1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化一、选题的背景与意义胶原蛋白，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白。由于胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而其被广泛的应用于化工、食品、医学、生物材料以及农业等诸多领域。因此，胶原蛋白的提取一直是研究的热点。目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。相对于我国，其在胶原蛋白的基础研究上已经具有一些优势并拥有一定的国际专利，而且部分已经投入市场，形成一定的市场规模。而我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。但就目前的消费趋势来看，我国
2、胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有丰富胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低。这样既浪费资源又污染环境，利用这些废弃物生成胶原蛋白实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。本实验的以牛肉制品的下脚料牛皮为原料，利用酶解法提取胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、对牛皮成分的测定主要测其水分、脂肪、粗蛋白、胶原蛋白等。2、酶制剂的选择和复合选择两种胶原蛋白提取率比较高的酶，然后按一定比例进行
3、复合试验。3、研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响通过对加酶量、水解PH、水解温度、水解时间、固液比等因素进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验得出优化的工艺条件。拟解决的问题1、如何选择合适的比例对两种单酶进行复合。2、如何提高胶原蛋白的提取率。三、研究的方法与技术路线研究的方法1、牛皮成分测定水分测定采用直接干燥法；脂肪测定采用索式提取法；蛋白质测定采用凯式定氮法；胶原蛋白的含量测定采用羟脯氨酸法2、酶制剂的酶活力测定采用福林酚法。3、胶原蛋白的提取预处理去脂采用丙酮法，去除其他非胶原成分采用5的NACL。胶原蛋白测定采用羟脯氨酸测定法。4、条件优化方面采用单因素实验法和正交实验法技术
4、路线牛皮预处理酶提测定四、研究的总体安排与进度1、2010年10月至2011年12月实验前的准备工作；查阅相关的文献，完成开题报告、任务书及文献综述。2、2011年1月至2011年4月实验研究阶段。对牛皮成分的测定酶制剂的选择和复合研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响3、2011年4月至2011年5月整理实验阶段，并完成毕业论文。五、主要参考文献1廖艳阳胶原蛋白的研究进展J长沙大学学报,2009,23536382KHARAGPURFISHCOLLAGENAPOTENTIALMATERIALFORBIOMEDICALAPPLICATIONJIEEE,2010,34383王丽珍、黄素珍胶原蛋白的
5、研究进展J肉类研究,2010,13116224郭文宇、代敏、杨丽红等水生动物与陆生动物皮胶原特性及应用前景J中国皮革,2007,361755575郭恒斌、曾庆祝水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用J农产食品科技,2007,1346506郭玉华、刘扬瑞、李钰金鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J中国食品添加剂,2010,31751797肖高、施亦东、陈衍夏胶原蛋白的提取及其对纺织材料的改性研究J丝绸,2010,2598胡立新、程骄、占稳等鱼下角料中胶原蛋白的提取及应用J化学与生物工程,2009,262799金桂芬、裘俊红海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究J浙江化工,2008,39751010周玉惠
6、、页正涛、肖立芳等猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征J湖北大学学报,2008,30328728911王川、李燕、马志英等几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究J食品科学,2007,28120120512肖世佳、但年华、曾睿等从动物皮中提取胶原蛋白的方法J西部皮革,2009,3115172113刘霞鱼鳍和鱼鳞中胶原蛋白的提取J湖南农机,2008,314614714吴缇、陈舜胜鱼皮胶原蛋白的制备及性能研究J内陆水产,2008,9343715钟朝辉、李春美、顾海峰等草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的提取及基本特性J水产科学,2007,263919416陈小娥、方旭波、钟秋琴安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺J食品工业科
7、技,2007,28313113317王晨、吴晖、李晓凤等胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究J现代食品科技,2008,24121300130318DEFULI,CHANGDAOMU,SUMEICAIEATULTRASONICIRRADIATIONINTHEENZYMAYICEXTRACTIONOFCOLLAGENJULTRASONICSSONOCHEMISTRY,2007,1660560919卢晓林胶原蛋白在医学中的应用研究现状J口腔医学研究,2009,15680680820CHIHLEEANUJSINGLA,YUGYUNGLEEBIOMEDICALAPPLICATIONOFCOLLAGEN
8、JINTERNETOFPHARMACEUTIC,2001,22112221王丹胶原蛋白在食品工业中的应用J农产食品科技,2009,3248505422李兴武、章黎黎胶原蛋白的改性研究及在食品工业中的应用J肉类研究,2009,11808423曹荣安、李浩、李良玉胶原蛋白的生理功能特性及其应用J肉类工业,2010,3457924苏媛媛、刘飞宏鱼鳞中胶原蛋白的利用价值J企业技术开发,200915425王志杰、彭立新胶原蛋白的提取及其配吵纸张的物理性能J纸和造纸,2006,255353626王元荪从牛制革废皮边角料中提取未变性天然胶原J明胶科学与技术,2008,28312512827张莹、魏玉娟废革屑
9、提取胶原蛋白的研究J中国皮革,2008,3753640毕业论文文献综述食品质量与安全酶解法提取胶原蛋白的研究进展摘要胶原蛋白是一种重要的功能性多糖蛋白质。因具有良好的物理性能和生物学特性在医学、食品、美容保健等许多领域有着广泛的应用。因此胶原蛋白的提取一直是研究的热点。而酶提取法是目前比较理想的手段。本文介绍了酶提取法相较其他几种提取法的优点，并阐述了酶提取法的工艺流程以及在工艺条件上的研究，最后指出了目前胶原蛋白的应用状况。关键词胶原蛋白；提取；酶解法；应用前景RESEARCHPROGRESSABOUTTHEENZYMATICEXTRACTIONOFCOLLAGENABSTRACTCOLLA
10、GENPROTEINISAKINDOFIMPORTANTFUNCTIONALPOLYSACCHARIDEPROTEINDUETOITSFAVORABLEPHYSICALANDBIOLOGICALCHARACTERISTICS,COLLAGENHASAWIDERANGEOFAPPLICATIONSINMANYAREASTHEREFORETHECOLLAGENEXTRACTIONHASBEENTHERESEARCHFOCUSANDENZYMEEXTRACTIONISTHERELATIVELYIDEALMEANSTHISESSAYEXPOUNDSTHEADVANTAGESOFENZYMATICEXT
11、RACTIONOFCOLLAGECOMPAREDWITHOTHEREXTRACTIONMETHODSTHENINTRODUCESTHEENZYMATICEXTRACTIONPROCESSANDTHERESEARCHINTHETECHNOLOGICALCONDITIONSFINALLY,ITPOINTSOUTTHEAPPLICATIONPROSPECTSOFCOLLAGENKEYWORDCOLLAGENEXTRACTIONENZYMATICEXTRACTIONAPPLICATIONPROSPECTS1前言胶原蛋白是哺乳动物内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质，占人体内蛋白质总量的2530，相当于体重
12、的6。胶原蛋白是一种重要的功能性多糖蛋白质，与细胞再生、分化、运动、免疫、关节润滑、血压抑制、伤口愈合、衰老及疾病等有极其密切的关系。同时由于胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并具有低免疫原性和良好的生物相容性。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。其应用领域涉及医药、化妆品、食品等多个分支13。从19世纪40年代，OREKJOVICH等应用枸椽酸缓冲液从大鼠皮肤中溶解出与角蛋白、弹性蛋白同类的不溶性蛋白胶原蛋白，翻开了胶原研究的篇章4以来到现在，对胶原蛋白的研究不断增多。而胶原蛋白的提取一直是研究的热点。2胶原蛋白的提取方法研究
13、21提取方法的比较胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。迄今为止，依据提取介质的不同，胶原蛋白的提取方法可分为五类，即热水浸提法、酸法、碱法、盐法以及酶法等5。热水提取法是原料经过各种预处理后，在一定条件下用热水抽提而得到水溶性胶原蛋白的方法。此法提取率高，但是所得的胶原蛋白已经不具有胶原蛋白的三螺旋空间结构。酸法提取主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐碱和希夫碱，而引起纤维膨胀、溶解。酸法提取比较迅速而且彻底，但色氨酸全部被破坏，且产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。碱法提取是用碱溶液预处理后的材料，从而达到提
14、取胶原蛋白的目的。碱法提取也较迅速彻底，但是含羟基和硫基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用，很难保留胶原蛋白的三股螺旋结构。因此，现代工业一般不采用此种方法。盐法是利用各种不同的盐在不同的浓度下提取盐溶性胶原蛋白的方法。但是其溶解和分级受中性盐效应影响。有的盐可以维持胶原蛋白的稳定性，而有的则可降低其构象稳定性，从而对提取天然胶原蛋白很不利。酶法提取是利用各种不同的酶主要是各种蛋白酶在一定的外界环境条件下提取胶原蛋白。由于胶原蛋白的三股螺旋结构对胃蛋白酶具有相当的稳定性。因此酶提取法对胶原蛋白破坏性小，能更好更完全地得到活性蛋白，同时其具有较高的回收率，无环境污染，。利用该方法提取胶原蛋白不仅
15、能满足一些领域对胶原蛋白结构的特殊要求，而且符合当今生态化提取胶原蛋白的要求68。金桂芬等人9对于海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究中，发现采用酸法和酶法分别提取胶原蛋白，发现酶法提取可获得较高含量的胶原蛋白，并且胶原蛋白的纯度较高。周玉慧10等人采用较简单的酶法从猪皮中提取胶原蛋白，通过SDSPAGE凝胶电泳、紫外光谱定性分析表明胶原蛋白具有完整的三螺旋结构，即具有生物活性。如今生物技术水平不断地提高，酶制剂来源广泛，活性不断提高，价效比也大幅度地降低，在酶法提取胶原蛋白显示了其他方法无法比拟的优越性。因此，目前用酶法提取胶原蛋白是比较理想的手段。22酶的选择能用于提取胶原蛋白的酶有很多。按照来
16、源上可以分为植物蛋白酶（如菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶等）、动物蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）、微生物蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶等）。根据酶的性质，又可以分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶及碱性蛋白酶。由于各种酶之间存在差异性，单用一种酶往往会存在一些不足。王川等人11用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶三种酶从猪皮中提取胶原蛋白的研究中发现，胰酶得率最高，可操作性强，但相对其他两种结构破坏较严重；胃蛋白酶的结构保持了最大的完整性，分子量在10万DA左右。但得率是三种酶中最低的。木瓜蛋白酶的得率和结构都介于两者之间9。因此在实际操作中，大多数采用复合酶来提取胶原蛋白。3酶法提取胶原蛋白的工艺条件研究31
17、酶法提取胶原蛋白的工艺流程酶法提取胶原蛋白的一般工艺为预处理酶解盐析透析冷冻干燥12。预处理一般是除去皮源中不同杂志，如钙物质、脂肪等，以便后续操作，得到更多更纯的胶原蛋白。酶解过程主要是在预处理的原料中加入酶制剂等，在一定的反应条件，酶解一定时间的，将原料中胶原蛋白提取的过程。在这个过程中，由于原料的性质不同或者所选用的酶特性，可能在加入酶制剂的同时在加入其它的辅助试剂，例如采用胃蛋白酶做为酶制剂中，需要加入酸性介质，一般采用加入乙酸。刘霞13对鱼鳍和鱼鳞中胶原蛋白的提取中，采用柠檬酸做为介质，并与乙酸做比较，发现柠檬酸的提取效果更好。而后面的几个步骤主要是对胶原蛋白进行分析、纯化和保存。一
18、般是通过加氯化钠进行盐析，然后用将得到的蛋白液移入透析袋进行透析，最后对得到的胶原蛋白进行冷冻干燥进行保存。在这个过程也包括一些过滤、离心、溶解等过程。32酶法提取胶原蛋白的工艺条件采用酶法提取胶原蛋白时，必须严格控制提取条件。影响酶提取法的因素很多，主要包括酶的用量、水解PH、水解时间、水解温度等8。例如水解温度对胶原蛋白的影响12，14。目前国内采用酶法提取胶原蛋白时的水解温度基本在50以上或4以下，而胶原蛋白在3738以上就会变性，生产明胶11。钟朝辉15等人在研究草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的提取及基本特性中发现用DSC测定草鱼鱼鳞PSC冷冻干品的变性温度时，PSC在371时存在吸热峰，表明
19、此时胶原蛋白结构被破坏而发生变性。故较高温度下的提取物为变性胶原，其进一步应用受到限制。低温下虽然有助于胶原结构的完整，但酶解时间长12。而胶原的结构对于其在医学、保健等方面的应用有很大的影响，但在造纸工业以及制革工业等领域，胶原蛋白的结构对其影响相对较小。因此，温度的选择要根据胶原蛋白产品的最终用途相结合。同时又由于这些因素既是相辅相成，又是有主次的影响之分，所以在研究中需要总体考虑。也因为其的复杂性，对酶提法的工艺条件优化成为很多学者的研究对象。陈小娥等人16在对安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺研究中，进行了最佳酶处理条件的确定，主要是对最佳胃蛋白酶添加量、最佳料液比、最佳酶解时间、最佳酶解温
20、度的确定，通过单因素实验和正交实验最后得到安康鱼皮胶原蛋白的最佳处理条件为胃蛋白酶质量分数为1，料液比为110，酶解时间为6H，酶解温度为5，最后平均提取率为1101，纯度为965。王晨17等人以干鸡骨粉为原料，研究了用胃蛋白酶提取胶原蛋白的酶法提取工艺。得出的最佳酶解工艺为加酶量150U/G，PH值为17、37条件下处理120MIN,然后在固液比61的情况下用水抽提5H在上述条件下，提取率可达184。此外，一些研究者还通过添加在酶提取中加入其他的处理来提高胶原蛋白的提取率等。DEFULI等人18在研究超声波对酶提取提取胶原蛋白的影响中发现，利用超声波照射后，胶原蛋白的提取率明显提高，大约是未
21、进行超声波照射的124，而且缩短了提取的时间。4胶原蛋白的应用前景胶原蛋白由于无毒、无致畸、无突变性能，生物相容性好，并在体内可以降解成无毒天然产物，在医学领域应用前景关阔，目前主要作为凝血材料、组织工程材料、药物载体材料和充填材料等1920。同时胶原蛋白具有紧密的螺旋结构从而显示出很强的任性和强度，氨基酸组成又使其具有优良的成膜能力，在食品行业保健行业被广泛应用，主要作为功能保健食品、食品添加剂、食品包装以及涂层材料等2122。而且从动物皮重提取的胶原蛋白中还含有透明质酸、硫酸软骨等蛋白多糖，它们含有大量极性集团，是保湿因子，且有阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素的作用，故胶原蛋白有纯天然保湿、
22、美白、防皱、祛斑等作用，可广泛应用于美容、美肤、美发用品中23。另外由于胶原蛋白独特的宏观物理特性，用于相纸定片、纺织、造纸等领域7。2425。正由于胶原蛋白在各个领域的应用前景广阔，因而它对胶原蛋白的提取也提出了更高的要求。胶原蛋白的提取既要做到高产率、清洁化的生态化提取，也要最大程度上保留胶原蛋白的生物学性能。参考文献1廖艳阳胶原蛋白的研究进展J长沙大学学报,2009,23536382KHARAGPURFISHCOLLAGENAPOTENTIALMATERIALFORBIOMEDICALAPPLICATIONJIEEE,2010,34383王丽珍、黄素珍胶原蛋白的研究进展J肉类研究,201
23、0,13116224郭文宇、代敏、杨丽红等水生动物与陆生动物皮胶原特性及应用前景J中国皮革,2007,361755575郭恒斌、曾庆祝水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用J农产食品科技,2007,1346506郭玉华、刘扬瑞、李钰金鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J中国食品添加剂,2010,31751797肖高、施亦东、陈衍夏胶原蛋白的提取及其对纺织材料的改性研究J丝绸,2010,2598胡立新、程骄、占稳等鱼下角料中胶原蛋白的提取及应用J化学与生物工程,2009,262799金桂芬、裘俊红海蜇胶原蛋白优化提取条件的研究J浙江化工,2008,39751010周玉惠、页正涛、肖立芳等猪皮胶原
24、蛋白的提取及其结构表征J湖北大学学报,2008,30328728911王川、李燕、马志英等几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究J食品科学,2007,28120120512肖世佳、但年华、曾睿等从动物皮中提取胶原蛋白的方法J西部皮革,2009,3115172113刘霞鱼鳍和鱼鳞中胶原蛋白的提取J湖南农机,2008,314614714吴缇、陈舜胜鱼皮胶原蛋白的制备及性能研究J内陆水产,2008,9343715钟朝辉、李春美、顾海峰等草鱼鱼鳞酸溶性胶原蛋白的提取及基本特性J水产科学,2007,263919416陈小娥、方旭波、钟秋琴安康鱼皮中胶原蛋白的提取工艺J食品工业科技,2007,283131
25、13317王晨、吴晖、李晓凤等胃蛋白酶酶解提取鸡骨胶原蛋白工艺的研究J现代食品科技,2008,24121300130318DEFULI,CHANGDAOMU,SUMEICAIEATULTRASONICIRRADIATIONINTHEENZYMATICEXTRACTIONOFCOLLAGENJULTRASONICSSONOCHEMISTRY,2007,1660560919卢晓林胶原蛋白在医学中的应用研究现状J口腔医学研究,2009,15680680820CHIHLEEANUJSINGLA,YUGYUNGLEEBIOMEDICALAPPLICATIONOFCOLLAGENJINTERNETOFPH
26、ARMACEUTIC,2001,22112221王丹胶原蛋白在食品工业中的应用J农产食品科技,2009,3248505422李兴武、章黎黎胶原蛋白的改性研究及在食品工业中的应用J肉类研究,2009,11808423曹荣安、李浩、李良玉胶原蛋白的生理功能特性及其应用J肉类工业,2010,3457924苏媛媛、刘飞宏鱼鳞中胶原蛋白的利用价值J企业技术开发,200915425王志杰、彭立新胶原蛋白的提取及其配吵纸张的物理性能J纸和造纸,2006,2553536本科毕业设计（20_届）酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化目录0前言121材料与方法1311实验材料13111原料来源13112酶制剂13113
27、仪器与设备13114试剂1312测定方法13121酶活的测定13122牛皮中胶原蛋白含量的测定1413工艺流程1414操作要点14141原料预处理14142酶法提取牛皮胶原蛋白1515试验方法15151酶及提取介质的选择15152复合酶的复合比确定15153酶提取的单因素实验15154酶提取的最佳工艺条件正交实验162结果与分析1621牛皮中胶原蛋白含量的测定结果16211羟脯氨酸标准曲线的绘制16212牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果1722酶活测定结果1723酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响1724复合酶的不同复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响1925酶提取的单因素实验结果19251料液比
28、对牛皮胶原蛋白提取率的影响19252酶提时间对牛皮胶原蛋白提取率的影响20253酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响21254加酶量对牛皮胶原蛋白提取率的影响22255乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响2226酶提取的最佳工艺条件正交实验结果233结论24致谢错误未定义书签。参考文献24附录错误未定义书签。摘要胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而应用于化工、食品、医学等诸多领域。本文以牛肉制品的下脚料牛皮为原料，以胶原蛋白提取率作为指标，比较水和05MOL/L的乙酸溶液两种不同的介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，得出采用酸酶结合法更利于牛皮胶原蛋白的提取。此外，在酶的选择上通过比较试验，最
29、后选择复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）作为试验用酶。在此基础上，本实验又通过单因素试验和正交试验对牛皮酶解工艺条件进行了优化，实验结果表明酶提取的最优条件为以05MOL/L的乙酸溶液为提取介质，料液比（M/V）为125，酶提温度为42，酶提时间为8H，加酶量为3000U/G，牛皮胶原蛋白的提取率高达9056。关键词牛皮；酶解；胶原蛋白；复合酶ABSTRACTDUETOCOLLAGESMANYFAVORABLEPHYSICALANDBIOLOGICALCHARACTERISTICS,ITHASAWIDERANGEOFAPPLICATIONSINMANYAREASINTHISPAP
30、ER,FRESHCOWHIDEASRAWMATERIALANDTHEEXTRACTIONRTEOFCOLLAGENASINDEX,THEENZYMICEXTRACTMETHODCOMBINGWITHACETICACIDISCONSIDERERAWONDERFULMETHODANDGREATLYIMPROVESTHERATE,WHENCOMPARINGTHEENZYMICEXTRACTMETHODCOMBINGWITHWATERONTHECHOICEOFTHEENZYMES,THECOMPOUNDENZYMETHATTHEPEPSINANDTHEPAPAINARECOMPOUNDEDBY11PR
31、OPORTIONISREGARDEDASTHEENZYMEOFEXTRACTINGCOLLAGENTHROUGHTHESINGLEFACTOREXPERIMENTANDTHEORTHOGONALEXPERIMENT,THEOPTIMALCONDITIONSARECONFIRMEDEXPERIMENTALRESULTSSHOWTHATTHEOPTIMUMEXTRACTIONCONDITIONSAREOBTAINEDASFOLLOW05MOL/LACETICACIDASEXTRACTIONMEDIA,THERATIONOFMATERIALTOLIQUOR125,THEENZYMECONCENTRA
32、TIONFOR3000U/G,ANDEXTRACTIONAT42FOR8H,ANDTHEEXTRACTIONRATEOFCOLLAGENIS9056KEYWORDSCOWHIDEENZYMATICEXTRACTIONCOLLAGENTHECOMPOUNDENZYME0前言胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质1。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质。胶原蛋白在脊椎动物体内占蛋白质总量2530，占腱和骨骼的细胞外蛋白质总量90以上，其中动物皮中胶原蛋白含量达到50以上2。胶原蛋白是结缔组织极重要的结构蛋白质，是动物结缔组织中的骨、软骨、皮肤、腱、韧等的主要成分，对机体和脏
33、器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用34。胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的主要成分，分子量为300KU左右。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，其由3条链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构形成胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定5。结构决定性质，性质决定用途。正由于胶原蛋白独特的结构，使得胶原蛋白具有独特的生物学性能和重要的生理作用。胶原蛋白具有低免疫原性，生物相容性，可生物降解性等6，另外还具有止血，修复皮肤骨骼以及美容保健等作用7。胶原蛋白结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位，因而胶原蛋白产品具有良好的应用前景。如在生物
34、医学上，胶原蛋白具有能够自发将体外胶原蛋白组装成各种紧密结构的能力，因而是作为组织工程支架、医用敷料系统和药物输送工具的潜在材料89。同时，目前有学者还开始研究胶原蛋白的其他功能，如在去除自由基和降血压等10方面的研究。由于胶原蛋白的诸多优点，因此胶原蛋白的提取一直是研究的热点。胶原蛋白的提取方法通常有酸法、碱法、酶法以及酸、酶结合法和碱、酶结合法等方法1112。在几种胶原蛋白的提取方法中，酸法提取迅速而彻底，但是一些氨基酸会被破坏，如丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，同时提取率较低；碱法提取速度很快，但是胶原蛋白结构被破坏，产生消旋作用，同时含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏；酶法提取提取对胶原蛋白破坏
35、性小，能更好更完全地得到活性蛋白13。同时，随着生物技术水平的提高，酶制剂的来源广泛，活性也不断提高，价效比也大幅度降低，为其在工业化生产中的应用提供了极大空间，特别是蛋白酶制剂应用已不少见，并取得明显成效。因此，酶法提取胶原蛋白是胶原蛋白生产的一个方向14。但是，一般酶法的水解率不彻底，提取率一般较低，因而目前采用酸酶结合或者碱酶结合来提取胶原蛋白。同时，就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有富含胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头），但是其利用的附加值很低。利用这些废弃物生成胶原蛋白
36、，既实现资源的合理和有价值利用，又实现经济和社会效益的双赢。本实验以牛肉制品的下脚料牛皮为原料，采用酶解法提取牛皮中俄胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。1材料与方法11实验材料111原料来源新鲜牛皮宁波莱盛农业科技实业有限公司提供112酶制剂胃蛋白酶生化试剂AMRESCO木瓜蛋白酶生化试剂国药试剂113仪器与设备HWS26型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司DHG9140AS型电热鼓风干燥箱宁波江南仪器厂ACCULABALC2103电子天平ACCULAB公司T6新锐可见分光光度计北京普析通用有限责任公司RE522旋转蒸发仪上海沪西分析仪器厂PB1
37、0PH计德国SARTORIUS公司其他电冰箱，锥形瓶，试管，烧杯等。114试剂L羟脯氨酸生化级上海润成生物科技有限公司高氯酸分析纯国药试剂正丙醇分析纯国药试剂高氯酸分析纯国药试剂异丙醇分析纯国药试剂柠檬酸分析纯国药试剂乙酸钠分析纯国药试剂氯胺T分析纯国药试剂硫酸分析纯国药试剂对二甲基苯甲醛分析纯国药试剂其他为实验室常规试剂12测定方法121酶活的测定酶活力测定按照中华人民共和国专业标准SB/T103171999蛋白酶活力测定法测定。122牛皮中胶原蛋白含量的测定1221实验原理胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸，在胶原蛋白中含量固定，通常
38、为10左右。不同来源的生物胶原蛋白含量不同，因此换算系数也不同。例如，水生生物一般采用111，周爱梅等15在研究淡水鱼胶原蛋白提取优化工艺研究中就采用111作为换算系数。而郭恒斌、曾庆祝16在研究酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件中采用142作为换算系数。查阅相关的资料17，在本实验中决定取100作为牛皮中胶原蛋白的换算系数。胶原蛋白的含量按公式（11）计算牛皮中胶原蛋白的含量羟脯氨酸含量100（公式11）1222羟脯氨酸标准曲线的绘制按照GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定的方法绘制标准曲线，空白对照用蒸馏水替代，过程同前。1223样品处理与羟脯氨酸的测定准确称取4G牛皮原料
39、于锥形瓶中，量取30ML左右配置好的3MOL/L硫酸溶液加入锥形瓶中，用表面皿盖住，置于105干燥箱内水解16H。水解结束后用滤纸趁热将水解液过滤到250ML的容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度。按照GB/T9695232008测定稀释后的样品溶液中羟脯氨酸的浓度，样品中的提取出的羟脯氨酸含量计算按公式（12）计算WFCV103公式12式中C标准曲线上相应的羟脯氨酸浓度，G/ML；W提取出的羟脯氨酸含量，MG/G；V稀释后溶液的总体积，ML；M称取样品的质量，G；F稀释倍数。1224胶原蛋白提取率的测定将酶解后的溶液进行离心收集上清液，测定上清液体积，并从上清液中吸取50ML于锥形瓶中，分别加入5
40、0ML3MOL/L的硫酸并用表面皿盖住，放入105烘箱中水解16H，将水解液转移至100ML容量瓶定容至刻度；吸取50ML上述溶液定容至100ML。其余各步按GB/T9695232008测定其羟脯氨酸测定法操作18。提取率的计算公式为提取率（）溶液中羟脯氨酸的浓度体积稀释倍数/牛皮中羟脯氨酸的含量100（公式13）13工艺流程新鲜牛皮原料整理原料预处理酶法提取牛皮胶原蛋白胶原蛋白提取率测定14操作要点141原料预处理1411去脂肪在对原料进行酶解之前，一般需要对原料进行预处理。脱脂是预处理的一部分。提取胶原蛋白的过程中，需要尽可能的去除脂肪组织。因为在胶原蛋白中一旦有脂质的混入以后不管是进行中
41、性还是酸性溶解都很难把脂肪去除，最后得到乳浊状的胶原蛋白，最终影响产物的纯度19。查阅资料，通常使用的脱脂方法有有机溶剂浸泡脱脂16与碳酸钠浸泡脱脂。本实验采用6碳酸钠溶液浸泡脱脂20H。1412去杂蛋白在原料预处理中，除了要对原料去脂肪外，还需要对原料进行去杂蛋白。从查阅的资料15来看，在提取胶原蛋白过程中用得最多的除杂蛋白试剂是氯化钠溶液。本实验以5氯化钠溶液为去牛皮杂蛋白溶液，按115混合，室温下浸泡12小时除去盐溶性非胶原成分，再用清水冲洗牛皮数次去除残留氯化钠，沥干后捣碎备用。142酶法提取牛皮胶原蛋白将预处理好的碎牛皮置于某种提取介质，以一定的料液比进行混合，加入适量的酶，在适宜的
42、温度下酶提一定时间。酶提结束后，将酶解液离心收集上清液进行提取率的测定。15试验方法151酶及提取介质的选择将预处理的牛皮原料以相同的量称取三份，以水为介质，分别加入3000U/G的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合），以125的料液比，温度为37，提取8H后测定提取率。其中胃蛋白酶的PH调节为25。再以相同的量称取预处理的牛皮原料三份，以05MOL/L乙酸溶液为介质，分别加入加酶量为3000U/G的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合），以125的料液比，温度为37，提取8H后测定提取率。对这两组实验比较后，选择合适的提取
43、介质和酶。152复合酶的复合比确定将预处理的牛皮原料以相同的量称取三份，分别加入加酶量为3000U/G的复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）、复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按12酶活比例复合）、复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按21酶活比例复合），以105MOL/L乙酸溶液为介质，料液比为125，温度为37，提取8H后测定提取率，选择合适的复合比。153酶提取的单因素实验1531料液比的选择根据以上确定的05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，以及实验所得的复合酶作为试验用酶，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，在37下，加酶量为3000U/G，提取时间为8H,分别以115，120,12
44、5，130，135的料液比下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同料液比对牛皮胶原蛋白的提取率影响，选定最适的料液比。1532酶提时间的选择根据以上确定的料液比，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，在37下，加酶量为3000U/G,分别以4，6，8，10，12的酶提时间下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同酶提时间牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的浸提时间。1533酶提温度的选择根据以上确定的料液比和酶提时间，将预处理的牛皮原料以相同的量称取七份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，加酶量为3000U/G，分别以4，15，27，32，37,42,47的酶提温度
45、下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的浸提温度。1534复合酶添加量的选择根据以上确定的料液比、浸提时间和浸提温度下，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，分别以1000U/G、2000U/G、3000U/G、4000U/G、5000U/G的加酶量下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同的复合酶添加量对牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的加酶量。1535乙酸浓度的选择根据以上确定的料液比、浸提时间、浸提温度和加酶量下，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，分别以01MOL/L、03MOL/L、05MOL/L、07MOL/L
46、、09MOL/L的乙酸浓度下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同的乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的乙酸浓度。154酶提取的最佳工艺条件正交实验在单因素试验的基础上，以胶原蛋白的提取率为指标采用正交试验对提取工艺进行优化，其因素与水平见表11，按L934正交表进行正交试验。表11正交试验因素水平表TAB11THEFACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIMENT水平因素A酶提温度（）B酶提时间（H）加酶量（U/G）13762000242830003471040002结果与分析21牛皮中胶原蛋白含量的测定结果211羟脯氨酸标准曲线的绘制按照GB/T96952320
47、08肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定的方法，以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图21Y02014X0001R20999900102030405005115225羟脯氨酸浓度（UG/ML）AU558图21羟脯氨酸标准曲线FIG21THESTANDARDCURVESOFHYDROXYPROLINE如图21所示，羟脯氨酸标准样品的回归方程为Y02014X0001，Y为吸光度值，X为羟脯氨酸的浓度。羟脯氨酸浓度与光密度值几乎呈直线相关（R209999）。因此，由此标准回归方程计算羟脯氨酸浓度准确可靠。212牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果将牛皮按1223的方法处理后，于558NM处测定
48、其吸光值，从标准曲线上查出其相应的浓度，按照公式（22）计算出牛皮中羟脯氨酸的含量，结果见表21。从表21中可知，牛皮中羟脯氨酸含量的平均值为287。羟脯氨酸为胶原蛋白的特异氨基酸，根据公式（11）计算牛皮中胶原蛋白的含量。计算可得胶原蛋白的平均含量为287，占牛皮总质量的1/4以上。表21牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果TAB21THECONTENTOFHYDROXYPROLINEINCATTLESKIN编号样品质量（G）吸光值A558浓度C（UG/ML）含量（）14100375185728924260389192628333940367181828822酶活测定结果根据中华人民共和国专业标准S
49、B/T103171999蛋白酶活力测定法，实验测得所用胃蛋白酶的酶活力为378103U/G，木瓜蛋白酶的酶活力为663103U/MG。23酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响实验中分别采用水和05MOL/L乙酸溶液作为提取介质，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）三种酶作为试验酶，在加酶量为3000U/G，温度为37，提取时间为8H，料液比为125下提取牛皮中的胶原蛋白。提取结束后，按照143的方法测定牛皮中胶原蛋白的提取率，比较酶和提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，结果见图22。2245249113567831777670102030405060708090胃蛋白酶木瓜蛋白酶复合酶（木胃为11）酶种类胶原蛋白提取率（）水介质乙酸介质图22酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG22EFFECTOFENZYMEANDMEDIUMONEXTRACTIONOFCOLLAGEN不同的酶对牛皮酶解效果的影响很大。在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被用来提取动物组织中的胶原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶提取胶原蛋白的报道。本实验中选择了胃蛋白酶、木瓜蛋
