1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的条件优化一、选题的背景与意义胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的2530,体重的6。胶原蛋白在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。以往胶原蛋白的提取主要由哺乳动物牛、猪等的皮、骨、筋腱中得到,对水产动物中的胶原蛋白研究较少,而近年来随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等人畜共患病的爆发,引起了人们对使用这些来源的产品卫生及健康状况的关注与担心。另外，由于宗教因素，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制。因此寻
2、找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。水产品加工副产物约有30为鱼皮和鱼骨，其胶原含量很丰富。利用这些副产物来提取胶原，不仅能提高水产品的附加值，充分有效地利用生物资源，而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。水产品胶原营养丰富，主要应用于组织工程、临床及整形医学方面，同时还是制取水产活性肽的重要原料。与陆生动物的胶原蛋白相比，其特性、组成及溶液的性质都存在显著的差异，因此开发水产胶原蛋白不仅扩大了胶原蛋白的原料来源，还拓宽了胶原蛋白的应用范围。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容使用酸法提取乌贼皮中的胶原蛋白，并确定其最优条件拟解决主要问题1确定酸种类2确定酸浓度及最
3、优酸浓度3确定酸的添加量4确定料液比5确定提取温度6确定提取时间三、研究的方法与技术路线31乌贼皮前处理剖开鱼体腹部，剥下乌贼皮剪碎去杂蛋白离心，去除上清液32单因素试验321酸浓度的选择01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L、20MOL/L322料液比的选择110、120、130、140323提取温度的选择4、15、20、25324提取时间的选择12H、24H、36H、48H、72H33正交试验选取酸用量（A）、料液比D、提取温度（C）、提取时间B为试验因子，以胶原蛋白的提取率为指标，采用L934正交试验设计，进行酶法提取工艺研究，对酶法提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件进行优化表1，得
4、到酶法提取的最佳工艺条件。四、研究的总体安排与进度20101082010125查阅资料，外文翻译2篇，完成开题报告、文献综述、开题论证2010126201126做酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的条件优化单因素实验，分别对酸浓度、料液比、提取时间、提取温度进行单因素实验，确定单因素实验各个因素的最佳条件2011272011420根据单因素实验的结果，对酸浓度、料液比、提取时间、提取温度进行正交试验20114212011510整理数据，完成论文，毕业论文答辩五、主要参考文献1张虹,卓素珍,戴志远鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究J中国食品学报200912634402张俊杰,段蕊，许晓静等鱿鱼鱼皮酶溶性胶
5、原蛋白部分生化性质研究J食品与发酵工业200935（12）57603杨晓燕，贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物1999（2）46474黄焕，王欣，刘宝林鱼鳞胶原蛋白提取技术及其应用J食品科技200934（1）2082115户业丽,吴洁,张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技；2008,22092126王秋卓胶原蛋白的开发利用与展望J河套大学学报2010,7（2）28337郭玉华,刘扬瑞,李钰金鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J中国食品添加剂8刘克海,秦玉青,徐海波鱿鱼皮胶原蛋白的提取及在化妆品中的应用J水产科学2008,27（8）4114139陈冬英胶原蛋白在化妆品中的
6、应用J化工文摘,200264610傅燕凤,沈月新,杨承等淡水鱼鱼皮胶原蛋白的提取J上海水产大学学报2004614615011闫鸣艳狭鳕鱼皮胶原蛋白结构和物理特性的研究D12户业丽，吴洁，张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技200820921213胡二坤,郭兴凤,谭凤猪皮中胶原蛋白的提取J河南工业大学学报自然科学版2006505314罗发兴,薛新顺,罗志刚酸溶液对猪皮中胶原蛋白溶出率的影响J中国酿造200691115EL_ZBIETASKIERKA,MARIASADOWSKATHEINFLUENCEOFDIFFERENTACIDSANDPEPSINONTHEEXTRACTA
7、BILITYOFCOLLAGENFROMTHESKINOFBALTICCODGADUSMORHUAJFOODCHEMISTRY20071302130616SRODZIEWICZMOTOWIDO,ALADEWSKA,EMULKIEWICZISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFATHERMALLYSTABLECOLLAGENPREPARATIONFROMTHEOUTERSKINOFTHESILVERCARPHYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXJAQUACULTURE2008130134毕业论文文献综述食品科学与工程乌贼皮胶原蛋白的研究应用摘要乌贼皮胶原蛋白制备
8、技术研究，在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质，以往胶原蛋白的提取主要由哺乳动物牛、猪等的皮、骨、筋腱中得到,对水产动物中的胶原蛋白研究较少,而近年来随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等人畜共患病的爆发,引起了人们对使用这些来源的产品卫生及健康状况的关注与担心。水产品加工副产物约有30为鱼皮和鱼骨，其胶原含量很丰富。利用这些副产物来提取胶原，不仅能提高水产品的附加值，充分有效地利用生物资源，而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。关键词胶原蛋白酸法提取提取技术胶原蛋白是人体中重要的结构蛋白质，胶原分子为分泌性糖蛋白。胶原蛋白分子是长290NM，直径15NM的棒状结构蛋白，
9、棒状结构又由三条纤维形成一组锁链型的螺旋状结构，构成三条锁链的每一条，大约由1000个氨基酸相连而成，三条合计约有3000个氨基酸。胶原蛋白并非完全由20种氨基酸相连而成，而是由18种氨基酸构成。1、胶原蛋白研究的现状胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的25301,体重的6。胶原蛋白在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。以往胶原蛋白的提取主要由哺乳动物牛、猪等的皮、骨、筋腱中得到,对水产动物中的胶原蛋白研究较少,而近年来随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等人畜共患病的爆发,引起了人们
10、对使用这些来源的产品卫生及健康状况的关注与担心。另外，由于宗教因素，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制。因此寻找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。水产品加工副产物约有30为鱼皮和鱼骨，其胶原含量很丰富2。利用这些副产物来提取胶原，不仅能提高水产品的附加值，充分有效地利用生物资源，而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。水产品胶原营养丰富，主要应用于组织工程、临床及整形医学方面，同时还是制取水产活性肽的重要原料。与陆生动物的胶原蛋白相比，其特性、组成及溶液的性质都存在显著的差异，因此开发水产胶原蛋白不仅扩大了胶原蛋白的原料来源，还拓宽了胶原蛋白的应用范围。现在
11、，对乌贼的研究已比较深入了，可以说，乌贼的一身都是宝。乌贼墨具有抗肿瘤作用，抗辐射作用和止血作用。乌贼骨也具有抗肿瘤作用。乌贼肉具有活血化瘀之效，不但补气、补血，还可滋阴。乌贼血据本草纲目记载，可主治耳聋3。乌贼卵可用于开胃利水。但对于乌贼皮的研究较少，而乌贼皮中的胶原蛋白含量较高，能提供新的胶原蛋白提取源。乌贼皮来源丰富，从乌贼皮中提取胶原蛋白可提高胶原蛋白的利用率。2、乌贼皮胶原蛋白的提取技术泌、酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白,主要低离子浓度酸性条件破坏分子间的盐键和希夫碱,而引起纤维膨胀、溶解,溶剂使用的酸,主要有醋酸、盐酸、柠檬酸等4,采用酸法提取的胶原通常成
12、为酸溶性胶原蛋白ACIDSOLUBILIZEDCOLLAGENASC。酸溶解法可将交联的胶原分子溶解出来,也可溶解含有醛胺类交联键的胶原,但不适合从酮亚胺交联键较为丰富的组织提取胶原,例如骨、软骨或来自于年代较老动物的组织等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法,用酸法提胶原最大程度的保持了其三螺旋结构,收适用于医用生物材料及原料的制备。敛、影响酸法提取胶原蛋白的因素主要是酸的种类、酸的浓度、提取时间,提取温度和固液比5。这几个因素对胶原蛋白提取率影响程度依次为酸浓度提取时间温度固液比。酸法胶原蛋白的起泡性和泡沫稳定性较酶法和水解法为最好,蛋白质良好的起泡性和泡沫稳定性在食品工业上有着重要的
13、作用。同时，酸法提取的胶原蛋白的即时乳化性最好6。21鱿鱼皮基本组成成分测定水分，直接干燥法测定7；灰分，550灼烧法测定8；粗蛋白，微量凯氏定氮法测定7；粗脂肪，索氏脂肪抽提法测定；总糖，蒽酮比色法8。22去除非胶原蛋白取出冷冻的乌贼皮,流水化冻后,加6NACL,在110的样水比条件下浸泡12H9，洗涤，除去可溶性的非胶原蛋白，再以乙醚/异丙醇/蒸馏水228浸泡去除脂肪,至脂肪除尽。23提取胶原蛋白样品去除非胶原蛋白后，将酸的种类、酸的浓度、提取时间和固液比按四因素三水平进行正交试验，确定最优条件。之后，提纯胶原蛋白提取液，测定羟脯氨酸含量，进而确定提取的胶原蛋白含量。3胶原蛋白的应用胶原蛋
14、白最早除了作为食品外，是作为接着计来黏合家具、乐器9等，进而应用到医学上的药物胶囊和片剂等。随着对胶原蛋白的进一步研究人们逐渐认识了他的一些更具价值的生物特性，从而更进一步的扩展了它的应用领域，如利用胶原蛋白制品的保湿性高、透气性佳和无毒特性，可制作隐形眼镜，较之塑料制品更佳。近年来，各种胶原蛋白制品迅速充斥市场，越来越广泛的被应用于医药与医疗、化妆品、生物材料、食品工业、化工等方面。胶原蛋白及其多肽因含有多种氨基酸,易消化,一直受到食品领域的关注,食用明胶和可食性肠衣是两个主要产品。胶原蛋白由于具有较高的粘度、乳化性等特性,可以作为食品添加剂加入到食品中。胶原蛋白及多肽由于其独特的生理功能及
15、特点,可用于开发多种健康食品10。此外,胶原蛋白及其降解产物还可用于冷冻食品改良剂、肉制品添加剂、饮料澄清剂、乳制品添加剂及胶原小食品等。胶原可作为生物材料用作心脏瓣膜、创伤和烧伤修复材料、止血剂、人工皮肤、固定化酶和提取胶囊等。在美容、矫形方面,胶原蛋白可用于小型皮肤缺损修复及组织缺损修复,是理想的医用材料11。制革工艺过程中剩下的废弃物中含有丰富的胶原蛋白,可以提取出来用作饲料的动物蛋白资源12,实现资源利用,同时近年来胶原蛋白在造纸工业、制革工业、日用化工业等轻工业中也有越来越多的应用。参考文献1张虹，卓素珍，戴志远鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究J中国食品学报200912634402
16、张俊杰，段蕊，许晓静等鱿鱼鱼皮酶溶性胶原蛋白部分生化性质研究J食品与发酵工业200935（12）57603杨晓燕，贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物1999（2）46474黄焕，王欣，刘宝林鱼鳞胶原蛋白提取技术及其应用J食品科技200934（1）2082115户业丽,吴洁,张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技2008,22092126陈水华食品分析M中国轻工业出版社，20057林颖，吴毓敏，吴雯等天然产物研究与开发J天然产物中的糖含量测定方法正确性的研究1996，83588丁卓平，刘振华，李仁冬等罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究J水产科技情报2006,3341901929
17、郭恒斌，曾庆祝酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究J南方水产2008,4（1）586310王秋卓胶原蛋白的开发利用与展望J河套大学学报2010,7（2）283311郭玉华,刘扬瑞,李钰金鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J中国食品添加剂12刘克海，秦玉青，徐海波鱿鱼皮胶原蛋白的提取及在化妆品中的应用J水产科学2008,27（8）41141313EL_ZBIETASKIERKA,MARIASADOWSKATHEINFLUENCEOFDIFFERENTACIDSANDPEPSINONTHEEXTRACTABILITYOFCOLLAGENFROMTHESKINOFBALTICCODGADUSMOR
18、HUAJFOODCHEMISTRY20071302130614SRODZIEWICZMOTOWIDO,ALADEWSKA,EMULKIEWICZISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFATHERMALLYSTABLECOLLAGENPREPARATIONFROMTHEOUTERSKINOFTHESILVERCARPHYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXJAQUACULTURE200813013415户业丽，吴洁，张瑞等酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究J食品科技200820921216秦玉青，刘承初鱿鱼皮胶原蛋白的测定与回收J上海水产大学学报20026
19、13814417胡二坤，郭兴凤，谭凤猪皮中胶原蛋白的提取J河南工业大学学报自然科学版2006505318罗发兴，薛新顺，罗志刚酸溶液对猪皮中胶原蛋白溶出率的影响J中国酿造2006911本科毕业设计（20届）酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的条件优化目录1前言1111胶原蛋白研究的现状1112乌贼皮胶原蛋白的提取技术1213胶原蛋白的应用122材料与方法1321原料1322实验试剂1422实验仪器1423试验方法14231胶原蛋白的测定142311羟脯氨酸标准曲线的绘制152312提取液中羟脯氨酸质量的测定152313胶原蛋白得率的计算15232工艺流程15233原料处理16234酸法提取乌贼皮中胶原蛋
20、白的单因素实验16235正交实验163结果与分析1731羟脯氨酸标准曲线的绘制1732料液比对胶原蛋白得率的影响1833提取时间对胶原蛋白得率的影响1934酸浓度对胶原蛋白得率的影响2035温度对胶原蛋白得率的影响2136正交实验确定醋酸提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺条件224实验结论23参考文献24致谢错误未定义书签。摘要以往胶原蛋白的提取主要由哺乳动物牛、猪等的皮、骨、筋腱中得到,对水产动物中的胶原蛋白研究较少,而近年来随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等人畜共患病的爆发,引起了人们对使用这些来源的产品卫生及健康状况的关注与担心。寻找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。影响酸法提取胶原蛋白的
21、因素主要是酸的浓度、提取时间,提取温度和料液比。针对这四个因素先进行单因素试验，再进行正交试验。正交实验表明,酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺为以20MOL/L的醋酸作为提取剂,采用130的料液比,在4下提取72H,其得率最高。关键字乌贼；提取；得率ABSTRACTEXTRACTIONOFCOLLAGENINTHEPASTMAINLYBYMAMMALSCATTLE,PIGS,ETCOFTHESKIN,BONE,TENDONSGETONAQUATICANIMALS,FEWSTUDIESINTHECOLLAGEN,ANDINRECENTYEARSWITHMADCOWDISEASE,FOOTAND
22、MOUTHDISEASE,AVIANFLUANDOTHERLIVESTOCKWERETHEOUTBREAKOFILLNESSCAUSEDPEOPLETOUSETHESESOURCESOFHEALTHANDHEALTHPRODUCTSCONCERNANDWORRYLOOKINGFORALTERNATIVESOURCESOFNEWCOLLAGEN,ITISVERYURGENTACIDEXTRACTIONOFCOLLAGENISTHEMAINFACTORACIDCONCENTRATION,EXTRACTIONTIME,EXTRACTIONTEMPERATUREANDSOLIDTOLIQUIDRATI
23、OTHESEFOURFACTORSFORTHESINGLEFACTORTESTBEFORE,DURINGORTHOGONALORTHOGONALTESTSHOWEDTHATACIDEXTRACTIONOFCOLLAGENPROTEININSQUIDSKINISTHEBESTPROCESSTO20MOL/LACETICACIDASEXTRACTANT,USING130OFTHESOLIDTOLIQUIDRATIO,EXTRACTIONAT4FOR72H,THEHIGHESTRATEOFITSEXTRACTIONKEYWORDSSQUID；EXTRACTION；EXTRACTIONRATE1前言胶
24、原蛋白是人体中重要的结构蛋白质，胶原分子为分泌性糖蛋白。胶原蛋白分子是长290NM，直径15NM的棒状结构蛋白，棒状结构又由三条纤维形成一组锁链型的螺旋状结构，构成三条锁链的每一条，大约由1000个氨基酸相连而成，三条合计约有3000个氨基酸。胶原蛋白并非完全由20种氨基酸相连而成，而是由18种氨基酸构成。11胶原蛋白研究的现状胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的25301,体重的6。胶原蛋白在皮革、化妆品、食品、膜工业、制药业、生物医学材料等方面应用广泛。以往胶原蛋白的提取主要由哺乳动物牛、猪等的皮、
25、骨、筋腱中得到,对水产动物中的胶原蛋白研究较少,而近年来随着疯牛病、口蹄疫、禽流感等人畜共患病的爆发,引起了人们对使用这些来源的产品卫生及健康状况的关注与担心。另外，由于宗教因素，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制。因此寻找可替代的新的来源的胶原蛋白就显得非常迫切。水产品加工副产物约有30为鱼皮和鱼骨，其胶原含量很丰富2。利用这些副产物来提取胶原，不仅能提高水产品的附加值，充分有效地利用生物资源，而且还能减少由于不经处理就直接丢弃造成的环境污染。水产品胶原营养丰富，主要应用于组织工程、临床及整形医学方面，同时还是制取水产活性肽的重要原料。与陆生动物的胶原蛋白相比，其特性、组成
26、及溶液的性质都存在显著的差异，因此开发水产胶原蛋白不仅扩大了胶原蛋白的原料来源，还拓宽了胶原蛋白的应用范围。现在，对乌贼的研究已比较深入了，可以说，乌贼的一身都是宝。乌贼墨具有抗肿瘤作用，抗辐射作用和止血作用。乌贼骨也具有抗肿瘤作用。乌贼肉具有活血化瘀之效，不但补气、补血，还可滋阴。乌贼血据本草纲目记载，可主治耳聋3。乌贼卵可用于开胃利水。但对于乌贼皮的研究较少，而乌贼皮中的胶原蛋白含量较高，能提供新的胶原蛋白提取源。乌贼皮来源丰富，从乌贼皮中提取胶原蛋白可提高胶原蛋白的利用率。12乌贼皮胶原蛋白的提取技术泌酸法提取是利用一定浓度的酸溶液在一定的条件下提取胶原蛋白,主要低离子浓度酸性条件破坏分
27、子间的盐键和希夫碱,而引起纤维膨胀、溶解,溶剂使用的酸,主要有醋酸、盐酸、柠檬酸等4,采用酸法提取的胶原通常成为酸溶性胶原蛋白ACIDSOLUBILIZEDCOLLAGENASC。酸溶解法可将交联的胶原分子溶解出来,也可溶解含有醛胺类交联键的胶原,但不适合从酮亚胺交联键较为丰富的组织提取胶原,例如骨、软骨或来自于年代较老动物的组织等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法,用酸法提胶原最大程度的保持了其三螺旋结构,收适用于医用生物材料及原料的制备。酸法胶原蛋白的起泡性和泡沫稳定性较酶法和水解法为最好,蛋白质良好的起泡性和泡沫稳定性在食品工业上有着重要的作用。同时，酸法提取的胶原蛋白的即时乳化性
28、最好5。13胶原蛋白的应用胶原蛋白最早除了作为食品外，是作为接着计来黏合家具、乐器等，进而应用到医学上的药物胶囊和片剂等。随着对胶原蛋白的进一步研究人们逐渐认识了他的一些更具价值的生物特性，从而更进一步的扩展了它的应用领域，如利用胶原蛋白制品的保湿性高、透气性佳和无毒特性，可制作隐形眼镜，较之塑料制品更佳。近年来，各种胶原蛋白制品迅速充斥市场，越来越广泛的被应用于医药与医疗、化妆品、生物材料、食品工业、化工等方面。胶原蛋白及其多肽因含有多种氨基酸,易消化,一直受到食品领域的关注,食用明胶和可食性肠衣是两个主要产品。胶原蛋白由于具有较高的粘度、乳化性等特性,可以作为食品添加剂加入到食品中。胶原蛋
29、白及多肽由于其独特的生理功能及特点,可用于开发多种健康食品6。此外,胶原蛋白及其降解产物还可用于冷冻食品改良剂、肉制品添加剂、饮料澄清剂、乳制品添加剂及胶原小食品等。胶原可作为生物材料用作心脏瓣膜、创伤和烧伤修复材料、止血剂、人工皮肤、固定化酶和提取胶囊等。在美容、矫形方面,胶原蛋白可用于小型皮肤缺损修复及组织缺损修复,是理想的医用材料7。制革工艺过程中剩下的废弃物中含有丰富的胶原蛋白,可以提取出来用作饲料的动物蛋白资源8,实现资源利用,同时近年来胶原蛋白在造纸工业、制革工业、日用化工业等轻工业中也有越来越多的应用。目前胶原蛋白主要有外用、口服、注射三种应用方法。由于胶原蛋白的螺旋结构,口服胶
30、原蛋白生物利用度低,注射美容胶原的成本又较高,而动物试验表明,含胶原蛋白的膏体涂抹于皮肤能有效改善表皮和真皮结构,促进皮肤内胶原合成9,故胶原蛋白应用于化妆品以外用为宜。目前,我国的胶原蛋白产品通常从含有结缔组织的屠宰动物废料中制取,水产动物皮中的胶原蛋白的利用一直是空白10。水产动物胶原与猪等陆生胶原蛋白相比,胶原蛋白特性、组成及溶液性质都存在显著不同。如果能将乌贼皮中的胶原蛋白实行回收利用,不仅是对环境保护的一项重要贡献,也扩大了胶原蛋白的资源,更拓宽了胶原蛋白的应用范围。许多试验都研究了酸法与酶法相结合提取胶原蛋白的方法，而本文则着重研究了酸法提取胶原蛋白的最优条件。2材料与方法21原料
31、原料购自本地市场的金乌贼，去除乌贼内脏后，手工剥取乌贼皮，用剪刀剪去乌贼皮上残留的乌贼肉。用自来水反复冲洗，除去附着在乌贼皮上的一些杂物后，室温晾干，将其剪成大小基本一致的小块（11CM），放入PE食品保鲜袋中，在20的冰箱中保存11。22实验试剂（1）02MOL/L的氯化钠溶液准确称取585G氯化钠晶体于烧杯中，倒入少量蒸馏水使其溶解，可使用玻璃棒搅拌加速溶解，待其完全溶解后，转移入500ML的容量瓶中，使用蒸馏水定容至500ML。（2）不同浓度的醋酸溶液配制醋酸溶液前，根据所需配制溶液的浓度与体积，依据计算公式计算出需要的冰醋酸体积。用移液管吸取一定体积的冰醋酸，装入容量瓶中，在进行定容。
32、其计算公式为V1（CMV2）/P，其中V1代表所需的冰醋酸的体积，C代表要配制的醋酸溶液的浓度，M代表冰醋酸的摩尔质量，V2代表要配制的醋酸溶液的体积，P代表冰醋酸的密度。（3）6MOL/L的盐酸溶液用量筒取12MOL/L的浓盐酸溶液125ML，再定容至250ML。（4）50的氢氧化钠溶液称取10G氢氧化钠固体，加入20ML蒸馏水使其溶解。（5）醋酸柠檬酸缓冲液（PH65）将5G柠檬酸、12ML冰醋酸、12G醋酸钠、34G氢氧化钠溶解后定容至100ML。（6）高氯酸溶液取70的高氯酸溶液135ML，将其定容至50ML。（7）10对二甲基氨基苯甲醛（PDMAB）在分析天平中准确称取2G对二甲基氨
33、基苯甲醛，用少量异丙醇溶解后定容至20ML。配置好后放入4冰箱中保存。（8）氯胺T试剂将07G氯胺T、15ML异丙醇、25ML醋酸柠檬酸缓冲液和10ML蒸馏水混合均匀。配置好后放入4冰箱中保存12。22实验仪器组织捣碎匀浆机DS1上海标本模型厂电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司DKS24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司冷冻高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司T6新锐可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司数显电热鼓风干燥器1012A型上海锦屏仪器仪表有限公司23试验方法231胶原蛋白的测定胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸（HYDROXYP
34、ROLINE，以下简称HYP）和羟赖氨酸在其它蛋白中很少见，为胶原蛋白所特有。通过测定羟脯氨酸的质量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的质量13。2311羟脯氨酸标准曲线的绘制精确称取羟脯氨酸标准品01G，用0001MOL/L的盐酸溶解，配制成1MG/ML的羟脯氨酸贮备液。取1ML贮备液稀释至100ML配制成10UG/ML的标准溶液。配制不同浓度的羟脯氨酸标准溶液，见表1，各取1ML，以0001MOL/L的盐酸溶液作为空白液。将氯胺T溶液和对二甲基氨基苯甲醛在60水浴中加热一段时间。在标准溶液和空白液中分别加入1ML的氯胺T溶液，混匀后，在室温下静置10MIN。然后加入1ML高氯酸溶液，混
35、匀，室温下静置5MIN。最后加入对二甲基氨基苯甲醛1ML，混匀，60下水浴加热20MIN进行显色反应，置于冷水中冷却。以空白液调零，测定560NM处的吸光度，绘制标准曲线。表1不同浓度的羟脯氨酸标准溶液配制表TABLE1EFFECTOFDIFFERENTCONCENTRATIONSOFSTANDARDSOLUTIONOFHYDROXYPROLINEINTHEPREPARATIONOFTHETABLE10UG/ML羟脯氨酸标准溶液（ML）02468100001MOL/L盐酸（ML）1086420最终浓度（UG/ML）02468102312提取液中羟脯氨酸质量的测定吸取提取液10ML，加入5ML的
36、6MOL/L浓盐酸溶液，在恒温鼓风干燥箱水解4小时，温度设置为130。冷却后取出，调节水解液的PH至中性，然后将水解液定容至100ML，制成样品溶液。取1ML样品溶液，按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品溶液中的羟脯氨酸质量，然后换算成胶原蛋白的质量。提取液中羟脯氨酸质量按下式计算（MG）H10稀释倍数V提式中H标准曲线上相对应的羟脯氨酸的含量（G/ML）；V提提取液的总体积（ML）。2313胶原蛋白得率的计算胶原蛋白的得率按下式计算14（10111）/原料质量（G）10015232工艺流程剪碎的乌贼皮除杂蛋白匀浆加入醋酸溶液提取离心（8
37、000RMIN1）20MIN取上清液定容，测定提取液中羟脯氨酸质量，计算胶原蛋白得率。233原料处理提前一夜将冷冻在20冰箱中的乌贼皮取出，放入4的冰箱中解冻。解冻完成后，称取1000G左右的乌贼皮，先加入100ML的02MOL/L的氯化钠溶液，放入匀浆机中进行匀浆。再在其中加入200ML的02MOL/L的氯化钠溶液，将其放入4的冰箱中进行除杂3H。3H后，将该混合液取出，在转速为2000R/MIN的离心机中进行离心，时间为20MIN。离心完成后，倒去上清液，留下残渣。在残渣中加入300ML的02MOL/L的氯化钠溶液，再次放入4的冰箱中进行3H的除杂。在此次除杂结束后，再次进行离心，离心机转
38、速为2000R/MIN，离心时间还是20MIN。依旧到取上清液，取残渣。在残渣中加入蒸馏水，直至混合液质量到达100G左右，其目的是配成10的匀浆液。将该混合液进行再次匀浆，使残渣被最大限度的研细，同样使混合液混合均匀。234酸法提取乌贼皮中胶原蛋白的单因素实验分别吸取1000G预处理好的乌贼皮匀浆液（10，WW）于锥形瓶中,加入适量的醋酸溶液,在一定的温度下浸提一定时间,浸提结束后,8000R/MIN离心20MIN,取上清液定容至50ML，测定提取液中羟脯氨酸质量。以胶原蛋白得率为指标，考察醋酸浓度、料液比、提取时间和温度对乌贼皮胶原蛋白提取的影响16。235正交实验测定提取液中羟脯氨酸质量
39、，以胶原蛋白得率为指标，采用不同的料液比、酸浓度、浸提时间和温度对乌贼皮的提取，比较不同工艺条件下的提取效果，以确定最佳工艺。表2酸法提取正交因素水平表TABLE2ORTHOGONALFACTORSEXTRACTEDFROMTHELEVELOFACIDFORM水平LEVELS因素FACTORSA料液比LIQUIDRATIOB酸浓度（MOL/L）ACIDCONCENTRATION（MOL/L）C水解时间HHYDROLYSISTIMEHD空白1130053621401483150272根据单因素酶解的实验结果，选择料液比、酸浓度、水解时间三个因素，每个因素确定3个水平（各3个平行），按L934正交
40、表进行正交试验。其正交试验因素及其水平如表2。3结果与分析31羟脯氨酸标准曲线的绘制羟脯氨酸标准曲线如图1，其回归方程为Y00923X00059，相关系数R20996，其中Y为吸光度，X为羟脯氨酸浓度（UG/ML）。根据回归方程及测定的吸光度可计算出羟脯氨酸的浓度，进而计算出样品溶液中羟脯氨酸的含量。Y00923X0006R20999600102030405060708091024681012羟脯氨酸浓度（UG/ML）吸光度系列1线性系列1图1羟脯氨酸标准曲线FIGURE1STANDARDCURVEOFHYDROXYPROLINE32料液比对胶原蛋白得率的影响准确称取4组预处理好的10的乌贼皮
41、匀浆液10G，分别加入05MOL/L的醋酸溶液10ML、20ML、30ML、40ML，即其料液比分别为110、120、130、140，在4下进行浸提12H。之后取出该浸提液，分别取该溶液10ML，加入5ML的6MOL/L浓盐酸溶液，在恒温鼓风干燥箱水解4H，温度设置为130。调节水解液的PH至中性，然后将水解液定容至100ML，制成样品溶液。取1ML样品溶液按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品溶液中的羟脯氨酸含量，然后换算成胶原蛋白的含量，再计算出胶原蛋白的得率，如表2所示。实验得到不同料液比对乌贼皮胶原蛋白得率得率的影响，结果如图2。在
42、料液比为110到130这段数值内，曲线斜率变化较大，而在130140这段区间，曲线斜率变化减小。00050101502025012345料液比胶原蛋白得率系列1图2料液比对胶原蛋白得率的影响FIGURE2LIQUIDRATIOONTHEYIELDOFCOLLAGEN表2胶原蛋白得率TABLE2,THEYIELDOFCOLLAGEN1234料液比110120130140胶原蛋白得率00230098018020在料液比为110到130这段数值内，胶原蛋白得率变化较大，而在130140这段区间，胶原蛋白得率增长缓慢。这是因为在提取胶原蛋白的过程中,由于胶原蛋白的胶体性质,溶液的粘度越来越大,自由状态
43、下的水饱和程度越来越高,膨胀水的溶解性越来越弱13,在水量不足的条件下,导致胶原蛋白的得率下降,当加水量增加到一定数值,水对于胶原蛋白的溶解性会大大提高,从而导致得率提高。胶原蛋白基本被提取完全后,增加水用量对胶原蛋白的得率基本不再发生变化。也就是说，当固液比较小时，胶原蛋白不能完全溶解于醋酸溶液中，使其浸提不完全，从而造成其得率低；而固液比较高，对胶原蛋白得率的增加影响很小,胶原蛋白得率增加幅度减小，而当料液比为140时，胶原蛋白得率达到最大值。因此，提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳固液比为140。33提取时间对胶原蛋白得率的影响准确称取4组预处理好的10的乌贼皮匀浆液10G，加入05MOL/L的
44、醋酸溶液20ML，在4下进行浸提，分别浸提12H，24H，36H，48H和72H。浸提结束后及时取出该浸提液，分别取该溶液10ML，加入5ML的6MOL/L浓盐酸溶液，在恒温鼓风干燥箱水解4小时，温度设置为130。在水解液中加入1至2滴双氧水进行脱色，直至溶液变为无色透明时，将溶液进行过滤。调节水解液的PH至中性，然后将水解液定容至100ML，制成样品溶液。取1ML样品溶液按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品溶液中的羟脯氨酸含量，然后换算成胶原蛋白的含量，再计算出胶原蛋白的得率。实验得到不同提取时间对乌贼皮胶原蛋白得率得率的影响，结果如图
45、3所示00050101502025030350401020304050607080浸提时间H胶原蛋白得率系列1图3提取时间对胶原蛋白得率的影响FIGURE3,EXTRACTIONTIMEONTHEYIELDOFCOLLAGEN由图3可知，提取时间在48H以内时，胶原蛋白得率增加比较迅速。随时间的延长，胶原蛋白的得率逐渐增加。在初期，得率随时间的延长而急剧上升，曲线较陡；之后得率变化减小，即提取速度逐渐放慢，曲线程平缓趋势，但仍不断增加。这是因为提取初期，乌贼皮浸入酸溶液时，乌贼皮胶原蛋白开始迅速吸收酸而膨胀，胶原蛋白分子迅速与进入乌贼皮内的酸分子结合生成氢键，破坏了胶原蛋白肽链原来的氢键而溶解
46、在溶液中；同时，乌贼皮中天然交联较弱的胶原蛋白也很快溶出进入溶液17，因此，得率在提取初期上升较快。而在48小时以后，胶原蛋白得率却呈现缓慢增加的趋势，胶原蛋白得率变化不显著；这是由于乌贼皮中胶原蛋白基本已被提取完全，所以得率变化不大。因此，以05MOL/L的醋酸溶液为提取剂，提取时间以48H为最佳。34酸浓度对胶原蛋白得率的影响准确称取4组预处理好的10的乌贼皮匀浆液10G，分别加入01MOL/L的醋酸溶液、05MOL/L的醋酸溶液、1MOL/L的醋酸溶、2MOL/L的醋酸溶液液20ML，在4下进行浸提，浸提时间为24H。浸提结束后及时取出该浸提液，分别取该溶液10ML，加入5ML的6MOL
47、/L浓盐酸溶液，在恒温鼓风干燥箱水解4小时，温度设置为130。在水解液中加入1至2滴双氧水进行脱色，直至溶液变为无色透明时，将溶液进行过滤。调节水解液的PH至中性，然后将水解液定容至100ML，制成样品溶液。取1ML样品溶液按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品溶液中的羟脯氨酸含量，然后换算成胶原蛋白的含量，再计算出胶原蛋白的得率。实验得到不同提取时间对乌贼皮胶原蛋白得率得率的影响，结果如图4所示0005010150202503035005115225醋酸浓度MOL/L胶原蛋白得率系列1图4酸浓度对胶原蛋白得率的影响FIGURE4ACIDC
48、ONCENTRATIONONTHEYIELDOFCOLLAGEN从图4可知，醋酸溶液浓度在01MOL/L05MOL/L区间内变化时，胶原蛋白得率增长幅度变化不大；而在05MOL/L1MOL/L区间内，胶原蛋白得率增长比较迅速；在醋酸溶液达到1MOL/L以后，胶原蛋白得率增长幅度变化再次降低，变化并不显著。因为酸溶液浓度较低，胶原蛋白水解不完全，使其得率较低，而随着醋酸溶液浓度升高，乌贼皮中胶原蛋白基本被提取完全，胶原蛋白得率变化不大18，当醋酸溶液浓度升高到一定程度后，部分蛋白质变性，也会是胶原蛋白得率增长幅度减小。因此，在提取时间为24H，温度为4，固液比为120的条件下，醋酸溶液酸浓度以1
49、MOL/L为最佳。35温度对胶原蛋白得率的影响分别准确称取4组预处理好的10的乌贼皮匀浆液10G，均加入05MOL/L的醋酸溶液20ML，分别在4、15（室温）、20、25下进行浸提，浸提时间为12H。浸提结束后及时取出该浸提液，分别取该溶液10ML，加入5ML的6MOL/L浓盐酸溶液，在恒温鼓风干燥箱水解4小时，温度设置为130。在水解液中加入1至2滴双氧水进行脱色，直至溶液变为无色透明时，将溶液进行过滤。调节水解液的PH至中性，然后将水解液定容至100ML，制成样品溶液。取1ML样品溶液按羟脯氨酸标准曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品溶液中的羟脯氨酸含量，然后换算成胶原蛋白的含量，再计算出胶原蛋白的得率。实验得到不同提取温度下，乌贼皮胶原蛋白得率得率的变化，其结果如图5所示0005010150202503035051015202530温度胶原蛋白提取率系列1图5温度对胶原蛋白得率的影响FIGURE5TEMPERATUREONTHEYIELDOFCOLLAGEN从图5可以看出，胶原蛋白得率随温度的升高而增大，但在415之间变化幅度不是太大。在15以后，随着温度的升高，胶原蛋白得率继续增大，而当温度在20到25之间变化时，
