1、本科毕业论文系列开题报告生物工程产纤维素酶的海洋细菌的筛选及初步鉴定一、选题的背景与意义纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。从酶的作用特性出发，纤维素酶可分为2大类碱性纤维素酶和酸性纤维素酶。根据酶的作用方式又可分为3类外切1,4葡聚糖苷酶简称CBH、内切1,4葡聚糖苷酶简称EG和1,4葡萄糖苷酶简称BG纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有分解纤维素的细菌存在。纤维素酶的应用很广泛，在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂、造纸、能源和中药提取等领域都有广泛的应用价值海洋中盐分较高，所以海洋细菌纤维素酶一
2、般在高盐条件下他仍具有较高的活性，同时还具有耐高温，耐极端PH、可以在室温下长时间保持高活性等特性。这些特性将可以在很大程度上解决工业上的因高温、高盐、强酸或强等使没失活的问题。因此，筛选和研究产纤维素酶的海洋细菌就显得非常必要且有意义。在现今的海洋水产养殖业中，有一些是以海带、海藻、海草等海洋植物为主要饲料，然而以植物性为主的饲料中含有较多的纤维素、半纤维素和果胶等不易消化的和阻碍消化的物质，且植物细胞存在细胞壁，回影响动物对保内营养物质的吸收，因此在饲料中添加纤维素酶可以使海洋动物更好的吸收营养物质并且消化良好。宁波地处海边，水产养殖业发达，海产品种类繁多，并且海洋资源广泛，所以就更有必要
3、也更应该筛选和研究产纤维素酶的海洋细菌。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、从实验室已有海洋细菌资源库中进行高产纤维素酶的菌株筛选2、对获得的产酶菌株进行鉴定三、研究的方法与技术路线技术路线菌株活化平板初筛复筛目的菌株鉴定初筛刚果红染色法。在2216E培养基中添加05羧甲基纤维素钠，纤维素酶能催化分解羧甲基纤维素钠。室温培养72H后往培养基中加入01的刚果红溶液，染色1H；弃去废液，加入1MOL/LNACL洗脱，浸泡1H。由于刚果红能与羧甲基纤维素钠发生结合，无法洗脱，所以若菌落周围出现透明圈，则说明该菌株能产纤维素酶。复筛3,5二硝基水杨酸法（DNS）。将初筛得到的菌株接种到羟甲
4、基纤维素钠发酵培养基中培养后得到胞外和胞内的粗酶液，采用DNS法用紫外可见分光光度计与540NM处测定OD值，规定每分钟产生1微克葡萄糖的酶量为一个酶单位（U）。U越大则说明酶活性越强，所对应的菌株也就越优良鉴定16SRDNA法。对复筛得到的菌株16SRDNA进行扩增，再通过测序对菌株进行鉴定四、研究的总体安排与进度201011201012进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和实验方案。2011120112完成2篇外文翻译2011220114正式进入实验的操作阶段2011420115论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1高伦江，董全，唐春红纤维素酶的研究进展及前景展
5、望江苏食品与发酵,2007,35414172李荣杰纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化畜牧与饲料科学,2009,30（6）9113韩韫，蔡俊鹏产纤维素酶海洋菌株的筛选及鉴定现代食品科技,2005,21336444孙凯，孟宁，冯琳，李师翁产纤维素酶菌株的筛选鉴定及产酶条件研究食品与科学,2009,2841591625吴琳，景晓辉，黄俊生产纤维素酶的分离刷选及酶活性测定安徽农业科学,2009,3717785578577859毕业论文文献综述食品质量与安全产纤维素酶的海洋细菌的筛选及初步鉴定摘要由于地球上纤维素资源极其丰富，能将这一部分资源利用起来显的非常有意义，因此，纤维素酶的研究成了近几年科学研
6、究的热点。海洋细菌酶因为有其特有的一些优势，更是研究者所中意的研究内容。分离纯化产酶菌株的方法很多，其中包括初筛的刚果红染色法，复筛的DNS法和鉴定菌株的16SRDNA法等。关键字纤维素酶海洋细菌筛选鉴定1纤维素酶的概况11概念及分布纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,是一个有多种水解酶组成的复合酶系。纤维素酶在自然界分布极为广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有分解纤维素的细菌存在1。12分类从酶的作用特性出发可分成2大类碱性纤维素酶和酸性纤维素酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3类外切1,4葡聚糖苷酶简称CBH、
7、内切1,4葡聚糖苷酶简称EG和1,4葡萄糖苷酶简称BG2。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。13作用机理纤维素酶在促进纤维素、半纤维素分解的同时,还可促进植物细胞壁的溶解,使更多的植物细胞内容物溶解出来,有利于动物胃肠道的消化吸收。同时,纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌,补充内源酶的不足,并对内源酶进行调整,保证动物正常的消化吸收功能,起到防病、促生长的作用,消除抗营养因子,促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液,增加消化物的黏度,对内源酶造成障碍,而添加纤维素酶可降低黏度,增加内源酶的扩散,提高酶与养分接触面积,促进饲料的良好消化。而纤维素酶制剂本身是一种由
8、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物,在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物,从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素,促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外,还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。2纤维素酶的应用自从1906年SEILLIERE从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来,人们对纤维素酶做了大量的研究,特别是20世纪80年代以来,由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起,纤维素酶的研究出现了新的前景。现在纤维素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各
9、个领域,其应用前景十分广阔3。专家预测,针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关键。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。21在饲料工业上的应用211制备低纤维饲料由真菌木霉和黑曲霉所产生的纤维素酶同时含有能将天然纤维素降解成易消化糖的多种酶组分,且降解纤维素的能力很强。利用纤维素酶这种特性,可使粗饲料制作成低纤维饲料。这已在兔等家禽饲养中得到了试验应用,但推广面还很小212饲料酶制剂的制作和应用酶制剂作为家畜饲料添加剂在国外已引起越来越多的关注。用于制作酶剂的酶有多种,由于家禽家畜一般难消化利用纤维素和半纤维素,因此,纤维素酶在饲料酶
10、制剂中应用最为普遍。使用饲料纤维素酶制剂,可以促进动物的消化吸收,大大提高动物对饲料的利用率。213植物纤维原料酶水解生产饲料酵母饲料酶母是重要的饲料蛋白资源,饲料酵母通过植物纤维原料水解后生产饲料酵母前景广阔。传统的植物纤维原料水解方法为酸法水解鉴于酸水解需高温、高压,对设备要求高,投资大,水解副产物多,糖得率低,水解液中有害物质多,不便于酵母繁殖等缺点,纤维素酶法水解替代酸水解用于植物原料生产饲料酵母是必然趋势。22纤维素酶在造纸业中的应用【4】221用于废纸脱墨用纤维素酶和半纤维素酶结合处理，可促进脱墨过程，并且能在低PH值的纸浆进行脱墨。四川轻化工学院的李文俊等【5】,对纤维素酶在废报
11、纸脱墨中的应用进行了实验性探索。实验结果表明A酶法脱墨能获得比化学法脱墨更好的脱墨效果，还能改善浆料的强度及其滤水性。同时，还确定国产废报纸纤维素酶法脱墨最佳工艺条件为PH60,酶用量01，时间40MIN，温度40，浆浓55。222用于处理造纸废料一些难处理的废料如含纤维较低的脱墨淤泥（其中含4050的无机墨水）和细小纤维等，用酶法处理可节约开支，减少污染。纤维素酶首先将废料降解成糖，再将其转换成乙醇等化学原料或燃料，达夫谢列卢以每克底物1040单位酶活性的比例使50的脱墨淤泥转化成糖，而墨汁存在不影响酶活性；孙伟强等将造纸中的细小纤维进行细菌发酵可产酒精陈惠忠等将酶解和发酵同时进行；可转化造
12、纸厂的废纤维为酒精。223用于改善纸张性能MANSFIELD等【6】,用复合纤维素酶NOVOZYMESP342选择性地单独处理纸浆的粗长纤维级分,可提高成浆得率,降低酶的使用量,并改善纸张的平滑度,从而改善纸张的印刷适性。尽管存在纸浆黏度和撕裂度降低的缺点,但纸浆的抗张强度增加10,使粗糙的花旗松纤维原料可以生产出高级纸品。3海洋细菌纤维素酶的优势纤维素类物质是自然界中存在的最丰富的一类可再生的有机物质资源7。地球上每年光合作用产生大于100亿T的植物干物质,其中一半以上是纤维素和半纤维素8。如果利用纤维素酶将天然纤维素降解为可利用的糖液,再进一步转化为酒精、菌体蛋白、气体燃料如氢气等物质,对
13、解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远的意义9。然而，一直以来，研究者把分离纤维素降解菌的场所主要局限于陆地土壤中，使得纤维素酶的来源受到了很大的限制10。虽然目前仅有少数学者对产纤维素酶的海洋微生物进行了研究，但已显示出海洋微生物在开发纤维素酶方面具有诱人的前景11。31细菌纤维素酶的优势微生物是纤维素酶的主要来源,其中主要有细菌、放线菌和真菌,目前研究的最清楚的是霉菌中的里氏木霉TREESEI，研究最多的是真菌12。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶,这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱,长期以来没有得到足够的重视。但原核生物的基因一般不含内含子,可
14、直接从基因组DNA中克隆到目的基因用于工程菌的构建。因此细菌纤维素酶基因的克隆,既利于研究纤维素酶基因的多样性,也利于高效纤维素酶基因工程菌的构建。随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值13。32海洋细菌纤维素酶的特性新近研究表明海洋微生物酶一般在高盐条件下仍具有高的活性，这使它们可以被应用到工业中某些需要苛刻条件的生产工艺中14；同时海洋微生物酶还具有耐高温、可以在室温下长时间保持高活性、耐极端PH等特性15。这些特性将可以在很大程度上解决因工业化生产中的高盐、
15、高温、强碱或强酸等使酶失活的问题。因此，海洋细菌纤维素酶比陆地细菌更有优势，研究这方面内容也显得很有意义。4产纤维素海洋细菌的筛选方法41初筛411刚果红染色法162216E培养基配方【17】蛋白胨50G，酵母汁膏10G,1000ML人工海水,20琼脂粉,PH7678。在2216E培养基中添加05羧甲基纤维素钠，纤维素酶能催化分解羧甲基纤维素钠。室温培养72H后往培养基中加入01的刚果红溶液，染色1H；弃去废液，加入1MOL/LNACL洗脱，浸泡1H。由于刚果红能与羧甲基纤维素钠发生结合，无法洗脱，所以若菌落周围出现透明圈，则说明该菌株能产纤维素酶。412台盼兰法TIYPANBLUE18将00
16、075的台盼兰染料作为一种成分直接加人到分离培养基中，培养一定时间后，在菌落周围产生较明显降解圈者即产纤维素酶。413UNITEX染色法UNITEXDYES将培养适当时间的平板，用UNITEX染料浸染平板，而后放到紫外灯下观察，菌落周围有晕圈HALO者，即产纤维素酶。42复筛3,5二硝基水杨酸法（DNS）【19】将初筛得到的菌株接种到羟甲基纤维素钠发酵培养基中培养后得到胞外和胞内的粗酶液，采用DNS法用紫外可见分光光度计与540NM处测定OD值，规定每分钟产生一个微克葡萄糖的酶量为一个酶单位（U）【20】。U越小则说明酶活性越强，所对应的菌株也就越优良。5鉴定方法51细菌形态和生化学学特性试验
17、菌株纯化后，作培养特征，革兰氏染色，芽孢形成、细胞形态，运动性，菌落颜色，氧化酶和过氧化氢酶产生等细菌学特性试验，根据结果选择法国梅里埃公司API21鉴定条，测定菌株生理生化反应，按“革兰氏阴性杆菌新编码鉴定”系统22、API细菌鉴定系统结合伯杰氏细菌鉴定手册19对菌株进行检索。5216SRDNA法采用引物27F5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，907F5AAACTCAAATGAATTGACGGG3，517F5CCAGCAGCCGCCGGTAAT3，进行菌株16SRDNA基因的扩增，50L的扩增体系含有2单位TAQDNA聚合酶（PROMEGA，MADISON，WIS，USA），1T
18、AQBUFFER，2MMOL/LMGCL2，02MMOL/LDNTP，引物各10PMOL。PCR扩增30个循环，每个循环包括94预变性2MIN、58退火1MIN和72延伸15MIN，最后在72延伸10MIN。扩增产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株序列经CLUSTALW18123行多序列联配，使用JUKESANDCANTOR法24算进化距离用邻位相连法分析后通过MEGA31构建系统发育树，通过BOOTSTAP法对树进行评估分析25。6发展前景随着人们对纤维素酶研究工作的深入,纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。如何加大对纤维素酶研究和
19、开发的科技投入和经费投入,改变目前规模小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状,尽快采用各种行之有效的高新技术,发展具有中国自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型,满足市场的需求是当务之急。同时,动物纤维素酶与微生物酶系有所不同,作为一个新的纤维素酶体系,它的研究也具有重大的理论价值,因此,可能成为纤维素酶研究的热点。尤其海洋细菌所产的纤维素酶具有许多独特的优势，在工业上将会更有应用前景。参考文献1高伦江，董全，唐春红纤维素酶的研究进展及前景展望江苏食品与发酵,2007,35414172窦烨，王清路，李俏俏纤维素酶的应用现状J中国酿造,2008,271215173王菁莎,
20、王颉,刘景彬纤维素酶的应用现状J。中国食品添加剂,2005,（5）1071194郝月,杨翔华,洪新纤维素酶的应用研究J青海科技,2005,331355李文俊,杨玲纤维素酶用于废纸脱墨J西南造纸,2006,（6）11136秦全贵,等纤维素酶与造纸工业J广西轻工业,1197,312157张加春,易琴,黄遵锡纤维素酶曲的潜盘生产研究J云南师范大学学报自然科学版,2002,250528LESCHINESBCELLULOSEDEGRADATIONINANAEROBICENVIRONMENTSJANNUREVMICROBIO,1995,493994269CHERRYJR,FIDANTSEFALDIRECT
21、EDEVOLUTIONOFINDUSTRIALENZYMESANUPDATEJCURROPINBIOTECHNO,L2003,1443844310臧路平产纤维素酶海洋菌株的分离及培养条件研究现代食品科技,2009,25101170117311林白雪,黄志强,谢联辉海洋细菌活性物质的研究进展微生物学报J,2005,45465766012孙凯,孟宁,冯琳,李师翁产纤维素酶菌株的筛选鉴定及产酶条件研究食品与科学2009,28415916213陈春岚,李楠细菌纤维素酶研究进展广西轻工业,2007,1182014韩韫，蔡俊鹏产纤维素酶海洋菌株的筛选及鉴定现代食品科技,2005,213364415MOHA
22、PATRA,BR,BAPUJI,M,SREE,APRODUCTIONOFINDUSTRIALENZYMESAMYLASE,CARBOXYMETTYLCELLULASEANDPROTEASEBYBACTERIAISOLATEDFROMMARINESEDENTARYORGANISMSACTABIOTECHNOL2003,231758416TEATHERRM,WOODPJAPPLENVIRONMEROBIOL，198243777一78017范秀容，李广武，沈萍微生物学实验北京高等教育出版社,1994，26718CANTWELLBA，MECONNELLDJGENE，1983，2321121919张信旭
23、，高海波3,5二硝基水杨酸测定古尼虫草中多糖含量方法贵州化工，2002,27（3）233820JEANHERASMUS,PETERACOOKTHEROLEOFBACTERIAINTHEDIGESTIONOFSEAWEEDBYTHEABALONEHALIOTISMIDAEAQUACULUREJ,1997,15537738621SHINICHIFURUKAWA,TATSUOFUJIKAWA,DAIZOKOGAETALPRODUCTIONOFFUCOIDANDEGRADINGENZYMES,FUCOIDANASE,ANDFUCOIDANSULFALASEBYVIBROSPN5JNIPPONSUISA
24、NGAKKAISHI,1992,5881499150322TAKESHISAKAI,HITOMIKIMURA,IKUNOSHINKATOAMARINESTRAINOFFLAVOBACTERIACEAEUTILIZESBROWNSEAWEEDFUCOIDANJMARBIOTHECHNOL,2002,439940523THOMPSONJD,GIBSONTJ,PLEWNIAKF,ETALCLUSTALXWINDOWSINTERFACEFLEXIBLESTRATEGIESFORMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTAIDEDBYQUALITYANALYSISTOOLSJNUCLEICACI
25、DSRESEARCH1997,244876488224JUKESTH,CANTORCREVOLUTIONOFPROTEINMOLECULESINMUNROMAMMALIANPROTEINMETABOLISMACADEMICPRESS,NEWYORK,19692113225FELSENSTEINJCONFIDENCELIMITSONPHYLOGENIESANAPPROACHUSINGTHEBOOTSTRAPJEVOLUTION,1985,39783789本科毕业设计（20_届）产纤维素酶的海洋细菌的筛选及初步鉴定目录中英文摘要1引言111纤维素酶研究简介112纤维素酶的应用2121在饲料工业上的
26、应用2122在造纸业中的应用213细菌纤维素酶的优势314海洋细菌纤维素酶的特性315课题意义32材料与方法521实验材料5211培养基5212试剂5213引物5214菌种522实验方法5221初筛5222复筛6223鉴定63结果与分析831初筛结果832复筛结果1033菌株E9和W8的分子鉴定结果114小结12致谢13参考文献14摘要为筛选出纤维素酶高产菌，从宁波大学实验室取得150株海洋细菌菌株，复苏后在CMCNA选择培养基上培养，经刚果红染色法，菌落周围产生透明圈的有38株，透明圈与菌落直径比HC大于3的有9株，其中编号为E9和W8的菌株HC值最大都为425。用DNS法对这9株菌进行复筛
27、，筛选出CMC酶活和滤纸酶活都较高的菌株，仍为E9和W8，其中菌株E9的CMC酶活和FPA分别为115U和567U，菌株W8的CMC酶活和FPA分别为111U和541U。经16SRDNA法鉴定，菌株E9和W8分别与THALASSOBACTERSTENOTROPHICUS和MARIBACTERDOKDONENSIS的16SRDNA系列具有较高的相似性，相似度分别为95和99。关键词海洋细菌；纤维素酶；筛选；16SRDNAABSTRACTINORDERTOOBTAINTHECELLULASEPRODUCINGBACTERIA,150MARINEBACTERIAFROMOURLABORATORYWE
28、RESCREENEDBASEDONTHECMCNAMEDIUMPLANTTHERESULTSSHOWED38OF150STRAINSCOULDPRODUCECELLULASEAMONGTHEM,9STRAINSHAVEHIGHERACTIVITYHC3THEHCOFE9ANDW8WASTHEHIGHESTHC425THEANALYSISOFE9BASEDONCMCASEACTIVITYANDFPAWAS115UAND567U,RESPECTIVELYTHEW8WAS111UAND541U,RESPECTIVELYMOLECULARPHYLOGENETICANALYSISOFMARINEBACT
29、ERIABASEON16SRDNASEQUENCESINDICATEDTHATTHEYEXHIBITEDTHEHIGHTESTSIMILARITY95AND99,RESPECTIVELYTOTHE16SRDNAFRAGMENTSOFTHALASSOBACTERSTENOTROPHICUSANDMARIBACTERDOKDONENSIS。KEYWORDSMARINEBACTERIACELLULASESCREENING16SRDNA1引言11纤维素酶研究简介纤维素物质是世界上最丰富的却又未得到充分利用的可再生性物质资源宝库，它将是人类未来的能量、食物和化工原料的主要来源。合理开发和科学利用这一丰厚
30、天然资源是世界各国研究开发的重点领域。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源食物和化工原料，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义。筛选出产高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源的前提和关键。纤维素是绿色植物细胞壁的主要成份，是自然界中含量最丰富的有机碳水化合物，生物界最重要的碳源。纤维素属于多糖，由毗喃葡萄糖分子通过（14）糖昔键缩合生成的线性大分子多聚物。纤维二糖是其基本单元。纤维素分子的大小由聚合度DP定义，即一个分子所含葡萄糖残基数。植物纤维素DP14000，微生物纤维素DP3500，商品纤维素DP50一50001。目前纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维
31、素酶的水解作用。利用纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖称为纤维素的生物转化工艺，生物转化的关键就是纤维素酶的生产。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称,是一个有多种水解酶组成的复合酶系。根据其作用方式一般可将纤维素酶分为内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CHB）和葡萄糖苷酶（BG）2。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。纤维素酶来源非常广泛，如昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属3，其中丝状真菌木霉属被公认是产纤维素酶最高的菌种之一4。有许多种木霉不但分泌的纤
32、维素酶产量高，而且纤维素酶系的三种组分（葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、葡萄糖昔酶）比例较协调，因而纤维素酶酶活较高。更为有利的是木霉分泌的纤维素酶是胞外酶，所以分离纯化比较容易5，而且木霉具有培养粗放，适应性强的特点，适于固体培养和液态深层发酵，从而可以大规模应用于生产，目前在工业、农业、环境科学等方面有着广泛的用途，成为当前生产上应用较多的菌种，也是目前国内外研究最广泛的纤维素酶产生菌，在学术研究中引起广泛关注。其中里氏木霉TRICHODERMAREESEI因其纤维素酶产量较高，易于培养和控制、产纤维素酶稳定性好、培养及代谢产物安全无毒等优良特点，成为生产纤维素酶典型菌种6。纤维素酶三种组分协
33、同水解纤维素的过程是首先纤维素酶分子吸附到纤维素表面，由葡聚糖内切酶EG随机水解纤维素非结晶区的1，4糖普键，将长键纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；葡聚糖外切酶CBH可从纤维素线性分子的非还原性末端水解，每次切下一个纤维二糖分子；葡萄糖苷酶（BG）则将纤维二糖水解成葡萄糖分子。由于纤维素底物的高度复杂性以及底物的多样性，纤维素酶作用机制目前还没有完全研究清楚。12纤维素酶的应用自从1906年SEILLIERE从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们对纤维素酶做了大量的研究，特别是20世纪80年代以来,由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤维素酶的研究出现了新的前景。现在
34、纤维素酶的应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔7。专家预测，针对扮演绿色化学品的纤维素酶的研究开发利用是新世纪的可再生性资源的关键。对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。121在饲料工业上的应用由真菌木霉和黑曲霉所产生的纤维素酶同时含有能将天然纤维素降解成易消化糖的多种酶组分，且降解纤维素的能力很强。利用纤维素酶这种特性，可使粗饲料制作成低纤维饲料。这已在兔等家禽饲养中得到了试验应用，但推广面还很小。酶制剂作为家畜饲料添加剂在国外已引起越来越多的关注。用于制作酶剂的酶有多种，由于家
35、禽家畜一般难消化利用纤维素和半纤维素，因此，纤维素酶在饲料酶制剂中应用最为普遍。使用饲料纤维素酶制剂，可以促进动物的消化吸收，大大提高动物对饲料的利用率。饲料酶母是重要的饲料蛋白资源,饲料酵母通过植物纤维原料水解后生产饲料酵母前景广阔。传统的植物纤维原料水解方法为酸法水解鉴于酸水解需高温、高压,对设备要求高，投资大，水解副产物多，糖得率低，水解液中有害物质多，不便于酵母繁殖等缺点，纤维素酶法水解替代酸水解用于植物原料生产饲料酵母是必然趋势。122在造纸业中的应用8用纤维素酶和半纤维素酶结合处理，可促进脱墨过程，并且能在低PH值的纸浆进行脱墨。四川轻化工学院的李文俊等9，对纤维素酶在废报纸脱墨中
36、的应用进行了实验性探索。实验结果表明A酶法脱墨能获得比化学法脱墨更好的脱墨效果，还能改善浆料的强度及其滤水性。同时，还确定国产废报纸纤维素酶法脱墨最佳工艺条件为PH60，酶用量01，时间40MIN，温度40，浆浓度55。一些难处理的废料如含纤维较低的脱墨淤泥（其中含4050的无机墨水）和细小纤维等，用酶法处理可节约开支，减少污染。纤维素酶首先将废料降解成糖，再将其转换成乙醇等化学原料或燃料，达夫谢列卢以每克底物1040单位酶活性的比例使50的脱墨淤泥转化成糖，而墨汁存在不影响酶活性；孙伟强等将造纸中的细小纤维进行细菌发酵可产酒精；陈惠忠等将酶解和发酵同时进行，可转化造纸厂的废纤维为酒精。MAN
37、SFIELD等10,用复合纤维素酶NOVOZYMESP342选择性地单独处理纸浆的粗长纤维级分，可提高成浆得率，降低酶的使用量，并改善纸张的平滑度，从而改善纸张的印刷适性。尽管存在纸浆黏度和撕裂度降低的缺点，但纸浆的抗张强度增加10，使粗糙的花旗松纤维原料可以生产出高级纸品。13细菌纤维素酶的优势细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶，这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。但细菌所含纤维素酶基因一般不含内含子，可直接从基因组DNA中克隆到目的基因用于工程菌的构建。因此细菌纤维素酶基因的克隆，既利于研究纤维素酶基因的多样性，也利于高效纤维素酶基因工程菌的构建。随着中性纤
38、维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，以及耐热性纤维素酶在燃料酒精生产中应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用性能和巨大的经济价值11。14海洋细菌纤维素酶的特性新近研究表明海洋微生物酶一般在高盐条件下仍具有高的活性，这使它们可以被应用到工业中某些需要苛刻条件的生产工艺中12；同时海洋微生物酶还具有耐高温、可以在室温下长时间保持高活性、耐极端PH等特性。这些特性将可以在很大程度上解决因工业化生产中的高盐、高温、强碱或强酸等使酶失活的问题。因此，海洋细菌纤维素酶比陆地细菌更有优势，研究这方面内容也显得很有意义。15课题意义工业革命提高了世界对能源主要是矿物燃料的需求
39、。随着工业化的进展，石油的需求量很大因此，出现了严重的环境问题16。随着石化燃料由短缺变枯竭，能源成为人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展及至人类的生存问题17。纤维素与石化燃料不同，它是自然界中最丰富的而且能够循环再生的多糖类有机质6。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨植物干物质，一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量纤维素，如农业废物稻草，稻壳，花生壳，麦杆，玉米芯，甘蔗渣等、食品加工废物果皮、果渣等、木材废物木屑、树皮以及城市废弃物4060固体废物是垃圾和废纸。我国每年光作物秸杆一项就有5亿吨之多，高于全国粮食总产量13，这些纤维素物
40、质除部分作为造纸和植物性纤维利用外，大部分被燃烧或废弃，不仅造成资源浪费，还会污染环境。以植物性纤维为原料，利用微生物生产纤维素酶，并将纤维转化为人类急需的能源、食物和化工原料，如葡萄糖、酒精、饲料等产品，不仅可作为新能源、新资源为人类造福，而且对人类社会解决全球能源危机、食品和饲料资源紧张以及环境污染有着重大意义，对于人类社会的可持续发展具有非常重要的意义14，因而成为世界各国竞相开展的研究课题15。2材料与方法21实验材料211培养基2216E培养基配方蛋白胨5G酵母膏1GFEPO44H2O00148G琼脂18GPH7678212试剂羧甲基纤维素钠（CMCNA）01刚果红溶液1MOL/LN
41、ACL洗脱液PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂称取酒石酸钾钠1820G，溶于500ML蒸馏水中，加热（切记不超过50），于热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸（DNS）63G，NAOH210G，重蒸酚50G，无水亚硫酸钠50G，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000ML，贮存于棕色瓶中避光4冰箱保存，放置一周后使用，使用前用烧结玻璃过滤器过滤（有效期为6个月）。1MG/ML标准葡萄糖溶液精确称取105烘至恒重的无水葡萄糖分析纯1000G，以蒸馏水溶解后，定容至1000ML容量瓶中制备成LMG/ML的标准葡萄糖溶液。再稀释成L00G/ML，20
42、0G/ML，300G/ML，400G/ML，500G/ML的不同浓度的葡萄糖溶液，用蒸馏水做对照，绘制出反应葡萄糖溶液浓度与其对应的吸光度值之间关系的葡萄糖标准曲线，及曲线方程式。213引物27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）1429R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）214菌种来源于宁波大学实验室22实验方法221初筛从超低温冰箱（70）中取出菌株接种到斜面2216E培养基中，28下培养2D。待斜面培养基上长出大量菌后，用接种环将菌接种到CMCNA选择培养基上，一个平板接4株菌（点种时要尽量点圆），28下培养2D。待平板上出现菌落后，测量菌落直径D，记录数据。小
43、心刮去菌落，用01的刚果红溶液染色30MIN。染色结束后，用1MOL/LNACL溶液脱色2次，每次20MIN，观察有无透明圈并测量透明圈直径D。计算HCD/D。HC值越大，表明酶活越强。222复筛粗酶液的制备挑取斜面培养基上培养的菌种，接种于25ML羧甲基纤维素钠发酵培养基中，28下培养2D。所得发酵液经4、5000R/MIN离心30MIN，收集上清液作为粗酶液,用于酶活力的测定。CMC酶活测定取05ML适当稀释的粗酶液，加入1CMCNA底物溶液CMCNA溶于PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液2ML，50保温酶解反应30MIN，先预热5分钟。然后加入DNS显色液3ML，放入已沸
44、腾的水中沸水浴5MIN，流水冷却后在540NM下测吸光度。同时用100煮沸5MIN后失活的酶做对照，扣除本底。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出CMC酶活值。在此CMC酶活力单位定义为以1CMCNA溶液为底物，在一定反应条件PH48，50，恒温30MIN下，以水解反应中，LML纤维素酶液LMIN催化纤维素生成LG（1MOL）葡萄糖为1个CMC酶活单位，以U表示。滤纸酶活（FPA）测定取05ML适当稀释粗酶液，加入PH值为48，0LMOL/L的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液LML，再加入5005MG滤纸1CM6CM一条，于50保温酶解反应1小时先预热5分钟。然后加
45、入DNS显色液3ML，放入已沸腾的水中沸水浴5MIN，流水冷却后在540NM下测吸光度。同时用100煮沸5MIN后失活的酶液做对照，扣除本底。根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。在此滤纸酶活单位定义为以滤纸为底物，在一定反应条件PH48，50，恒温LH下，以水解反应中，LML纤维素酶液LMIN催化纤维素生成LG（1MOL）葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。223鉴定细菌基因组DNA的制备去培养到指数生长期细菌菌液5ML，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。引物设计海洋细菌16SRDNA基因扩增选用通用引物27F（5AGAGTT
46、TGATCCTGGCTCAG3）和1429R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）进行扩增。PCR反应体系与条件PCR采用50L体系，反应条件为943MIN；9440S，591MIN，7240S，30个循环；7210MIN。PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳。PCR克隆PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，回收DNA，将纯化后的PCR产物先与PMD18TVECTOR连接，然后转化到DH5细胞，后提取重组质粒进行目的片段的测序DNA序列测定和系统发生学分析测序由上海生工生物技术有限公司完成。获得的16SRDNA序列提交GENBANK用BLAST软件与已知序列进行对比，确定与其序列
47、相似度最高的菌种。3结果与分析31初筛结果经刚果红染色后，菌落周围有透明圈产生的有38株菌，数据见表1。表1初筛有透明圈产生的菌株及其HC值菌株编号菌落直径（D）透明圈直径DHC值（D/D）E3411275E8141435INE3331E64615E549225INE5362E1814175E2101414E48273375E7914156W78253125E10102525E9834425E111222183E12932356E138232875E16933367W11118164W282835W221117155W8834425W3814175W4925278W5822275W610232
48、3YHRDO15E1115136YHRDO15E914156YHHSSOO5E712171YHRDO12E818225YHHSOO53E8151875YHHDO151E82025YHRDO14E81215ATCI0204710143YHHDO14E712171SSEM28101818YHHDO16E913144YHHDO161E723329YHHDO16E101818图1个别菌株初筛透明圈图其中HC值大于3的共有E81，E4，W7，E9，E12，E16，W2，W8，YHHDO161E这9株菌，其中编号为E9和W8的菌株HC最大，都为425。产纤维素酶菌株因为产生的纤维素酶分解CMCNA，使得染
49、色液被洗脱，所以菌落周围形成了透明圈。HC值是透明圈直径与菌落直径的比值，能定性表示酶的活性大小，HC值越大，表明酶活越强。32复筛结果对上述9株菌进行复筛，用DNS法测得各自的CMC酶活和FPA，见表2。表2复筛菌株CMC酶活和FPA菌株编号CMC酶活U/MLFPA（U/ML）E81103533E492492W763436E9115567E1256363E1655387W246267W8111541YHHDO161E62441从表2可看出，9株菌的纤维素酶活与选择性刚果红染色所得到的结果基本上相符合，HC值较大的，CMC酶活也相对较大，其中编号E9的菌株CMC酶活最大为115U，编号W8的菌株CMC酶活为111U。编号E9的FPA也是最大为567U，FPA最小的是菌株W2，为267U。不同菌株对滤纸的分解能力和进程相差较大。E9和W8分解滤纸的能力最强；W2则最弱。在分解滤纸的进程中，E9和W8中的滤纸片在反应一个小时后四角开始变薄，而其它菌株的滤纸没有任何变化。反应三个小时后，除株W2的滤纸仍没被分解、滤纸没有变化外，其他菌株中的滤纸均开始变形；而E9和W8中的滤纸片则更是已经崩溃，呈网状的碎片
