1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程乳酸菌冻干保护剂研究一、选题的背景与意义乳酸杆菌科以乳酸杆菌属最为重要，大多是工业上尤其是食品工业上的常用菌种。存在于乳制品，发酵植物食品如泡菜、酸菜、青贮饲料、及人的肠道，尤其是乳儿肠道中。乳酸菌不仅具有提高食品营养价值，改善食品风味，延长保存时间，可提高食品附加值的功能，而且，近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育等等。乳酸菌在没有冻干保护剂的保护下，会受到损伤，
2、例如机械损伤，溶质损伤，细胞膜损伤，细胞代谢调节作用损伤等，降低了乳酸菌的存活率。而冻干保护剂添加能提高乳酸菌的存活率，使乳酸菌在低温条件下能够良好的生长。冻干保护剂从以下几个方面对乳酸菌进行保护保护剂对膜相变温度TM的影响，保护剂对体系玻璃化转变温度的影响，保护剂对蛋白结构的影响。乳制品特别是发酵乳制品是人们摄入外源乳酸菌的一条重要渠道，筛选优良的、具有抗氧化活性和安全的乳酸菌菌株，对于开发功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳品的附加值将具有重要意义。关于乳酸菌抗氧化性的研究己引起食品科学、预防医学和微生态学等许多学科的广泛重视。随着人们对乳酸菌抗氧化功能和保健功能的认识以及生物技术的飞
3、速发展，相信乳酸菌将会得到越来越广泛的应用。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容首先做冻干保护剂的单因素筛选试验，从一定浓度的糖类、氨基酸类、醇类、缓冲盐类中筛选出活菌率较高的保护剂，然后，在从活菌率较高的保护剂中，设置一个四因素三水平的响应面的实验，对各种保护剂进行组合，形成复合保护剂，根据实验得出最佳的活菌率，则这组的复合保护剂就是适合乳酸菌最佳的复合保护剂。使其在保存长时间之后仍具有较高活性，并且有助于其保存和运输，更有利于今后的实际应用。拟解决的主要问题根据实验活菌的存活率，筛选出冻干保护剂的单因素，以及最佳的复合保护剂。三、研究的方法与技术路线研究方法首先做冻干保护剂的
4、单因素筛选试验，1培养数菌，用MRS培养基培养乳酸菌24H,，取一份菌体涂固体平板，计活菌数量，稀释106,107,108倍之后，进行涂固体平板，固体平板培养48H后，数菌落数。根据平均数来评定菌的数量。2离心放冻干保护剂，剩余的菌液取30ML进行离心，4000R/MIN，20MIN，离心后，加入30ML85的无菌盐水缓冲液后在一次离心4000R/MIN，20MIN。取沉淀，加入冻干保护剂各30ML，摇匀，取1ML，放在15ML的冷冻离心管中。3预冻、冷冻，把冷冻的离心管防止40的冰箱中预冻24H，之后，放在冷冻干燥机中冷冻24H。4复水，计菌数，然后把各个菌进行MRS培养基的培养24H，再进
5、行涂固体平板（步骤如前），数菌。5计算活菌率，根据冻干后的菌体存活率，筛选适宜的冻干保护剂。做复合冻干保护剂的筛选试验时，把保护剂从单一的，一定浓度的糖类、氨基酸类、醇类、缓冲盐类中筛选出活菌存活率较高的保护剂，然后根据保护剂浓度的设置不同，组合形成复合保护剂。技术路线加保护剂平板计数预冻冷冻乳酸菌平板计数复水四、研究的总体安排与进度201010201011查阅资料，确定实验方案20101120111乳酸菌的冻干保护剂单因素的筛选2011120113乳酸菌的冻干保护剂复合保护剂的研究2011320114数据整理及论文撰写五、主要参考文献1王建,隋欣,姜铁民等直投式酸奶发酵剂菌体浓缩的研究J食品
6、工业科技,2007,1173752李华,骆艳娥,刘延琳真空冷冻干燥微生物的进展J微生物通报,2002,378813CARVALHOAS,SILVA7,HOP,ETALEFFECTOFVARIOUSGROWTHMEDIAUPONSURVIVALDURINGSTORAGEOFFREEZEDRIEDERTEROCOCCUSFAECALISANDENLERACOCCUSDURANSJAPPLIEDMICROBIOLOGY,2003,949479524靳志强,李平兰培养基、保护剂和饥饿处理对冻干乳酸菌存活性的影响J食品科学,2007,72962995朱敖兰,杨洁生物制品冻干保护剂及其保护机理的研究进展J
7、喀什师范学院学报,2007,646506BUMSOOHANANDJOHNCBISCHOFDIRECTCEL1INJURYASSOCIATEDWITHEUTECTICCRYSTLLIZATIONDURINGFREEZINGCRYOBIOLOGY,2004,488217李春,张兰威乳酸菌细胞膜冻干损伤研究进展J中国乳品工业,2004,32428298蒲丽丽,刘宁,张英华等乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展J中国乳业,2005650529蒲丽丽,刘宁,霍贵成嗜热链球菌冻干保护剂保护作用的研究J食品科技,2007,7323410蒲丽丽,刘宁保加利亚乳杆菌冻干保护剂保护作用的研究J中国酿造,2010,
8、5464811SAMUELBLESLIEETA1TREHALOSEANDSUCROSEPROTECTBOTHMEMBRANESANDPROTEINSININTACTBACTERIADURINGDRYINGJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY1995,61103592359712钟芳食品的冷冻玻璃化保藏J食品与机械,2000,795913杨基础等海藻糖对固定化酶的保护作用J化工学报,2000,5L2L9319714蒲丽丽,刘宁,张英华等乳酸菌冻干损伤与保护的研究进展J食品工业,2005718215吴玲,潘道东,刘海燕瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择J2010,115
9、715916满丽莉,向殿军冻干乳酸菌的研究进展J农产品加工,2010,3171917张英华,霍贵成,郭钨乳酸菌冷冻干燥技术研究进展J东北农业大学学报,2005,36679918林云双岐杆菌冻干保护剂条件的研究J饲料研究,2002,64719董英,林泽营,周国磊等泡菜乳酸菌冻干保护剂的研究J食品工业,2007,1101220邢蕾,吴晖,刘冬梅等干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干保护剂的研究J中国乳品工业,2009,11151721古元懿,欧军,粱金钟保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干工艺条件的研究J酿酒,2008,4475122吕燕妮,靳志强,李平兰等酸奶生产用直投式乳酸茵发酵剂研究J乳品加工,2005,11
10、475023纪振杰,郭德军利用响应面法优化双歧杆菌冻干保护剂的配比J中国生物制品学杂志,2008,981381624张英华,霍贵成,郭鸽乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选J食品科技,2006,11727525邓鹏超乳酸菌的高密度培养及酸奶冻干发酵剂的研究D华中农业大学微生物学,200826吴祖芳,翁佩芳,楼佳瑜乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究J食品与发酵工业,2009,559毕业论文文献综述食品科学与工程乳酸菌冻干保护剂研究状况摘要乳酸菌是酸奶的重要发酵剂,是某些蔬菜的腌制剂。然而,乳酸菌在冻干中会受损伤,使用冻干保护剂可以提高乳酸菌的存活率。乳酸菌细胞在没有保护剂的保护下,会冻干损伤。了
11、解保护剂的保护机理。保护剂可以分为多元醇类、糖类、氨基酸类、无机盐类、蛋白质及肽类和混合物等。冻干保护剂的筛选可以根据不同的菌种,有不同的工艺条件,乳酸菌冻干保护剂的研究有着重要的意义。关键字乳酸菌；冻干保护剂；筛选随着我国乳品工业的飞速发展,市场对酸奶发酵剂的需求越来越大。酸奶已成为人们日常饮食的必备食品,它对人类的健康有益作用是非常明显的,而乳酸菌发酵剂是决定发酵乳制品的质量和特性的最重要因素,其制备过程也是生产发酵乳制品的关键技术之一1。而乳酸菌在发酵的过程中会由于各种因素而影响酸奶的品质。因而,使用冷冻干燥技术可以提高乳酸菌的存活率。利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为
12、理想的一种2。冷冻干燥也称为冻干,是冷冻和干燥技术的有机结合,细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用,损伤是不可避免的。为了提高真空冷冻干燥后微生物的存活率,人们进行了大量的研究。乳酸菌培养物在冷冻干燥和随后长期的贮藏过程中,最大限度的保持乳酸菌的活性无论从经济角度还是从技术角度来讲都是至关重要的。微生物细胞的存活取决于许多因素,包括微生物起始浓度、培养基、非致死性处理、冻干保护剂和复水环境等3。保护剂可以减轻冷冻干燥或复水对细胞的损害,尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。筛选适宜的冻干保护剂对细胞在冻干和贮藏过程中的存活性至关重要4。1乳酸菌细胞的冻干损伤11机械损伤机械
13、损伤是由低温时细胞内外冰晶生长产生的机械力量引起的,一般冰晶越大,细胞膜越易破裂,从而造成细胞死亡。冰晶小,对细胞膜的机械损伤也较小5。12溶质损伤溶质损伤又称“溶液损伤”,是由于水的冻结使细胞问隙内的液体逐渐浓缩,从而使电解质的浓度显著增加6。13细胞膜损伤冻干过程中,细胞膜脂肪酸的不饱和度、链的长度、链的分支状态或环绕状态存在动态变化,脂肪酸的动态变化与膜的流动性密切相关。微生物细胞的干燥损伤很大程度上是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变,从而导致膜的功能失调7。14细胞代谢调节作用损伤当细胞内某一关键酶失活,会造成细胞代谢受阻,积累了影响正常生理功能的某种产物,从而整个细胞
14、代谢紊乱,导致细胞死亡8。2冻干保护剂的保护机理冻干前在溶液中加入的保护介质在干燥后起支撑作用,在冻干过程中起保护作用。冻干的样品不失原有的固体骨架结构,保持原有的形态。冻干使保护介质具有多孔结构,该结构使冻干菌粉具有理想的速溶性和速复水性。冻干后菌体附着在保护介质上,大大减少了菌体暴露于外部的区域,减少了外界环境因素对菌体的影响,降低了菌体死亡的可能性,从而提高了其冻干存活率。另一方面保护剂与菌体细胞壁结合,有助于稳定细胞内部成分,有助于菌体细胞冻干存活率的提高910。21保护剂对膜相变温度TM的影响由磷脂分子组成的双分子层是细胞膜的主要成分。通常情况下,水分子通过氢键与磷脂的极性端相连,当
15、磷脂干燥脱水时,极性端的密度增加,平时处于液晶态的脂膜变成凝胶态,此时的温度被称为膜相转变温度。研究者认为,冻干过程中,膜质经历了从液晶态到凝胶态的相的变化。在室温下复水时,处于凝胶态的干燥质膜又经历了从凝胶态到液晶态的转变,由于膜经历了状态的转变,某些区域产生缺陷,使得膜渗漏。若在干前加入二糖如海藻糖可降低干燥膜的膜相转变温度,当磷脂干燥脱水时,海藻糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连,防止状态的转变和复水时的渗漏,从而提高细胞的存活率11。22保护剂对体系玻璃化转变温度的影响玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态,其粘度极大,具有液体的性质。由于这种非晶体结构的扩散系数很低,故在这种结构
16、中分子运动和分子变性反应非常微弱,不利的化学反应能够被抑制,从而提高被保存物质的稳定性12。23保护剂对蛋白结构的影响13杨基础等研究认为海藻糖对酶的保护机理为一方面海藻糖的羟基替代了水分子同酶的酰胺基形成氢键,另一方面海藻糖分子包裹在酶分子周围,或填充在酶蛋白分子的空间结构内,特别是酶的活性部位附近,形成玻璃态,有效的防止蛋白质分子发生三维结构的变化,从而避免了酶的失活14。在实际生产中通常采用各种保护剂来降低冻干过程对乳酸菌的伤害。一些亲水且能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长,冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能
17、力。保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移,保护了细胞结构15。3冻干保护剂的筛选冻干前加入保护介质,以减少其冻干损伤是必须的。对于绝大多数细菌,冷冻干燥成功的关键在于有效保护剂的使用,保护剂可以改变生物样品在冷冻干燥时的物理环境、化学环境,减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害,尽可能保持原有的生理生化特性和生物活性。冻干保护剂不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率,还影响保藏期间的细胞稳定性16。31冻干保护剂的分类冻干保护剂按照不同的性质可分为多元醇类、糖类、氨基酸类、无机盐类、蛋白质及肽类和混合物。冻干保护剂可按照不同的方式进行分类,按其是否能渗到细胞内可分
18、为渗透型和非渗透型两种17。32冻干保护剂的筛选对于冻干保护剂的研究有很多,主要有泡菜乳酸菌,干酪乳杆菌,瑞士乳干菌,保加利亚乳杆菌,嗜热链球菌,双岐杆菌18等等,对于这些菌种的保护剂筛选,已有很多的研究,保护剂主要包括单一的保护剂和复合保护剂两种,其中保护剂的种类以及含量也不同。321泡菜乳酸菌冻干保护剂筛选在泡菜乳酸菌保护剂的研究中,海藻糖对乳酸菌冻干的保护作用最强,山梨醇次之,谷氨酸钠和VC也有明显的保护作用,添加05硫酸锰、05氯化钙未见保护效果。10脱脂乳、5海藻糖、7谷氨酸钠、3山梨醇和3VC的复合保护剂能使乳酸菌冻干后存活率较高,可达895,与单一保护剂比较,存活率有显著提高19
19、。322干酪乳杆菌冻干保护剂的筛选保护效果大小排序依次为海藻糖,脱脂奶粉,蔗糖,甘油,可溶性淀粉,硫酸锰,抗坏血酸。今后的研究还需寻找添加量更小、保护效果更好的保护剂品种以提高冻干菌粉的活菌数量20。323保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干工艺条件通过实验可以得出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干的最佳离心条件为转速4000RMIN,时间10M；预冻温度和预冻时间为在一20预冻3H；冻干保护剂的最佳PH为65；保护剂与菌泥的最佳平衡时间为30MIN；保护菌泥的最佳配比为4L；最佳装液厚度为7MM；冻干菌粉的最佳含水量为2321。嗜热链球菌在冻干保护剂的筛选中可以使用正交实验,正交实验是一种较简单的实验
20、方法22。324乳酸菌冻干保护剂的筛选根据文献的描述,各种菌种的冻干保护剂的种类、数量、工艺条件的分析及研究,可以确定乳酸菌冻干保护剂的研究的方案。由于脱脂乳价格比较便宜,不论是单独使用还是与其它保护剂混用均有较好的保护效果,一般将其作为冻千保护剂的主要成分。首先从乳酸菌冻干保护剂单因素开始筛选,从浓度为10的海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖,5的谷氨酸钠,200MG/L的半胱氨酸,2的甘油、甘露醇、山梨酸,02的乙酸钠、硫酸锰、氯化钙中筛选冻干后存活率较高的冻干保护剂,再者,根据筛选出来的冻干保护剂糖类,氨基酸类,醇类,缓冲盐类的存活率较高的,组合成复合冻干保护剂,以提高冻干菌种的活菌数量。此复合
21、实验应用响应面优化23的方法,是一个四因素三水平的实验,总共27次实验。实际上,不同的保护剂各有优缺点,单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣的条件,例如大分子保护剂主要是保护细胞的表面免受伤害,冻干过程中对细胞有一定的保护作用,但大分子保护剂单独使用时,在保存期间对细胞的保护效果却不明显,如果合适的大分子和小分子保护剂配合使用,将会加速干燥且能在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率24。4乳酸菌冻干保护剂研究的意义与进展41乳酸菌冻干保护剂研究的意义随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展,积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶冻干发酵剂,对推动我国酸奶发酵剂的生产水平,提高国产发酵剂的竞争力,具有重要的意义2
22、5。乳酸菌是酸奶的发酵剂,乳酸菌良好的生长是保证酸奶的品质的关键因素。乳酸菌作为一种蔬菜腌制剂,和与多种食品质相关的重要微生物已有较多文献报道。研究优良乳酸菌菌种的高效培养技术以及其保藏方法对发乳酸菌作为蔬菜发酵剂具有重要的现实意义26。42乳酸菌冻干保护剂研究的进展随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的深入研究和揭示。乳酸菌产品逐渐受到人们的重视。乳酸菌菌粉是生产这些产品的重要原料,而常用于制备乳酸菌菌粉的方法是真空冷冻干燥法简称冻干9。而为了提高冻干后的存活率,则需要研究乳酸菌的冻干保护剂。在研究过程中,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌可以从扫描电镜观察样品的结够与形态10。参考文献1王建,隋欣,姜
23、铁民等直投式酸奶发酵剂菌体浓缩的研究J食品工业科技,2007,1173752李华,骆艳娥,刘延琳真空冷冻干燥微生物的进展J微生物通报,2002,378813CARVALHOAS,SILVA7,HOP,ETALEFFECTOFVARIOUSGROWTHMEDIAUPONSURVIVALDURINGSTORAGEOFFREEZEDRIEDERTEROCOCCUSFAECALISANDENLERACOCCUSDURANSJAPPLIEDMICROBIOLOGY,2003,949479524靳志强,李平兰培养基、保护剂和饥饿处理对冻干乳酸菌存活性的影响J食品科学,2007,72962995朱敖兰,杨洁
24、生物制品冻干保护剂及其保护机理的研究进展J喀什师范学院学报,2007,646506BUMSOOHANANDJOHNCBISCHOFDIRECTCEL1INJURYASSOCIATEDWITHEUTECTICCRYSTLLIZATIONDURINGFREEZINGCRYOBIOLOGY,2004,488217李春,张兰威乳酸菌细胞膜冻干损伤研究进展J中国乳品工业,2004,32428298蒲丽丽,刘宁,张英华等乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展J中国乳业,2005650529蒲丽丽,刘宁,霍贵成嗜热链球菌冻干保护剂保护作用的研究J食品科技,2007,7323410蒲丽丽,刘宁保加利亚乳杆菌冻干
25、保护剂保护作用的研究J中国酿造,2010,5464811SAMUELBLESLIEETA1TREHALOSEANDSUCROSEPROTECTBOTHMEMBRANESANDPROTEINSININTACTBACTERIADURINGDRYINGJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY1995,61103592359712钟芳食品的冷冻玻璃化保藏J食品与机械,2000,795913杨基础等海藻糖对固定化酶的保护作用J化工学报,2000,5L2L9319714蒲丽丽,刘宁,张英华等乳酸菌冻干损伤与保护的研究进展J食品工业,2005718215吴玲,潘道东,刘海燕瑞
26、士乳杆菌冻干保护剂的选择J2010,115715916满丽莉,向殿军冻干乳酸菌的研究进展J农产品加工,2010,3171917张英华,霍贵成,郭钨乳酸菌冷冻干燥技术研究进展J东北农业大学学报,2005,36679918林云双岐杆菌冻干保护剂条件的研究J饲料研究,2002,64719董英,林泽营,周国磊等泡菜乳酸菌冻干保护剂的研究J食品工业,2007,1101220邢蕾,吴晖,刘冬梅等干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干保护剂的研究J中国乳品工业,2009,11151721古元懿,欧军,粱金钟保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干工艺条件的研究J酿酒,2008,4475122吕燕妮,靳志强,李平兰等酸奶生产用直投式
27、乳酸茵发酵剂研究J乳品加工,2005,11475023纪振杰,郭德军利用响应面法优化双歧杆菌冻干保护剂的配比J中国生物制品学杂志,2008,981381624张英华,霍贵成,郭鸽乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选J食品科技,2006,11727525邓鹏超乳酸菌的高密度培养及酸奶冻干发酵剂的研究D华中农业大学微生物学,200826吴祖芳,翁佩芳,楼佳瑜乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究J食品与发酵工业,2009,559本科毕业设计（20_届）乳酸菌冻干保护剂研究目录1引言311乳酸菌的功能312乳酸菌冻干技术的研究历史313乳酸菌冻干损伤314乳酸菌冻干保护剂的选择415乳酸菌冻干保护机理4
28、2材料与方法521实验材料522仪器与设备53实验方法531工艺流程532实验操作5321灭菌5322冻干保护剂的制备53221单一冻干保护剂的制备及选择63222复合冻干保护剂的制备及选择333菌体的活化与培养434冻干前活菌计数735菌体的收集及保护剂的添加736预冻及冻干737复水及活菌计数7371菌种的复水7372冻干后活菌计数838存活率的计算84结果与分析841单一保护剂的选择542复合冻干保护剂的选择6421复合冻干保护剂的菌种存活率6422复合保护剂单因素间的相互作用743最佳复合保护剂配方的确定验证115讨论8摘要乳酸菌在真空冷冻干燥过程中会受到损伤，加保护剂可以提高其存活率
29、，从而筛选出乳酸菌存活率较高的保护剂。通过单因素比较和响应面实验设计，确定实验菌株的最佳冻干保护剂配方。根据乳酸菌存活率冻干后1毫升样液的活菌数/冻干前1毫升菌液的活菌数，得出乳酸菌的存活率，最终得到冻干保护剂的最佳配方。对单一保护剂作用筛选试验中，乳酸菌存活率较高的依次是海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠。复合保护剂作用中，乳酸菌存活率最高的保护剂配方为海藻糖1182，L半胱氨酸171MG/ML，山梨醇103，乙酸钠1715时，此时，乳酸菌的存活率最高，为98737。乳酸菌在低温、干燥、隔绝空气的环境下保藏，保护剂有利于乳酸菌菌种的保存，并且在工业生产中，对发酵剂的制备有实际的应用价值。关键
30、词乳酸菌；冻干保护剂；存活率。ABSTRACTLACTICACIDBACTERIAINVACUUMFREEZEDRYINGPROCESSWILLBEDAMAGED,THESURVIVALRATECANBEIMPROVEDBYADDINGPROTECTIVEAGENT,HIGHERSURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIASELECTEDPROTECTIVEAGENTCOMPAREDBYSINGLEFACTOREXPERIMENTALDESIGNANDRESPONSESURFACETODETERMINETHEBESTEXPERIMENTALSTRAINSFREEZEPROT
31、ECTIONAGENTFORMULATIONSBASEDONFREEZEDRIEDLACTICACIDBACTERIASURVIVALRATE1MLSAMPLESOLUTIONAFTERTHENUMBEROFLIVEBACTERIA/1MLOFBACTERIALSUSPENSIONPRIORTOFREEZETHENUMBEROFLIVEBACTERIA,THESURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIAREACHEDTHEFINALFREEZEDRYINGPROTECTIVEAGENTSWERETHEBESTFORMULAPROTECTIVEEFFECTOFASINGLEA
32、GENTINTHESCREENINGTEST,FOLLOWEDBYLACTICACIDBACTERIASURVIVALRATEOFHIGHTREHALOSE,LCYSTEINE,SORBITOL,SODIUMACETATECOMBINEDEFFECTOFPROTECTIVEAGENTS,THEHIGHESTSURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIAFORMULATREHALOSEPROTECTIVEAGENT1182,LCYSTEINE171MG/L,103SORBITOL,1715SODIUMACETATE,THETIME,THEHIGHESTSURVIVALRATEO
33、FLACTICACIDBACTERIA,WAS98737LACTICACIDBACTERIAWHICHWASINCOLD,DRYAIRENVIRONMENTISOLATEDPRESERVATION,PROTECTIONAGENTWASCONDUCIVETOTHEPRESERVATIONOFLACTICACIDBACTERIA,ANDININDUSTRIALPRODUCTION,WHICHPREPARATIONOFTHEFERMENTHASPRACTICALVALUEKEYWORDSLACTICACIDBACTERIAFREEZEDRIEDPRESERVATIVESURVIVAL1引言11乳酸菌
34、的功能随着我国乳制品产业的飞速发展，市场对乳酸菌产品的需求增大，尤其是乳酸菌发酵剂的质量方面，更是得到了广泛的关注。乳酸菌具有多种生理功能，包括治疗乳糖不耐症；促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收；分泌维维生素B；改善人体肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，清除肠道垃圾；抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压；以及免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力；抗肿瘤、预防癌症作用等，因此，乳酸菌的保藏和乳酸菌发酵剂的制备是乳酸菌诸多功能得到利用的前提条件和重要保证。保藏的微生物细胞在冻结状态及真空条件下升华，最后达到干燥的目的。而低温、干燥和隔绝空气是保藏菌种的几个重要因素，在这些条件下，微生物的生命活动将处于休
35、眠状态，代谢相对静止，因此可以长期保存。12乳酸菌冻干技术的研究历史真空冷冻干燥简称冻干技术出现在18L1年左右，当时用于生物体的脱水。L8L3年美国人WOLLASTON发现水的饱和蒸气压与水的温度有关，在真空低温条件下，水容易汽化，水在汽化时将导致温度的降低。根据这一发现，1909年SHACKELL开始用冻干法干燥血清和细菌。1935年第一台商业用冻干机问世，随后冻干技术扩展到医药、食品领域。现在冻干技术已经加入到高新技术领域的行列。西方乳业科学家早在19世纪末20世纪初，就已开始研制浓缩发酵剂，处于技术领先水平的丹麦HANSEN公司于1988年底研制的浓缩型冻干发酵剂活菌含量高101010
36、L2CFU/ML，可直接应用于工业化生产。我国对浓缩发酵剂的研究起步较晚，目前国内已有直投式发酵剂的专利问世，但生产过程中尚存在许多问题需要解决。目前我国在生产浓缩发酵剂的企业与发达国家存在很大的差距，影响我国乳业的发展1。13乳酸菌冻干损伤乳酸菌菌株在冷冻干燥后，于贮藏过程中最大程度的保持了乳酸菌的活性，无论从经济角度还是技术角度来讲都是具有很高价值的。微生物细胞的存活取决于许多因素，包括微生物起始浓度、培养基、非致死性处理、冻干保护剂和复水环境等2。保护剂可以减轻冷冻干燥或复水过程中外界因素对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。获得适宜的冻干保护剂配方对细胞在冻干和贮藏
37、过程中的存活性至关重要3。乳酸菌细胞在冻干过程中会受到一定的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、细胞代谢调节作用损伤。机械损伤是由低温时细胞内外冰晶生长产生的机械力量引起的，一般冰晶越大，细胞膜越易破裂，从而造成细胞死亡。冰晶小，对细胞膜的机械损伤也较小4。溶质损伤又称“溶液损伤”，是由于水的冻结使细胞问隙内的液体逐渐浓缩，从而使电解质的浓度显著增加5。冻干过程中，细胞膜脂肪酸的不饱和度、链的长度、链的分支状态或环绕状态存在动态变化，脂肪酸的动态变化与膜的流动性密切相关。微生物细胞的干燥损伤很大程度上是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，从而导致膜的功能失调6。当细胞内某一
38、关键酶失活，会造成细胞代谢受阻，积累了影响正常生理功能的某种产物，从而整个细胞代谢紊乱，导致细胞死亡7。14乳酸菌冻干保护剂的选择对于冻干保护剂的研究有很多，主要有泡菜乳酸菌，干酪乳杆菌，瑞士乳干菌，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，双岐杆菌812。对于这些菌种的保护剂筛选，已有很多的研究。保护剂主要包括单一的保护剂和复合保护剂两种，单一保护剂基本上是从糖类、醇类、氨基酸类、无机盐类中进行筛选，以获得最为适合实验菌株的原料，符合保护剂的种类以及含量也由于菌种的不同而有所区别。目前乳酸菌发酵剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备，许多研究者发现冷冻干燥具有其他方法无法比拟的优点，是制
39、备和保存生物材料最有效的方法之一，并得到越来越广泛的应用。真空冷冻干燥发酵剂于70年代初期开始研制，现在已经开始商业化，这种发酵剂含活菌数高，发酵活力强，遗传性稳定，便于储藏，携带方便，使用安全，因而它被广泛地应用13。随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的深入研究和揭示。乳酸菌产品逐渐受到人们的重视。乳酸菌菌粉是生产这些产品的重要原料，而常用于制备乳酸菌菌粉的方法是真空冷冻干燥法简称冻干8。而为了提高冻干后的存活率，则需要研究乳酸菌的冻干保护剂。在研究过程中，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌可以从扫描电镜观察样品的结够与形态14。15乳酸菌冻干保护机理保护剂从以下方面对乳酸菌进行保护，保护剂对膜相变温
40、度TM的影响，冻干过程中，膜质经历了从液晶态到凝胶态的相的变化。在室温下复水时，处于凝胶态的干燥质膜又经历了从凝胶态到液晶态的转变，由于膜经历了状态的转变，某些区域产生缺陷，使得膜渗漏。若在冻干前加入二糖如海藻糖可降低干燥膜的膜相转变温度，当磷脂干燥脱水时，海藻糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连，防止状态的转变和复水时的渗漏，从而提高细胞的存活率15；保护剂对体系玻璃化转变温度的影响，玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，具有液体的性质。由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性16；保
41、护剂对蛋白结构的影响，一些亲水且能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能力。保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞结构17。冻干保护剂的加入能保护乳酸菌的存活率，保护介质在干燥后起支撑作用，在冻干过程中起保护作用。冻干的样品不失原有的固体骨架结构，保持原有的形态。冻干使保护介质具有多孔结构，该结构使冻干菌粉具有理想的速溶性和速复水性。冻干后菌体附着在保护介质上，大大减少了菌体暴露于外部的区域，减少了外界环境因素对菌体的影响，降低了菌体死亡的可能
42、性，从而提高了其冻干存活率。另一方面保护剂与菌体细胞壁结合，有助于稳定细胞内部成分，有助于菌体细胞冻干存活率的提高。本实验拟以糖类、氨基酸类、醇类、无机盐类作为单因素保护剂，分别在这四类保护剂中选择出乳酸菌存活率较高的保护剂，再根据响应面设计复合保护剂。得到各种组合下复合保护剂的存活率，得到存活率最高的保护剂，并且进行验证。2材料与方法21实验材料菌种实验室保藏菌株试剂海藻糖上海展云化工试剂有限公司分析纯，蔗糖国药集团化学试剂有限公司，分析纯，乳糖上海展云化工试剂有限公司，分析纯，葡萄糖上海展云化工试剂有限公司，分析纯，谷氨酸钠上海展云化工试剂有限公司，分析纯，L半胱氨酸上海展云化工试剂有限公
43、司，分析纯，甘油国药集团化学试剂有限公司，分析纯，甘露醇上海展云化工试剂有限公司，分析纯，山梨醇国药集团化学试剂有限公司，分析纯，乙酸钠天津市博迪化工有限公司，分析纯，硫酸锰国药集团化学试剂有限公司，分析纯，氯化钙国药集团化学试剂有限公司，分析纯，蒸馏水，脱脂乳黑龙江省完达山乳业股份有限公司，分析纯，氯化钠江苏强盛化工有限公司，分析纯，蛋白胨杭州微生物试剂有限公司，分析纯，牛肉膏杭州微生物试剂有限公司，分析纯，酵母提取物杭州微生物试剂有限公司，分析纯，柠檬酸氢二铵国药集团化学试剂有限公司，分析纯，磷酸氢二钾天津市博迪化工有限公司，分析纯，琼脂上海展云化工试剂有限公司，分析纯。MRS培养基用于菌
44、种的活化，制备种子液和活菌计数葡萄糖20G，蛋白胨10G，牛肉膏10G，酵母提取物5G，吐温801ML，柠檬酸氢二铵2G，乙酸钠5G，硫酸锰0189G，七水硫酸镁058G，磷酸氢二钾2G，琼脂15G固体，蒸馏水1000ML，调PH6264。分装后于115灭菌20MIN。22仪器与设备锥形瓶，玻璃棒，电炉，烧杯，药匙，大离心管，移液枪EPPENDORF5ML，1ML，100UL，枪头5ML，1ML，100UL，试管架，离心管，培养皿，涂玻棒，；立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂LDZX50KBS，净化台控制器苏州华科净化设备有限公司，冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司，FD1D80型，超低温
45、保存箱，恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂，HWS智能型，组合式全温度振荡培养箱太仓市华美生化仪器厂，QHZ12A型，离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司，H2005R2型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验有限公司，DHG9108A型。3实验方法31工艺流程乳酸菌菌种的培养16H稀释、接种、培养48H计活菌数乳酸菌菌种的培养16H离心加入冻干保护剂单一/复合分装预冻24H真空冷冻干燥24H复水16H,同前面的培养时间一致计活菌数计算存活率1832实验操作321灭菌灭菌实验所用到的与菌体接触到的所有仪器与试剂都需要经过严格的灭菌处理，灭菌条件为115，20分钟。322冻干保护剂的制备3221单一冻干保护剂的制
46、备及选择将表1中的试剂按照相应浓度溶解在12的脱脂乳中，灭菌备用。表1单一冻干保护剂的类型及浓度冻干保护剂类型浓度冻干保护剂类型浓度糖类海藻糖蔗糖乳糖葡萄糖醇类甘油甘露醇山梨醇10101010222氨基酸谷氨酸钠L半胱氨酸缓冲盐类乙酸钠硫酸锰氯化钙空白无菌蒸馏水5200MG/ML02020203222复合冻干保护剂的制备及选择将表2中的试剂按照相应浓度溶解在12的脱脂乳中制备成为复合冻干保护剂，灭菌备用。表2复合保护剂的3水平选择水平A海藻糖BL半胱氨酸MG/MLC山梨醇D乙酸钠10181012150200250102030015020025制作四因素三水平的响应面表格表3复合冻干保护剂的各种
47、组合实验序号A海藻糖BL半胱氨酸MG/MLC山梨醇D乙酸钠12345678910111213108108101088101010121020020020020020015020015025020015020020031322232123120150202502502025020202020202021415161718192021222324252627101210101010121012810812121502002502002502502001501502502002002502001221232222122302025015015025020150150202025015020233菌体
48、的活化与培养将实验室保藏的菌株于12脱脂乳培养基中活化，待生长情况稳定后，以3的浓度接种于MRS培养基中进行培养。34冻干前活菌计数采用梯度释平板计数法，即在无菌操作条件下，取100UL的菌液，加09ML的灭菌生理盐水，制成110的均稀释液，再依次进行L0倍递增稀释，至适当稀释度106，107,108后，分别取各稀释浓度100UL于固体培养皿中，每个梯度做3个平行，然后用涂玻棒使菌体分散均匀，倒置，放入37、恒湿的培养箱中培养48H，之后，测定乳酸菌的菌体数，根据菌体的多少，可以全部计数或者平均分成4块，取其中一块计数4，得到菌体数。活菌测定主要用于冻干前菌体数的测定做3次平行，取平均和冻干后
49、菌体数的测定做3次平行，取平均8。35菌体的收集及保护剂的添加取30ML菌液于已灭菌且编号的离心管4000R/MIN离心20MIN，去上清，加入30ML的已灭菌的生理盐水清洗。再于各管中分别加入已灭菌的30ML保护剂，充分混匀，放置12MIN后，以1ML分装于15ML离心管中，并对应编号。36预冻及冻干将已分装的各样品于40冰箱中预冻24H后，开盖，用保鲜膜缠绕，再用消毒的牙签戳孔，放入瓶中，外接于真空冻干机冻干，冻干条件为真空度308PA，冷凝温度为8990，冻干时间24H。37复水及活菌计数371菌种的复水将冷冻干燥后的样品1ML、2组共2ML接种于75MLMRS培养基中3的浓度,摇床培养24H。372冻干后活菌计数方法同冻干前活菌计数。38存活率的计算194结果与分析由于脱脂乳价格合理，不论是单独使用还是与其它保护剂混用均有较好的保护效果，一般将其作为冻干保护剂的主要成分。根据相关文献，以经济角度考虑，选择价廉的冻干保护剂，并通过预试验确定添加量。41单一保护剂的选择本试验以12的脱脂乳和醇类选择甘油、甘露醇和山梨醇，糖类选择海藻糖、蔗糖、乳糖和葡萄糖，缓冲盐类选择乙酸钠、硫酸锰和氯化钙，氨基酸类选择谷氨酸钠和L半胱氨酸，以冻干后存活率为指标，进行单因素试验，结果
