1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程胃蛋白酶法提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺研究一、选题的背景与意义胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的2530,体重的6。胶原蛋白用途广泛,其制品已应用于医药、保健品、食品、化妆品等众多领域。如胶原护肤霜、胶原面膜、胶原美容口服片等系列产品,其内服外用效果良好,满足了当前消费者对功能性产品的强烈需求目前在欧美国家,服用胶原产品进行皮肤深层养护已成时尚11。据专家预测,我国的胶原热潮也即将到来。胶原也是人类皮肤的主要组成成分。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，
2、牛海绵状脑病（BSE）、传染性海绵状脑病（TSE）和口蹄疫（FMD）的爆发使得人们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生恐慌3。另外，由于宗教因素，如犹太教和伊斯兰教，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制2。因此寻找可替代的新来源的胶原蛋白就显得非常迫切4。乌贼加工会产生大量的下脚料,如乌贼皮、侧鳍、内脏、内骨骼等,如果不进行有效处理,不仅会造成环境的污染,而且会浪费大量的宝贵资源。如能充分利用这些成分,不仅可提高乌贼加工的附加值,同时可减少环境污染,获得良好的经济效益与社会效益1。而乌贼皮中胶原蛋白的含量很高，因此成为了可以代替猪、牛等陆生动物的胶原潜在来源。胶原蛋
3、白的提取方法主要包括酶提法和酸提法，而酶提法的胶原蛋白得率比酸提法要大得多5。酸溶胀的鱼皮胶原具有更加松散的结构，从而更易被蛋白酶作用6。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容使用胃蛋白酶法提取乌贼皮中的胶原蛋白，并确定其最优工艺拟解决主要问题1确定最佳醋酸浓度2确定最佳料液比3确定最佳加酶量4确定最佳提取时间三、研究的方法与技术路线31乌贼皮前处理剖开鱼体腹部，剥下乌贼皮剪碎脱脂去杂蛋白离心，去除上清液，制备匀浆液。32单因素试验321酸浓度的选择01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L、20MOL/L322料液比的选择15、110、115、120323提取时间的选择6H、12H
4、、24H、36H、48H、33正交试验选取酸浓度（A）、料液比B、加酶量（C）提取时间D为试验因子，以胶原蛋白的提取率为指标，采用L934正交试验设计，进行酶法提取工艺研究，对酶法提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件进行优化，得到酶法提取的最佳工艺条件。四、研究的总体安排与进度201010820101210查阅资料，外文翻译2篇，完成开题报告、文献综述、开题论证201012102011410做酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的条件优化单因素实验，分别对酸浓度、料液比、提取时间、加酶量进行单因素实验，确定单因素实验各个因素的最佳条件20114102011420根据单因素实验的结果，对酸浓度、料液比、提取时间、
5、提取温度进行正交试验20114212011430整理数据，完成论文，毕业论文答辩五、主要参考文献1张虹,卓素珍,戴志远鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究J中国食品学报200912634402张俊杰,段蕊，许晓静等鱿鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白部分生化性质研究J食品与发酵工业200935（12）57603杨晓燕，贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物1999（2）46474黄焕，王欣，刘宝林鱼鳞胶原蛋白提取技术及其应用J食品科技200934（1）2082115户业丽,吴洁,张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技；2008,22092126王秋卓胶原蛋白的开发利用与展望J河套大学学报201
6、0,7（2）28337郭玉华,刘扬瑞,李钰金鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J中国食品添加剂8刘克海,秦玉青,徐海波鱿鱼皮胶原蛋白的提取及在化妆品中的应用J水产科学2008,27（8）4114139陈冬英胶原蛋白在化妆品中的应用J化工文摘,200264610傅燕凤,沈月新,杨承等淡水鱼鱼皮胶原蛋白的提取J上海水产大学学报2004614615011闫鸣艳狭鳕鱼皮胶原蛋白结构和物理特性的研究D12户业丽，吴洁，张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技200820921213胡二坤,郭兴凤,谭凤猪皮中胶原蛋白的提取J河南工业大学学报自然科学版2006505314罗发兴,薛新顺,
7、罗志刚酸溶液对猪皮中胶原蛋白溶出率的影响J中国酿造200691115TAKESHINAGAIA,YOKOARAKI,NOBUTAKSUZUKIACOLLAGENOFTHESKINOFOCELLATEPUFFERFISHTAKIFUGURUBRIPESJFOODCHEMISTRY78200217317716SITTHIPONGNALINANON,SOOTTAWATBENJAKUL,WONNOPVISESSANGUAN,HIDEKIKISHIMURAUSEOFPEPSINFORCOLLAGENEXTRACTIONFROMTHESKINOFBIGEYESNAPPERPRIACANTHUSTAYENU
8、SJFOODCHEMISTRY1042007593601毕业论文文献综述食品科学与工程胶原蛋白的研究现状综述摘要本文综述了胶原蛋白的结构、功能特性以及水解胶原蛋白的方法，主要包括及其在食品、化妆品、医药等领域的应用，并对其发展前景做了展望。关键词胶原蛋白；水解；结构；特性；应用1前言胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质，占人体内蛋白质总25，相当于体重的6,为重要的功能性蛋白质,主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中,是结缔组织极重要的结构蛋白质,起着支撑器官、保护机体的功能1。胶原蛋白的营养十分丰富。胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸，其中维持人体
9、生长所必需的氨基酸有7种，胶原蛋白中的甘氨酸占30，脯氨酸和羟脯氨酸共占25，是各种蛋白质中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比较高，同时还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸2。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，分子量为300KD，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条A链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，它们交叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构，胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等3。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。胶原蛋白产品
10、具有良好的应用前景2。2胶原蛋白的功能特性胶原是人类皮肤的主要组成成分。人处于幼年时,皮肤中胶原的含量高,随着年龄的增长,其含量开始逐渐下降,导致皮肤渐渐丧失保湿功能,人体只有不断合成新胶原才能保持皮肤健康且具有弹性7。胶原蛋白的阴离子侧链丰富,能吸附大量水分,维持皮肤的湿润、弹性。胶原蛋白含有一种独特的氨基酸羟脯氨酸HYP9,合成新胶原蛋白时需要大量的羟脯氨酸。在医药工业领域里,因胶原蛋白具有良好的生物学特性和低免疫原性,它可作为组织的支持物,对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤修复具有重要作用7。21低免疫原性一般认为胶原具有三种类型的抗原因子第一类是由胶原肽链非螺旋的端肽引起的25；
11、第二类是由胶原三螺旋的构象引起的；第三类是由仅链螺旋区的氨基酸顺序引起的。第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第三类只出现在变性胶原中，而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在6。22生物相容性胶原蛋白的生物相容性是指胶原蛋白与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。胶原本身是构成细胞外基质的骨架，其三股螺旋结构及交联所形成的纤维或网络构成了细胞重要组成成分，对细胞起到锚定和支持作用，并为细胞的增值生长提供适当的微环境6。因此，胶原无论是在被吸收前作为新组织的骨架还是被吸收同化进入宿主，成为宿主组织的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能
12、整体的一部分11。23可生物降解性24胶原具有紧密牢固的螺旋结构，绝大多数蛋白酶只能切断胶原侧链，只有胶原酶、弹性蛋白酶等中性蛋白酶可以降解胶原蛋白，断裂胶原肽键，致使其螺旋结构破坏，而彻底水解小分子多肽或氨基酸，小分子物质可以进入血液循环系统，被机体重新利用或代谢排出12。结缔组织细胞或炎症细胞能吞噬被胶原酶作用所得的大的片段，然后由溶酶体进一步降解为小分子多肤或氨基酸。胶原的可降解性是其作为器官移植材料的基础16。24止血和修复功能23胶原具有止血性能，该性能的发挥通过两方面实现，即促进血小板凝聚和血浆结块。胶原可以与血小板通过粘合、聚集形成血栓起到止血作用。当血管壁的内皮细胞被剥离时，血
13、管中的胶原纤维暴露于血液中，血液中的血小板立刻与胶原纤维吸附在一起，发生凝聚反应，生成纤维蛋白并形成血栓，进而血浆结块阻止血流。胶原的天然结构特别是其足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能力的基础。胶原是参与创伤愈合的主要结构蛋白。胶原蛋白还可促进肉芽组织生成，加速创面的愈合。胶原分子对成纤维细胞的趋化反应，使胶原在伤IZL愈合过程中起重要作用23。3胶原蛋白的提取方法3,5,9,10,12,13水产品胶原蛋白的传统提取方法大致可以分热水提取法、酸处理法和酶处理法。31酸提取法13酸提取法常用的酸有甲酸、乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸、乳酸等。低离子浓度酸可以破坏分子间盐键和希夫氏碱，引起胶原纤维膨胀
14、、溶解。林炜等使皮革固体废弃物在PH值为23、温度105、6MOLLHCI条件下彻底水解8H来提取胶原，得到完全游离的氦基酸。户业丽,吴洁,张瑞12等人对人工养殖的鲟鱼皮胶原蛋白的提取工艺进行详细的探讨如下采用酸法提取胶原蛋白,对提取胶原蛋白过程中酸的种类、酸的浓度、用量、提取时间和提取温度对胶原蛋白提取率的影响进行详细的研究。正交实验表明,酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白的最佳工艺为以10MOL/L的乳酸作为提取剂,采用15的固液比,在20下提取72H,其提取率最高为8618。32酶提取法9,10,11用蛋白酶处理猪皮，不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶
15、原蛋白的三股螺旋结构，保持其优良的物理和生化特性。通常使用的蛋白酶主要有中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。影响酶提取的因素有很多，如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、PH值以及料液比等。在实际操作中，大多数采用酶复合法提取胶原蛋白。LAFARGUE提及从鱼皮、猪皮或牛皮中，采用蛋白酶酶解法提取制备胶原质，其中蛋白酶可选用木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等，经脱脂脱磷、酸处理后可得到生物相容性好的鱼皮胶原蛋白。陈小娥,方旭波,钟秋琴3在以安康鱼皮为原料,采用酶法提取胶原蛋白,用正交实验对安康鱼皮胶原蛋白提取工艺进行优化,并测定了安康鱼皮的基本组成成分和鱼皮胶原蛋白的氨基
16、酸组成。结果表明,胃蛋白酶添加量为1,料液比为110,酶解时间6H,酶解温度为5时鱼皮胶原蛋白提取率最高,提取率为11013。33热水提取法热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，直接在热水中提取已经变性了的胶原蛋白或胶原蛋白水解物的方法，使用的温度有100沸水浴、6O一70、4042、45。钱曼等以草鱼鱼鳞为原料，在料液比120WV，121条件下提取5MIN，最后胶原蛋白的提取率为455716。目前生产胶原蛋白制品的主要原料是猪、牛等陆生哺乳动物的皮、骨和肌腱,因近年来全球生态环境恶化导致疯牛病、口蹄疫等流行病多次发生,使得从陆生动物皮、骨中提取胶原蛋白的危险性增大。欧美、日本等国家相继
17、出台了不少法规,限制将牛等哺乳动物皮骨中的提取物用于食品、医药等对人体有直接影响的产品中7。为此,人们便开始寻求从水产动物中提取胶原蛋白,从鱼体废弃物中提取安全、卫生、无害的胶原蛋白已成为当前国内外业内人士研发的一个热门课题24另外，鱼品在加工的过程中,会产生大量的下脚料,如果不进行有效处理,不仅会造成环境的污染,而且会浪费大量的宝贵资源。如能充分利用这些成分,不仅可提高鱼类加工的附加值,同时可减少环境污染,获得良好的经济效益与社会效益。胶原蛋白含量占鱼体总蛋白的2530,主要分布于鱼鳞和鱼皮中,因此,充分、合理地利用废弃物鱼鳞、鱼皮提取胶原蛋白不仅可推动水产加工业的发展,而且能变废为宝,减少
18、环境污染。本文以乌贼皮为例，对其中的胶原蛋白进行了酸和酶同时提取的工艺研究。4胶原蛋白发展前景胶原蛋白是一种天然蛋白质资源，目前对它的研究开发利用的进展速度很快，主要是因为它重要的作用。胶原蛋白具有紧密的螺旋结构从而显示出很强的韧性和强度；氨基酸组成又使共具有优良的成膜能力，它不仅可以作为保健食品、美容产品、包装材料，还可以作为食品添加剂应用在肉制品改良、冷冻食品、饮料、糕点以及乳制品等中19。在医学领域中，胶原蛋白由于具有低免疫原性、纤维的再形成性、强的机械性能和生物可降解性等优点，作为生物材料广泛的应用。在生物医用材料领域中，胶原蛋白可制成胶原海绵、胶原膜、人工皮肤、固定化美酶载体和胶囊等
19、。胶原蛋白作为一种新型的材料，是一个正待开发的宝藏，随着研究的不断深入，将会有更广阔的应用前景。主要参考文献1张虹，卓素珍，戴志远鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究J中国食品学报，2009，9（6），2张俊杰,段蕊,许晓静等鱿鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白部分生化性质研究J食品与发酵工业，2009，35（12）57593陈小娥,方旭波,钟秋琴安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺研究J2007,3,1311334王学川，任龙芳，强涛涛，等胶原蛋白的研究进展及其在化妆品中的应用J日用化学工业，2005，35（6）3883915张培丽，爱梅，刘欣等淡水鱼皮胶原蛋白提取工艺研究J食品与发酵工业,2006,32（12）1
20、501536J周爱梅,张培丽,刘欣等淡水鱼皮胶原蛋白提取优化工艺研究食品与发酵工业,2007,33（1），1131177丁卓平，刘振华，李仁冬等罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究J水产科技情报2006,334,1901928J8程波，吴洁，张玉蓉等。酶法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白的工艺研究J食品研究与开发，2009,30（3）149郭恒斌,曾庆祝酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究J南方水产,2004,2，1,586310郭文宇,边清泉,刘家琴等木瓜蛋白酶提取草鱼皮胶原蛋白的工艺研究J皮革与化工,2009,261,343611唐文婷木瓜蛋白酶提取鱿鱼皮胶原蛋白的工艺研究J四川食品与发酵，200
21、8，44（5），323412户业丽,吴洁2,张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技，2008,20921213秦玉青,王慥,刘承初鱿鱼皮胶原蛋白的提取利用实验研究J中医研究2002，15（1），202114许庆陵,郭恒斌,曾庆祝鱿鱼皮胶原蛋白制备技术研究J食品研究与开发，2008，9，29，（9），596415胡建平，吴琦，陈惠鲢鱼鳞胶原蛋白的制备及性质研究J食品科技,2010,35123023816钟朝辉,李春美,顾海峰等草鱼鱼鳞酶溶性胶原蛋白的提取及基本特性J水产科学,2007年,262,919417刘艳，刘章武，唐婧苗淡水鱼鳞水解胶原蛋白的酶法制备J食品研究与开发,2
22、009,3069910318张海彬,王军玲鲢鱼鳞片胶原蛋白的提取J水利渔业,2008,282434519黄焕，王欣，刘宝林等木瓜蛋白酶水解鱼鳞胶原蛋白的工艺研究J食品科学，2009,30（24）232520曾嵘,杨忠华,王玉等水产废弃物胶原蛋白的提取J生物加工过程,2008,65273021王吰,刘剑虹,李可伟胃蛋白酶法提取草鱼鳞胶原蛋白的工艺研究J食品研究与开发,2007,28413413622华萍鱼鳞胶原蛋白的酶法提取工艺研究J食品科技2008,293423曹俊鱼鳞胶原蛋白的研究进展和应用前景J水产科技情报2009,361414424刘庆慧,王彩理,刘从力鱼鳞提取物延缓衰老作用研究J海洋水
23、产研究,1999,201757925TAKESHINAGAIA,YOKOARAKI,NOBUTAKSUZUKIACOLLAGENOFTHESKINOFOCELLATEPUFFERFISHTAKIFUGURUBRIPESJFOODCHEMISTRY78200217317726SITTHIPONGNALINANON,SOOTTAWATBENJAKUL,WONNOPVISESSANGUAN,HIDEKIKISHIMURAUSEOFPEPSINFORCOLLAGENEXTRACTIONFROMTHESKINOFBIGEYESNAPPERPRIACANTHUSTAYENUSJFOODCHEMISTRY1
24、042007593601本科毕业设计（20届）胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺研究目录1前言12材料与方法121材料122仪器设备123方法2231乌贼皮基本成分测定2232蛋白酶活力的测定22321试剂22322标准曲线的绘制22323样品测定22324计算2233胶原蛋白得率的测定22331羟脯氨酸标准曲线的绘制922332提取液中羟脯氨酸质量的测定32333胶原蛋白得率的计算3234工艺流程3235乌贼皮的预处理3236单因素实验32361醋酸浓度的选择42362料液比的选择42363胃蛋白酶添加量的选择42364提取时间的选择4237正交实验43结果与讨论431乌贼皮（原料）基本成分
25、分析432胃蛋白酶活力的测定533羟脯氨酸标准曲线的绘制534酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白得率的影响635料液比对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响636胃蛋白酶的用量对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响737酶提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响738正交实验839验证试验94小结9参考文献11摘要胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在水生生物中含量很高。乌贼皮中粗蛋白含量达1664，约占乌贼皮干重的80。本文研究了利用胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件。对提取过程中酸浓度、料液比、酶浓度、提取时间等因素进行了研究。在单因素实验的基础上，做了正交实验，实验结果表明，胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳工
26、艺条件为在4下，酸浓度为01MOL/L，料液比为120，加酶量1400U/G，提取时间为12H，在此条件下得胶原蛋白的得率为1109。关键词胃蛋白酶乌贼皮胶原蛋白提取羟脯氨酸ABSTRACTCOLLAGENISTHEMOSTIMPORTANTSTRUCTURALPROTEININORGANISMSCRUDEPROTEINCONTENTIS1664INSQUIDSKIN,ACCOUNTINGFOR80OFITSDRYWEIGHTITEXISTSINTHESURFACEOFALLAQUATICORGANISMSSQUIDSKINCOLLAGENEXTRACTIONBYPEPSINISSTUDIED
27、INTHISPAPERTHEEXTRACTIONTECHNOLOGYINCLUDINGACETICACIDCONCENTRATION,SOLIDTOLIQUIDRATIO,ENZYMECONCENTRATION,IMMERSIONTIMEWASDISCUSSEDSINGLEFACTOREXPERIMENTSANDORTHOGONALTESTSHOWEDTHATTHEPARAMETERSAREASFOLLOWSAT4,IN01MOL/LACETICACIDBUFFERSOLUTION,THEADDEDENZYMEDOSAGEIS1400U/GANDTHEWEIGHTRATIOOFSKINTOSO
28、LVENTIS1TO20,IMMERSIONTIMEIS12H,THERECOVERYOFTHECOLLAGENSWAS1109KEYWORDSPEPSINSQUIDSKINCOLLAGENEXTRACTIONHYDROXYPROLINE11前言胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原广泛存在于从低等脊椎动物的体表面到哺乳动物机体的一切组织中，胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的2530,体重的61。胶原蛋白用途广泛,其制品已应用于医药、保健品、食品、化妆品等众多领域。如胶原护肤霜、胶原面膜、胶原美容口服片等系列产品,其内服外用效果良好,
29、满足了当前消费者对功能性产品的强烈需求目前在欧美国家,服用胶原产品进行皮肤深层养护已成时尚11。据专家预测,我国的胶原热潮也即将到来。胶原也是人类皮肤的主要组成成分。人处于幼年时,皮肤中胶原的含量高,随着年龄的增长,其含量开始逐渐下降,导致皮肤渐渐丧失保湿功能,人体只有不断合成新胶原才能保持皮肤健康且具有弹性。胶原蛋白的阴离子侧链丰富,能吸附大量水分,维持皮肤的湿润、弹性2。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病（BSE）、传染性海绵状脑病（TSE）和口蹄疫（FMD）的爆发使得人们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生恐慌3。另外，由于宗教因素，如犹太教和伊斯兰
30、教，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制2。因此寻找可替代的新来源的胶原蛋白就显得非常迫切4。乌贼加工会产生大量的下脚料,如乌贼皮、侧鳍、内脏、内骨骼等,如果不进行有效处理,不仅会造成环境的污染,而且会浪费大量的宝贵资源。如能充分利用这些成分,不仅可提高乌贼加工的附加值,同时可减少环境污染,获得良好的经济效益与社会效益1。而乌贼皮中胶原蛋白的含量很高，因此成为了可以代替猪、牛等陆生动物的胶原潜在来源。胶原蛋白的提取方法主要包括酶提法和酸提法，而酶提法的胶原蛋白得率比酸提法要大得多5。酸溶胀的鱼皮胶原具有更加松散的结构，从而更易被蛋白酶作用6。因此本文采用加酸辅助胃蛋白酶提取乌贼
31、皮中胶原蛋白的方法进行实验，分别对醋酸浓度、料液比（原料鱼皮W/酸体积V）、加酶量、酶解时间几个因素做单因素实验，并根据单因素实验结果选择醋酸浓度、料液比（原料鱼皮W/酸体积V）、加酶量、酶解时间四个因素，做四因素三水平正交实验，从而得出酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的特点。2材料与方法21材料金乌贼SEPIAESCULENTAHOYLE，购买于宁波市庄市；胃蛋白酶，美国AMRESCO公司，冷藏于冰箱中；其余化学试剂，均为分析纯。22仪器设备组织捣碎匀浆机DS1上海标本模型厂电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司DKS24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司冷冻高速离心机湖南湘仪
32、离心机仪器有限公司T6新锐可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司数显电热鼓风干燥器1012A型上海锦屏仪器仪表有限公司凯氏定氮装置，消化炉，马福炉等。223方法231乌贼皮基本成分测定参照国家标准GB/T5009系列（2003年版），新鲜乌贼皮（金乌贼）的水分采用GB/T500932003直接干燥法；灰分参照GB/T500942003；蛋白质采用GB/T500952003第一法；总糖采用苯酚硫酸法测定。232蛋白酶活力的测定2321试剂福林试剂FOLIN试剂；04MOL碳酸钠溶液；04MOL三氯乙酸TCA溶液；2酪蛋白溶液；100G/ML酪氨酸溶液7。2322标准曲线的绘制分别吸取不同浓度
33、酪氨酸1ML，各加入04MOL碳酸钠5ML，再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN在660NM波长测OD值。一般测三次，取平均值，同时做空白试验。2323样品测定称取酶粉0100G，加入PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML，吸取此液5ML，再用缓冲液稀释至25ML，即成5000倍的酶粉稀释液。取样品稀释液1ML，置于40水浴中预热2MIN，再各加入经同样预热的酪蛋白1ML，精确保温10MIN，时间到后，立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML，以终止反应，继续置于水浴中保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取滤液1ML，再加04MOL碳酸钠5ML，已
34、稀释的福林试剂1ML，摇匀，40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML，使酶失活，再加入酪蛋白7。2324计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基10A4NW11式中A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44ML反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；W样品水分百分含量。233胶原蛋白得率的测定胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸（HYDROXYPROLINE，以下简称HYP）和羟赖氨酸在其它蛋
35、白中很少见6，为胶原蛋白所特有。通过测定羟脯氨酸的质量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的质量8。2331羟脯氨酸标准曲线的绘制9参考闫鸣艳9的方法绘制羟脯氨酸标准曲线，略有改变。配置羟脯氨酸标准工作液精确称取L羟脯氨酸标准品100MG，加入0001MOL/L盐酸中溶解，稀释并3定容到100ML。取其中1ML定容到100ML容量瓶中，该为质量浓度为10UG/ML的标准工作液。准确吸取羟脯氨酸标准工作于10、20、30、40、50ML，分别用蒸馏水定容到10ML，得到浓度分别为1G/ML，2G/ML，3G/ML，4G/ML，5G/ML的羟脯氨酸标准溶液。取上述标准液各1ML于试管中，以000
36、1MOL/L的盐酸溶液作为空白液，在标准溶液和空白液中分别加入1ML的氯胺T溶液，混匀，室温下静置10MIN，再加入1ML的高氯酸溶液，混匀，室温下静置5MIN，最后加入对二甲基苯甲醛溶液1ML，混匀，60加热20MIN进行显色反应，至于冷水中冷却。以空白液调零，测定560NM处得吸光度，绘制标准曲线。2332提取液中羟脯氨酸质量的测定吸取5ML提取液于具塞试管中，加入6MOL/L的盐酸5ML，封口后于130下水解4H。冷却后取出，用蒸馏水定容至10ML，脱色，滤纸过滤，取滤液1ML，调PH至中性后定容至50ML9。吸取1ML样品溶液，按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸
37、光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品液中羟脯氨酸含量。提取液中羟脯氨酸质量按下式计算羟脯氨酸质量（MG）H10稀释倍数V提式中H标准曲线上相对应的羟脯氨酸的含量（G/ML）；V提提取液的总体积（ML）。2333胶原蛋白得率的计算胶原蛋白质量（）羟脯氨酸质量（MG）系数胶原蛋白得率（）提取液胶原蛋白质量（G）/原料质量（G）100由于HYP含量与胶原蛋白的含量是呈正相关性,将测定的HYP含量乘以相应的系数即可得出胶原蛋白的含量，本文中该系数取11110。234工艺流程剪碎的乌贼皮脱脂除杂蛋白匀浆加入酸溶液加入胃蛋白酶酶解沸水浴加热10MIN，使酶失活离心（8000RMIN1）20MIN取上清液定容
38、，测定提取液中羟脯氨酸质量，计算胶原蛋白得率。235乌贼皮的预处理（1）新鲜乌贼皮从乌贼体剥下后，仔细地将皮下肉、脂肪及结缔组织剔除，流水冲洗，室温晾干后剪碎，冷冻贮藏于冰箱中。实验前取出冷冻的碎鱼皮，室温下解冻晾干。（2）脱脂称量10G碎鱼皮，放入含1（VV）H2O2的001MOL/L氢氧化钠溶液120,W/V中，4下浸泡3H，之后水洗至中性，2000R/MIN离心20MIN，弃去滤液，取沉淀。（3）除杂蛋白将脱脂后乌贼皮（即沉淀）放入02MOL/L氯化钠溶液130,W/V中，4下浸泡6H，每3H更换一次溶液，之后水洗，2000R/MIN离心20MIN，弃去滤液，残渣待用。（4）所得残渣加水
39、至100G，间歇匀浆10MIN，制成匀浆液。236单因素实验分别吸取1000G匀浆液到锥形瓶中，加入适量的胃蛋白酶和酸溶液，于一定温度下提取一定时间，完成后沸水浴10MIN灭酶，静止冷却，8000R/MIN离心20MIN，取上清液定容，测定提取液中羟脯氨酸质量，计算胶原蛋白得率。试验所有提取条件的选择都以等量鱼皮提取后所得胶原蛋白得率作为指标。由于在低温下（4），胃蛋白酶更倾向于切除胶原蛋白的非螺旋结构的端肽，因而不会造成胶原结构的深度破坏。一般来说，胃蛋白酶活性在低PH条件下增强。而在室温2628下，胃蛋白酶表现出更高4的活性而且能够随意的切除鱼皮中溶胀的胶原蛋白分子，但胶原分子结构在深度反
40、应条件下被破坏11。因此，实验酶解温度都在4下进行。2361醋酸浓度的选择加酶量为1400U/G胃蛋白酶，料液比为110，实验在4进行，提取12H。醋酸浓度分别为01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L和20MOL/L。2362料液比的选择加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，实验在4进行，提取12H。料液比（乌贼皮酸溶液，WV）分别为15、110、115、120和125。2363胃蛋白酶添加量的选择醋酸浓度05MOL/L，料液比为110，实验在4进行，提取12H。加酶量分别为700U/G、1400U/G、2100U/G和2800U/G。2364提取时间的选择加酶量为1
41、400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，料酸比为110，实验在4进行。提取时间分别为6H、12H、24H、36H和48H。237正交实验根据单因素实验结果，选取酸浓度（A）、料液比B、胃蛋白酶用量（C）和酶解时间D为试验因子，以胶原蛋白的得率为指标，采用L934正交试验设计，进行提取，对酶法提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件进行优化表1，得到酶法提取的最佳工艺条件。水平LEVELS醋酸浓度（MOL/L）ACIDCONCENTRATION（MOL/L）料液比（原料酸）（W/V）SOLIDLIQUIDRATIO（W/V）加酶量U/GENZYMEDOSAGEU/G酶解时间HHYDROLYSISTI
42、MEH1011157006205120140012310125210024表1正交实验因素及水平表TABLE1FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALTEST3结果与讨论31乌贼皮（原料）基本成分分析表2乌贼皮一般成分表（以湿重计）TABLE2PROXIMATECOMPOSITIONOFSQUIDSKIN水分MOISTURE灰分ASH总糖TOTALSUGAR脂肪FAT蛋白PROTEIN含量（CONTENT796204520412516645从表2中可看出，乌贼皮虽是水产品加工的废弃物，但是其中含有丰富的蛋白质，粗蛋白含量达1664，约占乌贼皮干重的80。32胃蛋白酶活力的测定所
43、得酶活力标准曲线回归方程为Y00115X00095,相关系数R209987,其中Y为吸光度X为酪氨酸浓度UG/ML,标准曲线见图1。002040608112020406080100120酪氨酸浓度G/ML吸光度图1胃蛋白酶活力标准曲线FIG1THESTANDARDCURVESOFPEPSINACTIVITY根据福林（FOLIN）法操作说明与酶活力标准曲线，测得胃蛋白酶活力为14000U/G。33羟脯氨酸标准曲线的绘制参照文献9测定不同浓度的羟脯氨酸的A560值，根据可见分光光度计测定的数值，绘制羟脯氨酸标准曲线，如图2。用计算机拟合出标准回归方程为Y00546X00071，Y为吸光度值，X为羟
44、脯胺酸的浓度（G/ML）。羟脯氨酸浓度与吸光度之间呈直线相关（R209994）。因此，由此标准回归方程计算羟脯氨酸浓度准确可靠。通过该曲线方程，可得到羟脯氨酸含量，从而最终通过计算得到胶原蛋白得率13。Y00546X00071R2099940010203040506024681012羟脯氨酸含量（UG/ML）吸光度（A）吸光度（A）线性吸光度（A）图2羟脯氨酸的标准曲线FIG2THESTANDARDCURVESOFHYDROXYPROLINE634酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白得率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G胃蛋白酶，料液比为110，实验在4进行，提取
45、12H。醋酸浓度分别为01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L、20MOL/L。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图3所示。5678910110020406081121416醋酸浓度（MOL/L）胶原蛋白得率（）图3不同酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白提取的影响FIG3EFFECTOFDIFFERENTTACIDCONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN由图3可知，乙酸浓度为05MOL/L时，胶原蛋白得率最高，当酸浓度大于05MOL/L时，胶原蛋白提取率随着酸浓度的增大而减少，因此，提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳酸浓度为05MOL/L。35料液比对
46、乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，实验在4进行，提取12H。料液比（乌贼皮酸溶液，WV）分别为15、110、115、120和125。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图4所示。5678910111213105110115120125料液比胶原蛋白得率（）图4不同料液比对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响FIG4EFFECTOFDIFFERENTSOLIDLIQUIDRATIOONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN7由图4可知，固液比较小时，乌贼皮在溶液中密度太大，不能完全提
47、取，提取率低，随着料液比逐渐增大，胶原蛋白提取率整体呈现出上升的趋势，而当料液比到达120后，提取率开始减少，因此，乌贼皮中胶原蛋白提取率的最佳料液比选择120。36胃蛋白酶的用量对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。醋酸浓度05MOL/L，料液比为110，实验在4进行，提取12H。加酶量分别为700U/G、1400U/G、2100U/G和2800U/G。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图5所示。567891011050010001500200025003000加酶量（U/G）胶原蛋白得率（）图5不同胃蛋白酶用来对乌贼平中胶原蛋白提取率的影响FIG5EF
48、FECTOFDIFFERENTPEPSINCONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN由图5所示，随胃蛋白酶用量的增加，胶原蛋白的提取率也增加，但胃蛋白酶用量超过1400U/G后，胶原蛋白提取率增加很缓慢。因此，从经济的角度考虑，胃蛋白酶的最佳用量为1400U/G较为合适。37酶提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，料酸比为110，实验在4进行。提取时间分别为6H、12H、24H、36H和48H。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图6所示。由图
49、6可知，胶原蛋白提取率随着浸提时间的增加而增大，但在12H内，随浸提时间延长，胶原蛋白提取率增加较快，而超过12H后，提取率的增加变得很慢，因而，以1400U/G酶蛋白酶05MOL/L的乙酸为浸提剂，110的料液比条件下，提取时间12H为最佳。866577588599510105110102030405060时间（H）胶原蛋白得率（）图6不同浸提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响FIG6EFFECTOFDIFFERENTIMMERSIONTIMEONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN38正交实验根据单因素酶解的试验结果，选取4因素3水平正交组合试验L934,确定酶提乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺条件。选取胃蛋白酶用量（A），酶解时间B，提取时间（C）和原料的固液比D为因素，每个因素三个水平，在4下进行正交试验，进行酶法提取工艺研究，测定了9组胃蛋白酶水解液的HYP含量，结果如表3所示。结果见表3。1根据极差确定因素的主次顺序由表54得出实验极差因素CDBA，说明影响因素排列依次为加酶量酶解时间料液比酸浓度。2较佳工艺的确定在该试验中，HYP含量越大越好，所以应挑选每个因素的K1、K2、K3中对应的那个水平，由
