1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程产蛋白酶乳酸菌的筛选一、选题的背景与意义乳酸菌（LACTICACIDBACTERIA,LAB指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。相当多的乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，随着人们生活水平的不断提高，乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面发挥越来越重要的作用。乳酸菌蛋白酶的主要作用第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏
2、膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。但目前关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，尤其是关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及到所有乳酸菌，还具有很大的发展空间。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据；可以为蛋白酶的生产提供依据；可以为鲳鱼饲料的生产提供依据总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。二、研
3、究的基本内容与拟解决的主要问题1、研究基本内容从泡菜、酸奶、豆腐乳等实验材料中分离纯化乳酸菌；将分离出的乳酸菌进行增值培养；对增值培养的乳酸菌进行产蛋白能力测定，筛选出产蛋白能力最强的乳酸菌菌种；菌种鉴定。2、拟解决的主要问题乳酸菌菌种的来源；菌种鉴定方法。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201010201011查阅相关文献和资料，设计实验步骤，熟悉实验基本操作；20101220111进行产蛋白酶乳酸菌筛选的具体试验；2011220113撰写论文五、主要参考文献1孟祥晨,杜鹏,李艾黎等乳酸菌与乳品发酵剂M北京科学出版社,2009122CHRISTENSENJE,DUDLEYEG
4、,PEFERSONJAPEPTIDASESANDAMINOACIDCATABOLISHINLACTICBACTERIAJANONIEVANLEEUWENHOEK,1999,762172183MCCARTNEYALAPPLICATIONOFMOLECULARBIOLOGICALMETHODSFORSTUDYINGPROBIOTICSANDTHEGUTFLORAJBRJNUTR,2002,8829374杨振宇,高学军,王庭柱发酵乳杆菌菌株的多相分类鉴定J中国论文科技在线,2007195熊素玉,姚新奎,谭小海,等酸马奶中乳酸菌的分离、纯化与鉴定J新疆农业科学,2007,4456967016刘宏生,娄
5、红,丛立晶,等酸菜发酵的乳酸菌筛选及初步研究J辽宁大学学报,1997,24185887黄颖,杜娜,郑永晨,等藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离纯化与鉴定J中国实验诊断学，2010,1445175198霍贵成乳酸菌的研究与应用M北京中国轻工业出版社,20079东秀珠,凌代文乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法M北京中国轻工业出版社,199610李少英,乌尼马奶酒中乳酸菌的分离及其生物学特性的研究J内蒙古农业大学学报,2002,12596611赵立彬,刘凌,童军茂,等泡菜乳酸菌筛选鉴别及耐受性和促益生菌增殖的研究J食品与发酵工业,2009,3510283212HANNON,JA,WILKINSON,MG,DELA
6、HUNTY,CM,ETALUSEOFAUTOLYTICSTARTERSYSTEMSTOACCELERATETHERENATURINGOFACHEDDARCHEESEINTERNATIONALDAIRYJOURNAL,2003,1331332313杨洁彬乳酸菌生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社，19963514陈超,高学军,刘营,等产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化J乳业科学与技术，2008,12416016215宫春波,谢丽源,贺睿非乳酸中益生菌活性影响因素的研究概况J饮料工业,2003,53323716张光伟,王宇建,钱萍,等酸性蛋白酶高产菌选育的研究J江苏食品与发酵,005,33813
7、17刘海音,张超乳酸菌的分离和初步鉴定J长春师范学院学报，2005,147212718刘慧现代食品微生物学实验技术M4北京中国轻工业出版社,2009,23524019张云峰,李有志,莫天砚嗜热蛋白酶产生菌BACILLUSSPDPE7的产酶条件研究J广西大学学报自然科学版，200429323123520SB/T103171999,蛋白酶活力测定法S北京中华人民共和国专业标准协会,199921凌代文,东秀珠乳酸细菌分类鉴定及实验方法M北京中国轻工业出版社,1993322方芳,冀林立,张彦斌,等产耐热蛋白酶乳酸菌的筛选、产酶条件及其酶学性质的研究J食品科学,2008,291037537923许提森鲈
8、鱼肠道内产蛋白酶菌的分离与筛选J安徽农业科学,2008,3611444624于宏伟,栗志丹,郝珊珊,等蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究J农产品加工,200610676825李平兰,张彪,郑海涛乳酸菌及其生物工程研究进展J中国乳品工业,2000,1285053毕业论文文献综述食品科学与工程关于产蛋白酶乳酸菌筛选的进展研究摘要乳酸菌蛋白水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标，对乳酸菌相关工业的发展起着重要的的作用。产蛋白酶乳酸菌的筛选研究可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据，也可以为蛋白酶的
9、生产提供依据，具有重要意义。关键词乳酸菌蛋白酶筛选0前言乳酸菌（LACTICACIDBACTERIA,LAB指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称1。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种LAB2。相当多的LAB是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中，对人和动物的健康是有益的3。目前，随着人们生活水平的不断提高，LAB在农业、医学、兽医以及食品工业等4方面发挥越来越重要的作用。酸奶、豆腐乳、鱼肠、泡菜、蘑菇等食品中都包含多种乳酸菌57，可以把这些食
10、品作为菌种来源从中分离纯化酸菌，并从中对产蛋白酶的乳酸菌种进行筛选，从而分离得到产蛋白酶能力强的乳酸菌，以为乳酸菌相关产业的发展提供更优良的菌种。1产蛋白酶乳酸菌研究状况11乳酸菌研究状况乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面都有着重要应用，因此目前关于乳酸菌一些生理生化特性已经有了比较系统全面的研究。其中关于乳酸菌的蛋白水解系统、耐酸性机制、噬菌体及抗噬菌体感染机制、细菌素的产生、胞外多糖分离纯化和特性研究等8方面目前已经有了较为全面系统的认识。乳酸菌在食品工业中应用的研究，目前主要集中于各种食品中乳酸菌的分离纯化，乳酸菌在泡菜、乳制品等食品中的应用，乳酸菌在干酪生产中的应用几个方面，尤
11、其是乳酸菌应用到乳制品中制成酸奶的研究报道已经很多912。12乳酸菌的作用大多数的乳酸菌属于是益生菌，是人体内必不可少且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中，对人和动物的健康发挥着以下六方面的重要作用131、排除致病菌、维持宿主肠道菌相平衡。2、营养价值。乳酸菌有利于维他命K、维他命B的吸收，同时也可促进钙及其它营养的消化吸收预防骨质疏松症。3、改善乳糖不耐症。乳酸菌所含的酶系统可弥补乳糖不耐症患者宿主产生乳糖分解酶不足的缺陷，利用乳酸菌产生的乳糖分解酶活性，将肠内乳糖代谢分解。4、减少血液胆固醇堆积。5、抑制癌症。食用乳酸菌或肠内有足够的乳酸菌存在时，可减低人类粪便中的某些菌体产
12、生的酥活性如NITROREDUCTASE、AZOREDUCTASE及GLUCURONIDASE等致癌酶的活性。6、刺激免疫反应，增加宿主抵抗能力。乳酸菌细胞壁含有某些抗原成份可诱发活化、增加巨噬细胞及淋巴细胞而强化免疫球蛋白AIGA的浓度，并产生R干扰素以刺激宿主免疫系统抑制肿瘤或者使寄主产生免疫抗体以抑制病菌吸附黏膜表面。13产蛋白酶乳酸菌研究现状目前关于乳酸菌的研究报道虽然已经很多，但关于乳酸菌代谢产物的研究报道目前却很少，其中关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道目前也只有寥寥几篇。其中最早的是2008年陈超、高学军、刘营等14发表的产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化。现今，由于乳酸菌具有营养作用
13、、食疗功效、医疗保健功能和安全性15它在现今社会已得到了广泛的研究和开发。乳酸菌蛋白质水解能力作为影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的主要指标16，目前对它的研究具有十分的必要性和迫切性。现在，产蛋白酶乳酸菌的研究时间比较短、从事这方面研究的人员也比较少，所以关于产蛋白酶乳酸菌的筛选还远未涉及到所有乳酸菌，乳酸菌产蛋白酶的研究还有很大的发展空间。产蛋白酶乳酸菌的研究也将为食品工业的进一步发展提供更优良的菌种，从而促进我国食品工业的发展和人民生活水平的提高。14产蛋白酶乳酸菌筛选流程产蛋白酶乳酸菌的筛选根据实验条件和菌种来源不同可以采用多
14、种不同的实验方法，但各种方法的基本流程都是基本相同的17。基本流程如下乳酸菌的分离与初步鉴定实验流程18待分离样品梯度稀释平板分离培养观察菌落特征挑单菌落纯化培养镜检个体形态、纯度H2O2酶试验19革兰氏染色20挑选凝乳管乳酸测定菌种保存。初步筛选产蛋白酶的乳酸菌21分离纯化乳酸菌培养增殖配制酪蛋白培养基乳酸菌划线培养选择菌落周围形成透明圈的菌种。酶活力的测定培养基的配制乳酸菌增殖培养福林法22测定酶活力。2产蛋白酶乳酸菌筛选意义乳酸菌作为一种在农业、医学、兽医以及食品工业等方面都具有重要的作用的一类细菌，它的研究开发和利用对我国的经济社会的发展和人民生活水平的提高都具有重要作用23。乳酸菌蛋
15、白酶的主要作用第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以使以后在乳酸菌开发利用过程中更利于筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种。产蛋白酶乳酸菌的筛选也可以为蛋白酶的生产提供依据，方芳、冀林立、张彦斌等24在产耐热蛋白酶乳酸菌的筛选、产酶条件
16、及其酶学性质的研究中指出，耐热蛋白酶的重要来源之一就是乳酸菌。同时，产蛋白酶乳酸菌的筛选还可以为饲料的生产提供依据，许提森25在鲈鱼肠道内产蛋白酶菌的分离与筛选中指出产蛋白酶能力强的乳酸菌制品应用于鲈鱼养殖，鲈鱼的存活率和生长速度都会有显著提升。总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展26。3前景展望我国现在正处于经济和社会发展的黄金时期，随着经济和社会的不断发展人们对生活质量的要求也在不断提高。乳酸菌作为一种具有营养作用、食疗功效、医疗保健功能和安全性的菌种在未来必定具有广阔的发展前景。产蛋白酶能力作为乳酸菌的一项评判重要指标，对于乳
17、酸菌的选择和利用具有重要的指导作用27。目前，有关乳酸菌产蛋白酶能力的研究还很少产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及所有乳酸菌，所以产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还具有十分重要的理论和实际意义。总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选工作无论在实际生产还是在理论研究中都意义重大，该项工作具有广阔的发展前景。参考文献1孟祥晨,杜鹏,李艾黎等乳酸菌与乳品发酵剂M北京科学出版社,2009122CHRISTENSENJE,DUDLEYEG,PEFERSONJAPEPTIDASESANDAMINOACIDCATABOLISHINLACTICBACTERIAJANONIEVANLEEUWENHOEK,1999,76217218
18、3MCCARTNEYALAPPLICATIONOFMOLECULARBIOLOGICALMETHODSFORSTUDYINGPROBIOTICSANDTHEGUTFLORAJBRJNUTR,2002,8829374杨振宇,高学军,王庭柱发酵乳杆菌菌株的多相分类鉴定J中国论文科技在线,2007195熊素玉,姚新奎,谭小海,等酸马奶中乳酸菌的分离、纯化与鉴定J新疆农业科学,2007,4456967016刘宏生,娄红,丛立晶,等酸菜发酵的乳酸菌筛选及初步研究J辽宁大学学报,1997,24185887黄颖,杜娜,郑永晨,等藏灵菇发酵乳中乳酸菌的分离纯化与鉴定J中国实验诊断学,2010,14451751
19、98霍贵成乳酸菌的研究与应用M北京中国轻工业出版社,20079东秀珠,凌代文乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法M北京中国轻工业出版社,199610李少英,乌尼马奶酒中乳酸菌的分离及其生物学特性的研究J内蒙古农业大学学报,2002,12596611赵立彬,刘凌,童军茂,等泡菜乳酸菌筛选鉴别及耐受性和促益生菌增殖的研究J食品与发酵工业,2009,3510283212HANNON,JA,WILKINSON,MG,DELAHUNTY,CM,ETALUSEOFAUTOLYTICSTARTERSYSTEMSTOACCELERATETHERENATURINGOFACHEDDARCHEESEINTERNATIONA
20、LDAIRYJOURNAL,2003,1331332313杨洁彬乳酸菌生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社，19963515宫春波,谢丽源,贺睿非乳酸中益生菌活性影响因素的研究概况J饮料工业,2003,53323716张光伟,王宇建,钱萍,等酸性蛋白酶高产菌选育的研究J江苏食品与发酵,2005,3381317刘海音,张超乳酸菌的分离和初步鉴定J长春师范学院学报，2005,147212718刘慧现代食品微生物学实验技术M4北京中国轻工业出版社,2009,23524019NORAPHATHWANHLEM,SUBAIDAHBURADALENG,SAOWAKONWATTANACHANT,ETALIS
21、OLATIONANDSCREENINGOFLACTICACIDBACTERIAFROMTHAITRADITIONALFERMENTEDFISHPLASOMANDPRODUCTIONOFPLASOMFROMSELECTEDSTRAINSFOODCONTROL,2011,1240140720PREEYAPORNSURACHON,PEERAPOLSUKON,PRAPANSAKCHAVEERACH,ETALSCREENINGOFLACTICACIDBACTERIAISOLATEDFROMCHICKENCECAFORINVITROGROWTHINHIBITIONOFSALMONELLAENTERITIC
22、ASEROVARENTERITIDISMEDWELLJOURNALS,2011,10893994421张云峰,李有志,莫天砚嗜热蛋白酶产生菌BACILLUSSPDPE7的产酶条件研究J广西大学学报自然科学版,200429323123522SB/T103171999,蛋白酶活力测定法S北京中华人民共和国专业标准协会,199923凌代文,东秀珠乳酸细菌分类鉴定及实验方法M北京中国轻工业出版社,1993324方芳,冀林立,张彦斌,等产耐热蛋白酶乳酸菌的筛选、产酶条件及其酶学性质的研究J食品科学,2008,291037537925许提森鲈鱼肠道内产蛋白酶菌的分离与筛选J安徽农业科学,2008,3611
23、444626于宏伟,栗志丹,郝珊珊,等蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究J农产品加工,200610676827李平兰,张彪,郑海涛乳酸菌及其生物工程研究进展J中国乳品工业,2000,1285053本科毕业设计（20_届）产蛋白酶乳酸菌的筛选目录1引言32材料与方法321材料422试剂422培养基423主要仪器与设备524其他器材525方法5251乳杆菌初步筛选5252筛选产蛋白酶的乳酸菌6253蛋白酶活力测定6254计算93结果与讨论931乳酸菌的筛选932产蛋白酶乳酸菌的初筛1033福林法测定蛋白酶活力11331标准曲线绘制11332乳酸菌菌株蛋白酶活力测定114结论125展望13致谢错误未定
24、义书签。参考文献13摘要为获得具有高产蛋白酶能力的乳酸菌种，本实验利用MRS培养基、过氧化氢试验和革兰氏染色试验从牛奶、泡菜、鲈鱼肠中分离筛选出乳酸菌，再进一步利用酪蛋白培养基与福林法试验筛选出高具有高产蛋白酶能力的乳酸菌菌种。实验从牛奶、泡菜、鲈鱼肠中共分离筛选出17株乳酸菌，经进一步实验筛选出其中具有最强产蛋白酶能力的菌株SA1。它在酪蛋白培养基上产生的溶蛋白圈直径与酶活力分别为21MM，6157U/ML。关键词乳酸菌蛋白酶分离筛选ABSTRACTINORDERTOOBTAINPROTEASEPRODUCINGLACTOBACILLUSSPECIES,MRSMEDIUM,HYDROGENP
25、EROXIDETESTANDGRAMSTAINTESTWEREUSEDTOISOLATEDLACTOBACILLUSFORMMILK、PICKLES、PERCHGUTS,THENMEDIUMCASEINANDTHEFOLINMETHODTESTWASUSEDTOSCREENEPROTEASEPRODUCINGGOODLACTOBACILLUS17STRAINSLACTOBACILLUSWEREISOLATEDFROMMILK、PICKLES、PERCHGUTSTHENFURTHEREXPERIMENTSISOLATEDTHESTRONGESTPROTEASEPRODUCTIONABILITYS
26、TRAINSSA1,WHICHCIRCLEDIAMETEROFSOLUBLEPROTEINONCASEINMEDIUMANDENZYMEACTIVITYWERE21MM,6157U/MLKEYWORDSLACTOBACILLIPROTEASEISOLATED1引言乳酸菌（LACTICACIDBACTERIA,LAB指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称1。目前至少可分为18个属，共有200多种2。许多乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中，对人和动物的健康是有益的3。乳酸菌的益生作用主要体现在以下六方面41、排除致病菌、维持
27、宿主肠道菌相平衡。2、营养价值。乳酸菌有利于维他命K、维他命B的吸收，同时也可促进钙及其它营养的消化吸收预防骨质疏松症。3、改善乳糖不耐症。乳酸菌所含的酶系统可弥补乳糖不耐症患者宿主产生乳糖分解酶不足的缺陷，利用乳酸菌产生的乳糖分解酶活性，将肠内乳糖代谢分解。4、减少血液胆固醇堆积。5、抑制癌症。食用乳酸菌或肠内有足够的乳酸菌存在时，可减低人类粪便中的某些菌体产生的酥活性如NITROREDUCTASE、AZOREDUCTASE及GLUCURONIDASE等致癌酶的活性。6、刺激免疫反应，增加宿主抵抗能力。乳酸菌细胞壁含有某些抗原成分可诱发活化、增加巨噬细胞及淋巴细胞而强化免疫球蛋白AIGA的浓
28、度，并产生R干扰素以刺激宿主免疫系统抑制肿瘤或者使寄主产生免疫抗体以抑制病菌吸附黏膜表面。目前关于乳酸菌的研究报道虽然已经很多57，但关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，其中关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。现今，由于乳酸菌具有营养作用、食疗功效、医疗保健功能和安全性它在现今社会已得到了广泛的研究和开发8。乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的主要指标9。因此对它的研究具有十分的必要性和迫切性。乳酸菌蛋白酶的主要作用10第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳使生成的乳酸，
29、增加胃内酸度从而提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌开发利用的重要指标。通过对产蛋白酶乳酸菌的筛选可以在乳酸菌开发利用过程中更利于筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种；产蛋白酶乳酸菌的筛选也可以为蛋白酶的生产提供依据11；产蛋白酶乳酸菌的筛选还可以为饲料的生产提供依据12。总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。我国现在正处于经济和社会发展的黄金时期，随着经济和社会的不断发展人们对生活质量的要求也在
30、不断提高。乳酸菌作为一种具有营养作用、食疗功效、医疗保健功能和安全性的菌种在未来必定具有广阔的发展前景。产蛋白酶能力作为乳酸菌的一项评判重要指标，对于乳酸菌的选择和利用具有重要的指导作用。目前，有关乳酸菌产蛋白酶能力的研究还很少产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及所有乳酸菌，所以产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还具有十分重要的理论和实际意义。总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选工作无论在实际生产还是在理论研究中都具有重大意义，该项工作具有广阔的发展前景。本实验以泡菜、鲳鱼、酸奶为原料通过分离筛选乳酸菌和产蛋白酶能力测定两步，从而筛选出其中产蛋白酶能力最强的一株乳酸菌。以期对乳酸菌产蛋白能力的研究和乳酸菌相关行业的
31、进一步发展提供一定的帮助。2材料与方法21材料泡菜普通购于宁波大学农贸市场鲈鱼普通购于宁波大学农贸市场美丽健鲜可益生菌酸奶普通淮南益益营养食品科技有限公司22试剂蒸馏水二级宁波大学无水乙醇分析纯东莞市中冠宏升化工有限公司溴麝香草酚蓝分析纯研域上海化学试剂有限公司过氧化氢分析纯上海哈勃化学技术有限公司福林试剂分析纯上海荔达生物科技有限公司酪蛋白分析纯北京拜尔迪生物技术公司碳酸钠分析纯上海同森化工有限公司碘分析纯明泰国际石化集团华东分公司结晶紫分析纯潍坊浩鑫精细化工有限公司草酸铵分析纯国药集团化学试剂有限公司番红分析纯上海倍翔生物科技有限公司三氯乙酸分析纯南通林港化工有限公司草酸铵结晶紫染液将结晶
32、紫在研钵中研细，逐渐加入95乙醇，继续研磨使之溶解，制成A液；将草酸铵溶于蒸馏水中，制成B液。混和A、B，静置48H，过滤备用。鲁格尔氏碘液将碘化钾溶于35ML蒸馏水中，然后将碘溶于碘化钾溶液，再加足水分即成。配成后储存于棕色瓶中备用，如变为浅黄则不可用。番红复染液25G番红溶于100ML95的乙醇。04MOL/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠（NA2CO3）424G，定容至1000ML。04MOL/L三氯乙酸（TCA）溶液称取三氯乙酸（CCL3COOH）654G，定容至1000ML。2酪蛋白溶液准确称取干酪素2G，称准至0002G，加入01MOL/L氢氧化钠10ML，在水浴中加热使溶解（必要时用小
33、火加热煮沸），然后用PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。100G/ML酪氨酸溶液称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸01000G，逐步加入6ML1MOL/L的盐酸使溶解，用02MOL/L盐酸定容至100ML，其浓度为1000G/ML，再吸取浓度为1000G/ML的酪氨酸溶液10ML，以02MOL/L盐酸定容至100ML，即配成100G/ML的酪氨酸溶液。该溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。22培养基MRS培养基13蛋白胨L0G，牛肉膏L0G，酵母浸膏5G，K2HPO42G，柠檬酸二铵2G，无水乙酸钠5G
34、，葡萄糖20G，吐温801ML，MGS047H2O058G，MNS044H20025G，蒸馏水1000ML，琼脂20G，调PH6264，121灭菌2030MIN。液体MRS培养基不添加琼脂其他成分同上。酪蛋白培养基14酪蛋白10G，牛肉膏3G，磷酸氢二钠2G，氯化钠5G，琼脂15G，蒸馏水1000ML，04溴麝香草酚蓝溶液125ML。将指示剂以外各成分混合，加热溶解，校正PH，加入指示剂，分装三角瓶，01MPA灭20MIN。保藏培养基葡萄糖15G，酵母膏10G，CACO315G，琼脂15G，蒸馏水1000ML，PH626423主要仪器与设备电热恒温水浴锅DK8D型上海一恒科技有限公司烘箱CS1
35、011AB重庆银河试验仪器有限公司PH测量仪DELTA320梅特勒托利多仪器（上海）有限公司分光光度计T6新锐北京普析通用仪器有限责任公司分析天平JD型余姚市金诺天平仪器有限公司电子天平PL403余姚市金诺天平仪器有限公司电脑恒温层析柜CXG1上海沪西分析仪器厂有限公司立式高压灭菌锅LDZX50KB上海申安医疗器械厂实验室膜分离设备LNGNF101上海朗极化工科技有限公司热风恒温鼓风干燥箱DHG9108A箱上海精宏试验设备有限公司玻璃仪器气流烘干器C型郑州杜甫仪器厂组合式恒温震荡培养箱QHZ12A上海沪西分析仪器厂有限公司湘仪离心机HR2500R2上海化工机械厂有限公司24其他器材试管、锥形瓶
36、、比色杯、培养皿、试管架、剪刀、移液管、镊子、塞子、量筒、保鲜膜、洗耳球等。25方法251乳杆菌初步筛选鲈鱼前处理15在无菌条件下对试验用鲈鱼进行活体解剖，剪下肠道，挤出肠道内容物，然后将肠道分成2个部分，即约4CM长的中肠段和幽门盲囊部。每一部分用无菌注射器将灭菌的生理盐水溶液注入并冲洗3次，分别放入玻璃匀浆器中，各加1ML灭菌的生理盐水溶液后匀浆。分别将宁波大学农贸市场所购泡菜，经前处理得到的鲈鱼匀浆，美丽健鲜可益生菌酸奶置于3个10ML的烧杯中并标号1、2、3。样品稀释16在超净工作台内将样品1、2、3分别用量程为200L的带有灭过菌枪头的移液枪取100L移入到盛有900L无菌生理盐水的
37、离心管中，充分震匀混和均匀，即为101的样品稀释液。另取100L101的样品稀释液，移入到盛有900L的无菌生理盐水的离心管中，充分震匀混和均匀，即为102的样品稀释液，反复上述操作，分别稀释得到101、102107、108稀释度。平板分离培养将配置好的24个MRS琼脂培养基平板底部用记号笔分别标注好样品种类与稀释度，每种样品取104到108稀释度进行涂布，每个稀释度做两组两个做平行试验。涂布实验时，用量程为200L的带有灭过菌枪头的移液枪取100L的样品稀释液对号放入已写好稀释度的平板的中央位置，用无菌玻璃涂布棒，在培养基表面轻轻涂布均匀，使稀释液均匀分布于培养及表面，然后在室温下静止510
38、MIN。涂布时应注意，将菌液沿一条直线轻轻来回推动，使之分布均匀，然后改变90沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向有涂布棒在涂布几次。将涂布好的MRS培养基采用朱缸法培养于37的恒温箱中培养48H。观察菌落特征、纯化培养17待MRS培养基中菌落形成后，挑选白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、凸起的特征菌落，用无菌接种环划线接种培养于MRS琼脂培养基中进行3次传代培养。然后，将传代培养菌种在显微镜下观察是否已经完全纯化。如果未达到完全纯化则继续划线培养。H2O2酶试验18将浓度为30的H2O2稀释十倍制备3的过氧化氢溶液。取洁净的载玻片置于超净工作台中，用无菌吸管吸取一滴浓度为3的过氧化
39、氢溶液置于载玻片中央，把接种环在酒精灯火焰上灭菌后，用接种环挑取一环纯化后的菌落放于3的过氧化氢溶液中。观察有无气泡产生，不产气泡的为阴性，产生气泡的为阳性。挑取阴性菌株。革兰氏染色19取活跃生长菌种制片。滴加草酸铵结晶紫染色液于涂菌部位，染色12MIN后倾去染液，水洗至流出水无色，然后用卢氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖涂菌部位1MIN，倾去碘液，水洗至流出水无色。用吸水纸吸取玻片上残留水，在白色背景下用滴管流加95乙醇脱色直到流出液无色立即用水洗去乙醇。用吸水纸吸取玻片上残留水，用番红复染液染色2MIN，水洗，洗去残水晾干。在显微镜下进行镜检，红色为阴性，紫色为阳性。挑选革兰氏染色阳性菌株
40、为乳酸菌。252筛选产蛋白酶的乳酸菌乳酸菌增殖培养配置MRS液体培养基，待MRS液体培养基冷却后，在超净工作台中用灭菌后的牙签蘸取实验分离得到的乳酸菌菌种接种培养于液体MRS培养基中，在摇床中37条件下，培养24H。酪蛋白琼脂培养基配置酪蛋白培养基成分为酪蛋白10G、牛肉膏3G、磷酸氢二钠2G、氯化钠5G、琼脂15G、蒸馏水1000ML、04溴麝香草酚蓝溶液125ML。先将指示剂以外各成分混合，加热溶解，校正PH，加入指示剂，分装三角瓶，01MPA灭菌20MIN，倒平板。如酪蛋白琼脂培养基上生长的菌落周围有透明圈形成，则说明该菌株具有水解酪蛋白的能力。产蛋白乳酸菌筛选20用量程为200L的带有
41、灭过菌枪头的移液枪取100L培养乳酸菌24H的MRS培养液对号放入已写好稀释度的平板的中央位置，用无菌玻璃涂布棒，在培养基表面轻轻涂布均匀，使稀释液均匀分布于培养及表面，然后在室温下静止510MIN。将涂布好的酪蛋白琼脂基倒置培养与37的恒温箱中培养48H。若菌落周围有透明圈形成，说明有产蛋白酶能力。透明圈直径大小与乳酸菌产蛋白酶活力呈正相关关系。253蛋白酶活力测定采用SB/T103171999福林法21测定乳酸菌的蛋白酶活力。标准曲线绘制按下表1配置不同浓度酪氨酸溶液表1酪氨酸标准液浓度TABLE1THESTANDARDCONCENTRATIONOFTYROSINE试剂管号123456蒸馏
42、水（ML）1086420100微克/毫升酪氨酸（ML）0246810酪氨酸浓度（微克/毫升）020406080100取6支试管标号16，分别按下表滴加不同浓度的酪氨酸1ML，04MOL/L的碳酸钠5ML，再各加1ML已稀释的福林试剂。摇匀置于水浴锅中，40保温发色20MIN用分光光度计在660NM波长下测定吸光度。每个样品测三次取平均值。将16号所得吸光值减去1号所得之即为净OD值。具体试剂添加情况见表2。以酪氨酸浓度为横坐标，以净OD值为纵坐标，绘制标准曲线。将得到的多种乳酸菌在MRS培养基中进行增殖培养37当每种菌株生长达到稳定期的时候，离心培养液，取上清进行蛋白酶活力的测定。稀释酶液将离
43、心后的上清液用PH值为68的酸性缓冲液稀释50倍。样品测定取三支试管编号1、2、3，每个试管加稀释液1ML，置于40条件下水浴2MIN，然后加经相同预热条件处理的酪蛋白1ML，精确保温10MIN。然后再各加入04MOL/L三氯乙酸2ML终止反应，继续保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后过滤。另取三支试管编号1、2、3，各加入滤液1ML，04MOL/L的碳酸钠5ML，已稀释福林试剂1ML，摇匀，保温发色20MIN后测OD值。表2标准曲线试剂添加表格TABLE2MEASUREMENTTHEODOFSTANDARDCURVE试剂管号123456按表1制备不同浓度酪氨酸（ML）11111104MOL/L
44、的碳酸钠（ML）555555福林试剂（ML）111111OD值123平均净OD值空白试验测定方法同上，只是在加酪蛋白前加04MOL/L三氯乙酸2ML，使酶失活，再加酪蛋白。具体见表3、表4表3实验组与空白组试剂添加情况TABLE3THEREAGENTSADDEDCONDITIONSOFEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUP试剂管号试剂管号123123预热酶液（ML）111预热酶液（ML）111预热2酪蛋白（ML）11104MOL/L三氯乙酸（ML）222作用10MIN作用10MIN04MOL/L三氯乙酸（ML）222预热2酪蛋白（ML）111表4测量OD值TABLE4
45、MEASUREODVALUES试剂管号123123滤液（ML）11111104MOL/L的碳酸钠（ML）555555福林试剂（ML）111111OD值平均OD值净OD值254计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基ODK4/10N式中OD净OD值；K净OD值为1时，酪氨酸浓度；44毫升反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN。3结果与讨论31乳酸菌的筛选通过菌落特征、细菌形态特征、H2O2酶试验、革兰氏染色试验的筛选，从泡菜、鲈鱼、美丽健鲜可益生菌酸奶中共筛选分离得到了17株乳酸菌，其中大部分乳酸菌为短杆菌，还有少数杆
46、菌和链球菌具体情况见表5、6、7。表5泡菜中分离筛选乳酸菌TABLE5ISOLATEDLACTICACIDBACTERIAFORMKIMCHI菌株编号SA1SA2SA3SA4SA5SA6菌落特征形态特征H2O2酶试验革兰氏染色乳白色白色乳白色淡黄色乳白色乳白色短杆菌短杆菌杆菌短杆菌短杆杆菌阴性阴性阴性阴性阴性阴性紫紫紫紫紫紫表6鲈鱼中分离筛选乳酸菌TABLE6ISOLATEDLACTICACIDBACTERIAFORMPERCHINTESTINAL菌株编号SB1SB2SB3SB4SB5菌落特征形态特征H2O2酶试验革兰氏染色白色乳白色乳白色乳白色灰白色短杆菌短杆菌杆菌短杆菌杆菌阴性阴性阴性阴性
47、阴性紫紫紫紫紫菌株编号SB6SB7菌落特征形态特征H2O2酶试验革兰氏染色乳白色乳白色杆菌短杆菌阴性阴性紫紫表7美丽健鲜可益生菌酸奶中分离筛选乳酸菌TABLE7ISOLATEDLACTICACIDBACTERIAFORMPROBIOTICYOGURT菌株编号SC1SC2SC3SC4菌落特征形态特征H2O2酶试验革兰氏染色乳白色乳白色灰白色乳白色杆菌链球菌短杆菌短杆菌阴性阴性阴性阴性紫紫紫紫32产蛋白酶乳酸菌的初筛将分离筛选所的乳酸菌涂布于酪蛋白培养基上在恒温箱中37条件下培养48H。酪蛋白培养基培养筛选结果显示，共有十株乳酸菌可产生明显溶蛋白圈。它们标号分别为SA1、SA2、SA5、SA6、S
48、B1、SB3、SB5、SB6、SC1、SC2。其中泡菜中分离得到的乳酸菌SA1产生的溶蛋白圈直径最大（21MM）。具体溶蛋白圈直径见表8。酪蛋白培养基初选产蛋白酶乳酸菌时注意在培养过程中，酪蛋白琼脂平板培养基在培养乳酸菌之前都是透明的，当培养乳酸菌一段时间后，培养基变为乳白色，这说明乳酸菌所产生的乳酸将培养基中的酪蛋白变性，导致培养乳酸菌后平板培养基呈现乳白色。若某乳酸菌产生蛋白酶，则蛋白酶会将此乳酸菌周围的酪蛋白水解，导致其周围有透明圈的出现，从而初步筛选出产蛋白酶的乳酸菌种。初筛结果显示，十七株乳酸菌中有10菌乳酸菌具有较强的产蛋白酶能力，其中产蛋白酶能力从强到弱依次为SA1、SA2、SB
49、1、SA6、SB3、SC2、SA5、SB5、SC1、SB6。表8乳酸菌产生的溶蛋白圈直径TABLE8CIRCLEDIAMETEROFSOLUBLEPROTEIN菌株编号溶蛋白圈直径，MMSA1SA2SA5SA6SB1SB3SB5SB6SC1SC2211791516118461033福林法测定蛋白酶活力331标准曲线绘制测定不同浓度条件下1ML酪氨酸溶液，在添加04MOL/L的碳酸钠5ML，已稀释的福林试剂1ML，摇匀置于水浴锅中，40保温发色20MIN处理后在660NM条件下的OD值。根据测得的OD值，以酪氨酸浓度为横坐标，测得OD值为纵坐标，制作标准曲线。测量OD值见表9，标准曲线见图1。表9不同浓度酪氨酸溶液OD值TABLE9THEODVALUESOFDIFFERENTCONCENTRATIONSOFTYROSINESOLUTION试管号123456酪氨酸最终浓度（微克/毫升）净OD值020406080100001470303043205760711图1酪氨酸标准曲线FIGURE1TYROSINESOLUTIONINTHE660NMABSORBANCEOFTHESTANDARDCURVEOFFICE332乳酸菌菌株蛋白酶活力测定根据各乳酸菌菌种在酪蛋白培养基上产
