1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程抗氧化活性乳酸菌的筛选及其遗传稳定性研究一、选题的背景与意义氧化反应是许多生物产生能量的必要反应。然而，过多的氧化反应也会破坏生物大分子。尽管人类和其它生物具有的抗氧化防御系统能保护他们免于氧化损伤,但这些系统对于防止氧化损伤并不能完全有效地发挥其作用。近年来证实，抗氧化剂可以被用来帮助人体减少氧化损伤，但是,合成抗氧化剂对健康和长期效应等存在安全的问题。寻找天然的安全的抗氧化剂将成为研究热点。乳酸菌广泛应用于食品工业，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，增加食品贮藏期，而且具有特殊的营养价值和生理活性。大量研究表明，乳酸菌可以调节机体肠胃道正常菌群
2、，抑制肠道内腐败菌生长繁殖产物的产生，保持微生态平衡，促进免疫能力，还具有降低血脂胆固醇，抗肿瘤、防癌等功能，从而对机体的生理功能、免疫反应、肿瘤发生和衰老过程等产生全面的营养保健作用。因此，筛选具有抗氧化活性的乳酸菌具有很大的研究和应用价值。我国的发酵乳制品行业发展的十分迅速，但是由于在这方面的研究较少，还是出现了许多问题，例如我国保藏的发酵剂菌种大部分从国外的发酵剂中分离，对其在遗传中的稳定性并不了解，这方面的研究也甚少。要想真正发展我国的发酵乳制品行业，这个问题是需要被重视的。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题以20种实验室保藏菌种为来源，从中筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌，通过电泳的方
3、法，分析抗氧化活性乳酸菌全菌体蛋白在传代遗传过程中的表达差异，来判断其在遗传过程中的稳定性。1利用乳酸菌清除DPPH自由基和超氧自由基的试验，从中筛选出具有较好抗氧化活性的乳酸菌。2通过传代培养，提取全菌体蛋白，利用SDSPAGE电泳的方法，找出全菌体蛋白在遗传过程中的表达差异，进一步研究乳酸菌的遗传稳定性。三、研究的方法与技术路线技术路线研究方法抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌无细胞提取物的制备乳酸菌培养采用液体MARS培养基，37摇床培养箱中培养24H。取培养液300ML，在5000R/MIN下离心20分钟，去上清液去菌体，加入30MLPBS磷酸缓冲液，在5000R/MIN下离心20分钟，去上
4、清液去沉淀，再加入30ML的PBS磷酸缓冲液，在5000R/MIN下离心20分钟，去上清液，取沉淀，加去离子水30ML，经冰浴超声破碎细胞后，在4，12000R/MIN离心20MIN，收集上清液，即为无细胞提取物。乳酸菌清除自由基DPPH的能力测定取不同样品20ML，加入40ML（浓度为01MMOL/L）的DPPH乙醇溶液和10ML（浓度为50）的乙醇溶液，混合均匀后，在暗处反应40分钟，并在10000R/MIN下离心20MIN，弃沉淀取上清液，在517NM下测定吸光度AI。空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且空白组空白调零。清除率（AIAJ）/AI乳酸菌清除超氧自由基的能力测定取不同样品1
5、0ML，分别加入45ML（浓度为01MOL/L，PH为82）的TRISHCL溶液，10ML（浓度为1MMOL/L）的EDTA溶液，24ML的纯水和20ML（浓度为9MMOL/L）的邻苯三酚溶液，混合均匀，反应40MIN后，分别加入100L的HCL溶液（浓度为12MOL/L），并在10000R/MIN下离心20MIN，弃沉淀取上清液，在325NM下测定吸光度AI空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并且空白组空白调零。清除率（AIAJ）/AI抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养抗氧化活性乳酸菌的筛选乳酸菌清除自由基DPPH能力的测定乳酸菌清除超氧自由基的能力测定抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性传代培养菌
6、体蛋白的制备SDSPAGE电泳在200ML灭菌过的三角瓶中加入150MLMRS培养基，接种筛选出的具有抗氧化活性的乳酸菌15ML，即接种量为1，置于37的恒温培养箱中培养。培养24H后，取该发酵液15ML，接种到装有150MLMRS培养基的200ML灭菌过的三角瓶中（接种量为1），此为第1代，如此连续接种20天。菌体蛋白的制备分别取第1代、第5代、第10代、第15代和第20代的乳酸菌菌液适量，在4000R/MIN下离心20MIN，弃上清液，加PBS磷酸缓冲液清洗，在4000R/MIN下离心20MIN，弃上清液，反复清洗2次，在菌体沉淀中加入无菌水，制成悬菌液，用超声波破碎乳酸菌（用作时间10S
7、，间隔时间10S，破碎20分钟，破碎功率为400W），取破碎后的菌体，在4000R/MIN下离心20MIN，取上清液，即为菌体蛋白。SDSPAGE电泳（不连续电泳）将分离胶（由PH88的分离胶缓冲液配制）灌入两块玻璃板之间,放置约30MIN，待凝聚后将上层水去尽吸干，然后在分离胶上倒入浓缩胶（由PH68的分离胶缓冲液配制），灌满，稍后插入样品梳。待浓缩胶凝聚后，在上下贮槽中倒入电泳缓冲液，取出样品梳，用微量注射器吸取10L样品至凹形凝胶样品槽。开始电泳时，当样品在浓缩胶时的电压为120V，电流改为20MA，当样品进入分离胶后，电压改为180V，电流改为30MA。结束电泳后，将凝胶板放在培养皿内
8、，加固定液，作用10MIN后，倒去固定液，加入染色液，染色1H左右，用蒸馏水漂洗数次后，再用脱色液脱色，第一次脱色20MIN，第二次脱色2H，知道蛋白质区带清晰即可。四、研究的总体安排与进度主要内容进度专业知识建立2010年9月到2011年11月乳酸菌的生理功能乳酸菌的抗氧化作用实验步骤设计2010年11月到2011年2月筛选具有抗氧化活性乳酸菌研究抗氧化活性乳酸菌的遗传稳定性结果分析2011年2月到2011年3月完成论文2011年3月到2011年4月五、主要参考文献1杨洁彬,郭兴华乳酸菌生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社，19962赵保路氧自由基和天然抗氧化剂M北京科学出版社，19993
9、CHENHY,YENGCFREERADICALS,ANTIOXIDANTDEFENSESANDHUMANHEALTHJNUTRITIONSCIENCES,1988,2311051214金世琳乳酸菌的科学技术J中国乳品工业,1998,26214165施安辉,周波乳酸菌的分类、生理特性及在食品酿造工业上的应用J中国调味品,2001（11）386李成涛,吕嘉枥乳酸菌及其发酵制品的发展趋势J,中国酿造,20058577孟涛,郭兴华乳酸菌及生长因子对人畜健康的作用J生物工程展,1993,13448528国春艳乳酸菌的生理功能及在畜牧业中的应用J饲料工业,2006,27255579敬思群优质乳酸菌的应用J
10、中国乳业,20026182010赵红霞,詹勇,徐梓荣乳酸菌的研究及其应用J江西饲料,2003191211LINMY,YENCLANTIOXIDATIVEABILITYOFLACTICACIDBACTERIAJJAGRICFOODCHEM1999,471460146612RTEANPAISAN,JHINTAO,GDAHLENORALLACTOBACILLUSSPECIESINTYPE2DIABETICPATIENTSLIVINGINSOUTHERNTHAILANDJELSEVIER,2009,1516016313KAIZUH,SASAKIM,NAKAJIMAH,ETALEFFECTANTIOXI
11、DATIVELACTICACIDBACTERIAONRATSFEDADIETDEFICIENTINVITAMINEJDAIRYSCI,1993,462493249914孟和毕力格,周雨霞,张和平等酸马奶中乳杆菌GM21株的抗氧化活性作用研究J中国乳品工业,2005,339212415WANGYC,YURC,CHOUCCANTIOXIDATIVEACTIVITIESOFSOYBMILKFERMENTEDWITHLACTICACIDBACTERIAANDBIFIDOBACTERIAJFOODMICROBILOGY,2006,2312813516ANNUKH，SHCHEPETOVAJ，KULLISA
12、ART,ETALCHARACTERIZATIONOFINTESTINALLACTOBACILLIASPUTATIVEPROBIOTICCANDIDATESJAPPLMICROB,2003,440341217刘展鹏,欧仕益,包惠燕阿魏酸脂酶的研究与应用J食品研究与发展,2006,127516917118张凤敏,田丰伟,陈卫等具有氧化活性乳酸菌的筛选J中国乳品工业,2007,3524719张江巍,曹郁生,李海星等乳酸菌抗氧化活性及检测方法J中国乳品工业,2005,339535620韩少华,朱靖博,王妍妍邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的研究方法J中国酿造,2009（6）15515721彭长连，陈少微
13、，林植芳等用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能J生物化学与生物物理进展,2007,27665866122孙震,杨静秋抗氧化乳酸菌的筛选及其发酵条件J食品与机械,2009,252151923高艳丽,杨思文,樊凯奇等SDSPAGEA电泳技术分析蛋白质的研究J辽宁化工,2007,36746046324盖颖,王文棋,蒋湘宁一种改进的双色SDSPAGE凝胶和可视化上样电泳方法J北京林业大学学报,2006,28110310625张杉,陈敏,李辉SDSPAGE电泳测定乳清蛋白方法的研究J食品科技,2008,1215219毕业论文文献综述食品科学与工程乳酸菌抗氧化活性研究摘要乳酸菌是现在发酵食品生产过程
14、中使用最普遍的菌种，其具有提高食品风味和其营养价值；帮助食物代谢的消化吸收；降低血清中胆固醇的含量；增强机体的免疫功能等生理功效。大量研究表明，乳酸菌具有一定的抗氧化活性，能减少体内的自由基和抗氧化。本文介绍了乳酸菌的抗氧化活性及其作用机理，指出了我国乳酸菌资源的应用现状和前景。关键词乳酸菌自由基抗氧化作用机理正文1自由基与抗氧化11自由基与抗氧化自由基即游离基（FREERADICALS），是指那些独立存在的有一个或几个不配对电子的原子或基因1。自由基十分的活泼，其化学性质大部分处于不稳定状态，是生物体内许多反应的中间代谢产物。自由基的特点反应强；具有顺磁性；寿命短2。活性氧是指含有氧的自由基
15、，是生物体内主要的自由基，主要包括超氧阴离子自由基，羟自由基，过氧化氢自由基，脂氧自由基等。人体内的每个细胞每天都会受到自由基成千上万次的攻击。当体内的氧化增强系统与抗氧化系统之间的平衡倾向于抗氧化时，自由基对人体并无害处，它能清除入侵体内的细菌和化学物质等。但是当这个平衡倾向于氧化增强时，自由基的高度活性和极强的氧化能力，会使体内的大分子物质产生氧化变性，交联或断裂，进而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织的损伤和器官的病变，最后使生物体受到伤害或病变。12自由基对生物大分子的损伤35121自由基对蛋白质的损伤自由基可直接或通过脂质氧化物间接作用于蛋白质上，使蛋白质上的多肽链断链或个别氨基
16、酸发生变化，使蛋白质交联而发生聚合作用，从而导致蛋白质结构的变化，细胞功能的紊乱。有的自由基使蛋白质结构上的氨基酸发生氧化脱氨之类的反应。也有的自由基攻击酶蛋白，使其改变结构导致酶活力丧失。122自由基对核酸类物质的损伤自由基对核酸的损伤主要是对DNA的损伤。自由基的攻击会引起氨基或羟基的脱除、核糖的氧化和碱基与核糖连接键断裂等反应。有研究表明，DNA分子在受到自由基攻击时产生的产物可能与引起癌变有关。123自由基对脂质的损伤一些含有多个双键的多不饱和脂肪酸，由于其化学性质的活泼，极易受到自由基的攻击而发生氧化反应。细胞膜中含有磷脂，自由基的攻击会严重影响膜的生理功能，造成细胞功能的紊乱。同时
17、，脂质在受到自由基攻击后，产生氧化反应的二级代谢产物，如丙二醛，会导致遗传物质的损伤。124自由基对糖类的损伤自由基不仅会使核糖、脱氧核糖形成脱氢自由基，致使DNA中碱基的破坏和主链的断裂，也会使细胞膜寡糖链上的糖分子羟基经氧化聚合成双聚物或生成不饱和羰基，从而破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞发挥正常的免疫功能。2乳酸菌及其生理功效21乳酸菌的概述乳酸菌是现在发酵食品生产过程中使用最普遍的菌种，它是指一类能够发酵碳水化合物并且能产生大量乳酸的革兰氏阳性的球菌和杆菌的统称。乳酸菌具有过氧化酶为阴性、不形成芽孢、大多数不运动、消耗的葡萄糖有50以上产生乳酸、分解蛋白质不产生腐败产物。但对蛋白质和脂
18、肪的分解能力较弱的特点6。到目前为止，乳酸菌有发现至少22个属，这其中包括乳杆菌属、营养缺陷杆菌属、气球菌属、肉食杆菌属、链球菌属、乳球形菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、奇异菌属、酒球菌属、糖球菌属、魏斯氏菌和芽孢乳杆菌等7。乳酸菌广泛存在于大自然中，人类从古至今对乳酸菌的应用也十分普遍。古时，乳酸菌被应用在泡菜、腐乳的制作中，而现在乳酸菌广泛应用于发酵乳制品中，并且其应用领域在不断的拓宽，例如肉制品和酿造业等811。22乳酸菌的生理功效乳酸菌的生理功能与人体生命活动和人体健康紧密相关。乳酸菌的主要功能有以下5种添加到食品中，能提高食品风味和其营养价值，还可提高食品的附加功能，延长保存时
19、间；改善人体肠道内微生物菌群和肠道的调节功能，并且帮助食物代谢的消化吸收；控制体内毒素，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生；降低血清中胆固醇的含量，延缓机体的衰老；增强机体的免疫功能，预防和抑制肿瘤的发生1215。3乳酸菌的抗氧化活性及其可能机制许多实验表明，一些乳酸菌具有很好的抗氧化作用。31乳酸菌的抗氧化能力对于乳酸菌抗氧化活性的研究，主要可以分为三个方向利用物理或化学的方法在体外产生自由基，测定乳酸菌菌体或其无细胞提取清楚自由基的能力；用乳酸菌发酵液喂养动物做动物实验，利用其血液和肝脏匀浆的指标变化来判断乳酸菌的抗氧化活性；测定乳酸菌发酵的乳制品的抗氧化活性。311乳酸菌抗氧化活
20、性的体外实验LIN等16在研究报道中指出，在对包括嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和长双歧杆菌等在内的19株乳酸菌的无细胞提取物进行抗氧化实验，发现所有菌株对抗坏血酸的自动氧化都具有抑制作用，其抑制范围在712；在螯合金属离子的能力方面，1010个活乳酸菌的无细胞提取物能够螯合FE2的量在（25727）106MG/L，727106MG/L为嗜热链球菌821螯合FE2的量。在清除HO实验的中发现，1010个活乳酸菌的无细胞提取物清除HO能力相当于尿酸的量为05331MMOLL，其中最高的是嗜酸乳杆菌E。虽然这19株乳酸菌都具有还原能力，但均没有SOD酶的活性。KULLISAAR等17研究，
21、发现发酵乳杆菌E8和E3菌株的细胞在浓度为1MMOL/L的H2O2中存活的时间分别为150MIN和180MIN，而无抗氧化活性的发酵乳杆菌E33811的存活时间仅为90MIN。这两个菌株的无细胞提取物都能抑制对苯二酸加合物的形成，其抑制率分别为2342和275,而浓度为150MMOL/L还原性谷胱甘肽的抑制率为8446，这两菌株细胞裂解物的SOD酶活性分别为07160014和08950309U/MG的蛋白质，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其为MNSOD。312乳酸菌抗氧化活性的动物实验KAIZU等18利用动物实验测定了乳酸菌的抗氧化活性。有两组缺乏维生素E的实验鼠，一组喂养乳杆菌SBT2028
22、的无细胞提取物；另一组喂养水，空白实验中的实验鼠喂养维生素E4MG/D。结果发现，喂养无细胞提取物的实验鼠，其血红细胞溶血作用的抑制率为91，肝脏中MDA的浓度为250NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为14G/ML；而另一组喂水的实验鼠，其血红细胞溶血作用的抑制率仅为30，肝脏中MDA的浓度为320NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为110G/ML。空白实验中，实验鼠血红细胞溶血作用的抑制率视为100，肝脏中MDA的浓度为200NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为24G/ML。这说明乳杆菌SBT2028具有一定的抗氧化活性，其抗氧化效果与维生素E相近。孟和毕力格等19报道了酸马奶
23、中，嗜酸乳杆菌MG21具有一定的抗氧化活性，其活菌制剂能够明显提高实验鼠肝脏组织匀浆中SOD的活力和GSHPX的活力。在脂质过氧化物终产物丙二醛的测定结果表明，嗜酸乳杆菌MG21菌株活茵制剂能够显著地降低实验鼠血液和肝脏组织匀浆中丙二醛含量。313发酵乳制品中乳酸菌的抗氧化活性WANG等20研究了乳酸菌发酵豆奶和未发酵豆奶的抗氧化活性，结果表明经嗜酸乳杆菌CCRC14079和婴儿双歧杆菌CCRC14633发酵的豆奶对抗坏血酸自氧化的抑制率为1544，对超氧阴离子自由基的清除率为5729，其还原活性相当与1007M的半胱氨酸。而未发酵豆奶对抗坏血酸自氧化的抑制率为910，对超氧阴离子自由基的清除
24、率为3244，其还原活性只相当与381M的半胱氨酸。32乳酸菌氧化的可能机制现在对乳酸菌无细胞提取物具有清楚羟自由基、过氧化氢和抗脂质过氧化能力的研究报道有很多，但是对于乳酸菌的抗氧化机理却没有一个统一的认识。主要理论有321具有氧化酶类的物质乳酸菌体内具有一些天然的氧化酶类物质,如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、NADH氧化酶等，正式这些氧化酶类物质，使乳酸菌具有了一定的抗氧化活性。大多数乳酸菌是通过产谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶来清除羟自由基和过氧化氢21。322体内天然抗氧化物质乳酸菌体内的天然抗氧化物质，如阿魏酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等使乳酸菌具有抗氧化活性。特别是阿魏酸，阿魏
25、酸不仅是植物细胞细胞壁共有的组成成分，还是一种强抗氧化性质的物质，能够清除自由基，还具有抗癌和抗血栓等功效22,23。4我国乳酸菌资源的利用现状及应用前景41乳酸菌资源的利用现状人类从古至今对乳酸菌的应用十分普遍。古时，乳酸菌被应用在泡菜、腐乳的制作中，而现在由于乳酸菌具有提高食品风味和其营养价值，延长保存时间；帮助食物代谢的消化吸收；控制体内毒素；降低血清中胆固醇的含量；增强机体的免疫功能，预防和抑制肿瘤的发生等生理功效，乳酸菌被广泛应用于发酵乳制品中。我国乳酸菌饮料以每年15以上的速度在增长，酸奶的年增长速度更达到了4024。虽然发酵乳制品发展的十分迅速，但是一般采用的发酵剂都是来自国外，
26、并且在乳酸菌方面的研究较少，特别是菌种在遗传过程中稳定性的研究更少。42乳酸菌的应用前景乳酸菌在食品行业中的广泛应用，也促使了乳酸菌在医药上的应用。乳酸菌在医药上的应用主要是调理胃肠道和改善泌尿生殖系统25。乳酸菌不仅能缓解便秘、细菌性痢疾等症状，还可以降低细菌性阴道炎的发生。研究发现，由于乳酸菌能有效抑制有害菌的生长，平衡肌肤PH值，给肌肤形成一道完善的防御屏障，已经有国际化妆品碧欧泉公司将乳酸菌应用在护肤品上，并且开发了含有乳酸菌的眼霜、乳液、面膜、洗面奶等26。5结语近年来，大量的研究表明，氧化与氧化过程中产生的自由基会影响人体的健康。而乳酸菌及其相关制品能减少自由基，抗氧化，延缓人体衰
27、老与保持人体健康，越来越受到人们的重视。目前，虽然乳酸菌的抗氧化活性已经在体内和体外实验中得到证实，但是其作用机理和具体抗氧化物质等问题并不是研究得十分透彻，还需要进一步的研究。在应用方面，乳酸菌已经广泛的应用于食品行业中，但在医药等其他方面的应用还是刚起步。随着人们对乳酸菌抗氧化功能的深入认识，相信乳酸菌将来会得到更加广泛的应用。最后，我国的发酵乳制品行业发展的十分迅速，但是由于在这方面的研究较少，还是出现了许多问题，例如我国保藏的发酵剂菌种大部分从国外的发酵剂中分离，对其在遗传中的稳定性并不了解，这方面的研究也甚少。要想真正发展我国的发酵乳制品行业，这个问题是需要被重视的。参考文献1杨洁彬
28、,郭兴华乳酸菌生物学基础及应用M北京中国轻工业出版社,19962赵保路氧自由基和天然抗氧化剂M北京科学出版社,19993BARRYHALLIWELLREACTIVEOXYGENSPECIESANDTHECENTRALNERVOUSJJOURNALOFNEUROCHENIISTRY,1992,595160916234郑建仙功能性食品（第二卷）M北京中国轻工业出版社,19995CHENHY,YENGCFREERADICALS,ANTIOXIDANTDEFENSESANDHUMANHEALTHJNUTRITIONSCIENCES,1988,2311051216金世琳乳酸菌的科学技术J中国乳品工业,1
29、998,26214167施安辉,周波乳酸菌的分类、生理特性及在食品酿造工业上的应用J中国调味品，2001（11）388李成涛,吕嘉枥乳酸菌及其发酵制品的发展趋势J中国酿造,20058579胡书芳,王雁萍乳酸菌在泡菜生产中的应用J安徽农业科学,2008,36219275927610鲁绯乳酸菌在青方腐乳中的应用研究J中国酿造,20066293211张廷伟,张代玉,马景芳乳酸菌在肉制品加工中的应用J黑龙江畜牧兽医20038616212孟涛,郭兴华乳酸菌及生长因子对人畜健康的作用J生物工程进展,1993,134485213RTEANPAISAN,JHINTAO,GDAHLENORALLACTOBACI
30、LLUSSPECIESINTYPE2DIABETICPATIENTSLIVINGINSOUTHERNTHAILANDJELSEVIER,2009,1516016314敬思群优质乳酸菌的应用J中国乳业,20026182015赵红霞,詹勇,徐梓荣乳酸菌的研究及其应用J江西饲料,2003191216LINMY,YENCLANTIOXIDATIVEABILITYOFLACTICACIDBACTERIAJJAGRICFOODCHEM,1999,471460146617KULLISAART,ZILMERM,MIKELSAARM,ETALTWOANTIOXIDATIVELACTOBACILLISTRAINS
31、ASPROMISINGPROBIOTICSINTJFOODMICROBIOL,2002,7221522418KAIZUH,SASAKIM,NAKAJIMAH,ETALEFFECTANTIOXIDATIVELACTICACIDBACTERIAONRATSFEDADIETDEFICIENTINVITAMINEJDAIRYSCI,1993,462493249919孟和毕力格,周雨霞,张和平等酸马奶中乳杆菌GM21株的抗氧化活性作用研究J中国乳品工业,2005,339212420WANGYC,YURC,CHOUCCANTIOXIDATIVEACTIVITIESOFSOYBMILKFERMENTEDWI
32、THLACTICACIDBACTERIAANDBIFIDOBACTERIAJFOODMICROBILOGY,2006,2312813521ANNUKH,SHCHEPETOVAJ,KULLISAART,ETALCHARACTERIZATIONOFINTESTINALLACTOBACILLIASPUTATIVEPROBIOTICCANDIDATESJAPPLMICROB,2003,440341222刘展鹏,欧仕益,包惠燕阿魏酸脂酶的研究与应用J食品研究与发展,2006,127516917123WANGX,GENGXPURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFAFERULOYL
33、ESTERASEFROMTHEINTESTINALBACTERIUMLACTOBACILLUSACIDOPHILUSJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2004,7042367237224张和平我国乳品工业乳酸菌资源的开发利用现状及发展趋势J农产食品科技,2008,233625董贵成,田欢,刘岩廷乳酸菌在医药中的初步应用及其展望J内蒙古科技与经济,20025939426云月英,王文龙乳酸菌与健康J农产品加工,200916770本科毕业设计（20_届）抗氧化活性乳酸菌的筛选及其遗传稳定性研究目录1绪论1511乳酸菌的概述及其生理功效15111乳酸菌的概述15
34、112乳酸菌的生理功效1512自由基与乳酸菌的抗氧化作用15121自由基与抗氧化15122乳酸菌抗氧化作用的研究进展1513乳酸菌的遗传稳定性1614选题背景172材料与方法1721材料与器材17211材料与试剂17212主要仪器和设备17213溶液的配制1822实验方法18221乳酸菌无细胞提取物和细胞提取物的制备18222乳酸菌清除DPPH自由基的能力测定18223乳酸菌清除超氧阴离子自由基的能力测定19224传代培养19225菌体蛋白的制备19226菌株全菌体蛋白SDSPAGE193结果与分析2031抗氧化活性乳酸菌的筛选20311乳酸菌清除DPPH自由基的能力测定20312乳酸菌清除超
35、氧阴离子自由基的能力测定2132传代过程中菌株抗氧化活性的稳定性22321菌株全菌体蛋白SDSPAGE22322传代过程中乳酸菌的抗氧化活性234结论与展望2341总结2342问题与展望24致谢错误未定义书签。参考文献25附录错误未定义书签。摘要【摘要】本实验以实验室保藏的20株来源不同的乳酸菌作为实验菌株，从中筛选出了2株具有较高抗氧化活性的乳酸菌，编号为L8和L17。其无细胞提取物和菌体细胞提取物对DPPH自由基的清除率分别是5084004，3121005和5448005，3316002。其无细胞提取物和菌体细胞提取物对超氧阴离子的清除率分别是5049007，248516003和50750
36、06，2808001。由于筛选出的2株菌均属干酪乳杆菌，故只传代培养了其中一株编号为L17的乳酸菌，对其第1、5、10、15、20代全菌体蛋白进行SDSPAGE，并再次测定其清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力。实验结果表明，乳酸菌L17的全菌体蛋白在传代过程中没有较大的变化，即反应了其遗传的稳定性。【关键词】乳酸菌；抗氧化活性；筛选；遗传稳定性ABSTRACT【ABSTRACT】2HIGHERANTIOXIDANTACTIVITYSTRAINSOFLACTICACIDBACTERIAWERESCREENEDFROM20DIFFERENTSOURCESINTHELAB,NAMEDL8AN
37、DL17THERATESOFSCAVENGINGDPPHRADICALWERE5084004,3121005AND5448005,3316002THERATEOFSCAVENGINGSUPEROXIDEANIONRADICALWERE5049007,248516003AND5075006,2808001THE2SCREENEDSTRAINSWEREBOTHLACTOBACILLUSCASEI,SOONLYNOL17LACTICACIDBACTERIAWASSUBCULTUREDANDELECTROPHORESISITSALLBACTERIAPROTEINOF1,5,10,15,20GENETI
38、CLACTICACIDBACTERIABYSDSPAGETHERESULTOFTHEEXPERIMENTWASTHATTHEPROTEINOFL17LACTICACIDBACTERIACHANGEDLITTLEANDTHEGENETICSTABILITYWASWELL【KEYWORDS】LACTICACIDBACTERIAANTIOXIDANTACTIVITYSCREENGENETICSTABILITY1绪论11乳酸菌的概述及其生理功效111乳酸菌的概述乳酸菌是现在发酵食品生产过程中使用最普遍的菌种，它是指一类能够发酵碳水化合物并且能产生大量乳酸的革兰氏阳性的球菌和杆菌的统称。乳酸菌具有过氧化
39、酶为阴性、不形成芽孢、大多数不运动、消耗的葡萄糖有50以上产生乳酸、分解蛋白质不产生腐败产物，但对蛋白质和脂肪的分解能力较弱的特点1。到目前为止，乳酸菌有发现至少22个属，这其中包括乳杆菌属、营养缺陷杆菌属、气球菌属、肉食杆菌属、链球菌属、乳球形菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、奇异菌属、酒球菌属、糖球菌属、魏斯氏菌和芽孢乳杆菌等2,3。乳酸菌广泛存在于大自然中，人类从古至今对乳酸菌的应用也十分普遍。古时，乳酸菌被应用在泡菜、腐乳的制作中，而现在乳酸菌广泛应用于发酵乳制品中，并且其应用领域在不断的拓宽，例如肉制品和酿造业等46。112乳酸菌的生理功效乳酸菌的生理功能与人体生命活动和人体健康
40、紧密相关。乳酸菌的主要功能有以下5种添加到食品中，能提高食品风味和其营养价值，还可提高食品的附加功能，延长保存时间；改善人体肠道内微生物菌群和肠道的调节功能，并且帮助食物代谢的消化吸收；控制体内毒素，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生；降低血清中胆固醇的含量，延缓机体的衰老；增强机体的免疫功能，预防和抑制肿瘤的发生；乳酸菌菌体中含有一些抗氧化活性的物质，该物质能被肠道吸收而抑制血液中低密度脂蛋白LDL的氧化作用712。12自由基与乳酸菌的抗氧化作用121自由基与抗氧化自由基即游离基（FREERADICALS），是指那些独立存在的有一个或几个不配对电子的原子或基因13。自由基十分的活泼，
41、其化学性质大部分处于不稳定状态，是生物体内许多反应的中间代谢产物。自由基的特点反应强；具有顺磁性；寿命短14。活性氧是指含有氧的自由基，是生物体内主要的自由基，主要包括超氧阴离子自由基，羟自由基，过氧化氢自由基，脂氧自由基等。人体内的每个细胞每天都会受到自由基成千上万次的攻击。当体内的氧化增强系统与抗氧化系统之间的平衡倾向于抗氧化时，自由基对人体并无害处，它能清除入侵体内的细菌和化学物质等。但是当这个平衡倾向于氧化增强时，自由基的高度活性和极强的氧化能力，会使体内的大分子物质产生氧化变性，交联或断裂，进而引起细胞结构和功能的破坏，导致机体组织的损伤和器官的病变，最后使生物体受到伤害或病变。12
42、2乳酸菌抗氧化作用的研究进展1221乳酸菌抗氧化活性的体外实验LIN等15在研究报道中指出，在对包括嗜酸乳杆菌，嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌和长双歧杆菌等在内的19株乳酸菌的无细胞提取物进行抗氧化实验，发现所有菌株对抗坏血酸的自动氧化都具有抑制作用，其抑制范围在712；在螯合金属离子的能力方面，1010个活乳酸菌的无细胞提取物能够螯合FE2的量在（25727）106MG/L，727106MG/L为嗜热链球菌821螯合FE2的量。在清除HO实验的中发现，1010个活乳酸菌的无细胞提取物清除HO能力相当于尿酸的量为05331MMOLL，其中最高的是嗜酸乳杆菌E。虽然这19株乳酸菌都具有还原能力，但均
43、没有SOD酶的活性。KULLISAAR等16研究，发现发酵乳杆菌E8和E3菌株的细胞在浓度为1MMOL/L的H2O2中存活的时间分别为150MIN和180MIN，而无抗氧化活性的发酵乳杆菌E33811的存活时间仅为90MIN。这两个菌株的无细胞提取物都能抑制对苯二酸加合物的形成，其抑制率分别为2342和275,而浓度为150MMOL/L还原性谷胱甘肽的抑制率为8446，这两菌株细胞裂解物的SOD酶活性分别为07160014和08950309U/MG的蛋白质，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其为MNSOD。1222乳酸菌抗氧化活性的动物实验KAIZU等17利用动物实验测定了乳酸菌的抗氧化活性。有两
44、组缺乏维生素E的实验鼠，一组喂养乳杆菌SBT2028的无细胞提取物；另一组喂养水，空白实验中的实验鼠喂养维生素E4MG/D。结果发现，喂养无细胞提取物的实验鼠，其血红细胞溶血作用的抑制率为91，肝脏中MDA的浓度为250NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为14G/ML；而另一组喂水的实验鼠，其血红细胞溶血作用的抑制率仅为30，肝脏中MDA的浓度为320NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为110G/ML。空白实验中，实验鼠血红细胞溶血作用的抑制率视为100，肝脏中MDA的浓度为200NMOL/G，血浆中维生素E的质量浓度为24G/ML。这说明乳杆菌SBT2028具有一定的抗氧化活性，其抗
45、氧化效果与维生素E相近。孟和毕力格等18报道了酸马奶中，嗜酸乳杆菌MG21具有一定的抗氧化活性，其活菌制剂能够明显提高实验鼠肝脏组织匀浆中SOD的活力和GSHPX的活力。在脂质过氧化物终产物丙二醛的测定结果表明，嗜酸乳杆菌MG21菌株活茵制剂能够显著地降低实验鼠血液和肝脏组织匀浆中丙二醛含量。1223发酵乳制品中乳酸菌的抗氧化活性WANG等19研究了乳酸菌发酵豆奶和未发酵豆奶的抗氧化活性，结果表明经嗜酸乳杆菌CCRC14079和婴儿双歧杆菌CCRC14633发酵的豆奶对抗坏血酸自氧化的抑制率为1544，对超氧阴离子自由基的清除率为5729，其还原活性相当与1007M的半胱氨酸。而未发酵豆奶对抗
46、坏血酸自氧化的抑制率为910，对超氧阴离子自由基的清除率为3244，其还原活性只相当与381M的半胱氨酸。13乳酸菌的遗传稳定性目前我国对这方面的研究很少，主要是通过PARD方法分析乳酸菌传代过程中的遗传稳定性，并利用SDSPAGE方法分析传代过程中菌株蛋白质的表达差异20。该研究多用于直投式乳酸菌的开发。14选题背景氧化反应是许多生物产生能量的必要反应。然而，过多的氧化反应也会破坏生物大分子。尽管人类和其它生物具有的抗氧化防御系统能保护他们免于氧化损伤,但这些系统对于防止氧化损伤并不能完全有效地发挥其作用。近年来证实，抗氧化剂可以被用来帮助人体减少氧化损伤，但是,合成抗氧化剂对健康和长期效应
47、等存在安全的问题。寻找天然的安全的抗氧化剂将成为研究热点。因此，筛选具有抗氧化活性的乳酸菌具有很好的研究和应用价值。目前，我国的发酵乳制品行业发展的十分迅速，但是由于在这方面的研究较少，还是出现了许多问题，例如我国保藏的发酵剂菌种大部分从国外的发酵剂中分离，对其在遗传中的稳定性并不了解，这方面的研究也甚少。研究抗氧化活性乳酸菌对于我国发酵乳制品行业的发展具有很重要的意义。本实验以实验室保藏的20株来源不同的乳酸菌为实验菌株，通过测定其对DPPH和超氧阴离子的清除率，从中筛选出具有抗氧化活性的乳酸菌2株，再对菌株进行传代培养，对培养了第1、5、10、15、20天的菌株的全菌体蛋白进行SDSPAG
48、E，并再次测定DPPH和超氧阴离子的清除率，以此为实验提供理论依据。2材料与方法21材料与器材211材料与试剂菌株实验室保藏的20株来源不同的菌株。葡萄糖上海展云化工试剂有限公司分析纯乙酸钠天津市博迪化工有限公司分析纯硫酸锰国药集团化学试剂有限公司分析纯氯化钠江苏强盛化工有限公司分析纯蛋白胨杭州微生物试剂有限公司分析纯牛肉膏杭州微生物试剂有限公司分析纯酵母提取物杭州微生物试剂有限公司分析纯柠檬酸氢二铵国药集团化学试剂有限公司分析纯磷酸氢二钾天津市博迪化工有限公司分析纯琼脂上海展云化工试剂有限公司分析纯蔗糖国药集团化学试剂有限公司分析纯212主要仪器和设备紫外可见分光光度计上海UNICO光学仪器厂高速冷冻离心机湖南湘仪设备厂超声波破碎仪宁波新芝科学仪器厂立式高压灭菌锅上海申安医疗器械厂恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂垂直板型电泳槽上海天能专业制造厂直流稳压电源上海福兆专业制造厂213溶液的配制MRS培养基蛋白胨10G，肉膏10G，酵母提取物5G，KH2PO32G，柠檬酸二铵2G，乙酸钠5G，葡萄糖20G，吐温801ML，MGSO47H2O058G，MNSO4H2O0189G。PBS（002MOL/LPH70）NA2HPO3179G，KH2PO3012G，NACL425G，KCL01G，定容500ML；邻苯三酚（9MMOL/L）焦性没食子酸（12611G
