酸根含量，采用单因素试验找出影响浒苔粗多糖磷酸根接枝量的关键因素。2351反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响反应温度是影响磷酸化反应的重要因素。根据上面已选出的混合磷酸化试剂，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，反应时间2H，反应PH60，将温度分别设置为20，40，60，80，90，100，反应2H用4倍乙醇醇沉24H。将醇沉后的多糖冷冻干燥，加水复溶后透析，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。2352反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响在化学反应中时间是一个重要的因素，时间不同
45、最后的结果也不相同。我们将反应时间分别设置为2H,3H,4H,5H,6H,7H，研究在不同反应时间下对浒苔多糖磷酸化反应的影响。步骤根据上面选取的磷酸化试剂及其浓度，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，调节反应PH60，在80水浴锅中反应2H后加入4倍体积乙醇，醇沉24H。将醇沉后的多糖冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。2353反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响改变反应环境的PH也可能对反应结果产生影响。将PH作为单因素考察其对反应的影响。步骤根据上面选取的磷酸
46、化试剂，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，将反应样液加入混合磷酸盐后，将PH分别调节为50，60，70，80，90，100，110。反应温度80，反应时间5H，反应完成后加入4倍体积乙醇醇沉24H。冷冻干燥，加水60水浴中复溶，放入透析袋中透析2D（每间隔12H换水一次），冷冻干燥。加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，按照钼蓝比色法测定磷酸根含量。2354磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响在上面步骤中我们选取了两种磷酸化试剂比例为61，但是磷酸化试剂在整个反应中所占的比例对浒苔多糖磷酸化反应也可能产生影响，因此这里将磷酸化试剂浓度作为单因素，研究它对磷酸化修饰的影响。步骤在7个离心管中加
47、入相同体积的反应样液后分别加入002，004，006，008，01，012，014（G/ML）的混合磷酸化试剂（STPPSTMP61）,调节PH60，置于80水浴锅中反应5H加入4倍体积乙醇，醇沉24H，冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。236浒苔粗多糖磷酸化正交试验工艺优化2361正交实验根据单因素实验的结果，选择混合磷酸化试剂浓度、反应温度、反应时间及PH四个因素，各取三个水平，采用L934正交实验设计，因素水平见表1水平A反应温度B反应时间HC反应PHD混
48、合磷酸试剂浓度（G/ML）1704800828059010390610012表1因素水平表TABLE1FACTORLEVELTABLE2362验证试验以优化所得工艺条件进行验证实验,每个实验平行做3份。3结果与讨论31粗多糖的提取采用热水浸提法（工艺参数为温度90，固液比175，时间4H）提取粗多糖得率可达1612。相对于其他对提取浒苔水溶性多糖的研究来说（张智芳等17浸提液PH值50，温度70，固液比180，提取时间为2H，在此实验条件下多糖得率为948）提取率较高，提取效果较为显著。原因可能是提取温度较高提取时间稍长，使浒苔水溶性多糖溶解更加充分导致最终得率的升高。多糖的提取方法很多，主要
49、有热水浸提法、酶法提取、超声法提取、超临界萃取法等。但由于热水浸提法工艺简单，操作方便，得率较高等优点，目前国内提取多糖大多采用热水浸提法，如高梦祥等对海带多糖的提取中运用了此方法，徐大伦16等用热水浸提法通过单因素实验确定其最佳提取工艺条件为浸提时间4H,温度90,固液比为175此外张智芳等也用热水浸提法对浒苔多糖进行工艺优化，设计了单因素四水平的正交实验研究PH、温度、浸提时间和固液比对多糖得率的影响。多糖与蛋白质两种高分子成分共存，且两种物质分子量相近，另外多糖常常与蛋白形成糖蛋白复合物，脱蛋白质成为多糖纯化的一个重要步骤。主要用到的是SEVEAGE法，三氯乙酸法、酶法等。通过比较得出采用木瓜蛋白酶脱蛋白既经济又有效，因此本法中采用木瓜蛋白酶脱蛋白。此外浒苔多糖中还含有大量的色素，色素的取出常采用吸附法（纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等）、离子交换法、金属络合物法等。采用热水浸提法提取浒苔水溶性多糖，操作方便、简单，成本较低，适合工业化大规模提取，对于扩大浒苔多糖在食品工业中的应用范围也有帮助。32样品磷酸根测定Y03957X00214R2099950051152250123456磷酸根浓度（微克/ML）吸光度A图1磷酸根含量标准曲线FIG1THECALIBRATIONCURVEOFPHOSPHAT
