1、1本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究一、选题的背景与意义金黄色葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）以下简称金葡是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可能存在8，因而食品特别是牛奶及奶制品受其污染的机会很多。金葡菌最常见的污染是通过化脓性皮肤疾病、上呼吸道炎症、口腔内疾病的人，以及健康人咽喉和鼻腔内带菌，经与食物接触或者通过空气传播而污染食物，并在其中繁殖和产毒。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶的数量，当金葡菌污染了含淀粉和水分较多的食品时，在温度等条件适宜时，经10小时左右
2、即可产生相当数量的肠毒素，据估计，进食者吃下约100G的肠毒素A即可出现食物中毒的症状。因此食品和食品原料中污染有金葡菌就有可能产生肠毒素，就有食物中毒的潜在危险。葡萄球菌毒素（SE）是食物中毒最常见的原因之一，它引起的食物中毒症状主要是呕吐和腹泄，这些毒素蛋白质的结构主要为金葡菌的次生代谢产物。虽然热处理可破坏葡萄球菌，但致病毒素对热稳定，可在热处理过程中保持甚至增加活性，100加热30分钟仍不失去其活性，因此金葡菌一旦污染了食品并在其中产生了肠毒素，用一般的烹调方法将活菌体灭活后，也不能将肠毒素破坏，必须加热100两小时才能破坏其毒性。而对于冷冻食品，由于其制作及保藏处于温状态，所以更易感
3、染金葡菌。金葡菌肠毒素还有一种特点是对蛋白酶有耐性，在活性阶段可抗蛋白水解酶水解，故在水货道中也不易被破坏，因而食品极易被金葡菌污染极易引起食源性疾病的爆发。金葡菌繁殖、是否产毒和产毒程度与食品的性质和组分密切相关，金葡菌污染食品后，如果被污染食品具备产毒条件时，就会产生肠毒素，对产品造成更进一步的污染，一般地，在PH6080、水分含量较多、蛋白质或者淀粉比较丰富的食品中，在温度等条件合适的情况下，该菌最容易繁殖并产生毒素，并且当氧分压较低时肠毒素较易形成，而冻虾仁具备金葡菌的繁殖和生产的主要条件。即使通过物理或者化学的方法将产口中的金葡菌完全灭活，但其中肠毒素仍不容易被破坏，因此产品也你存在
4、肠毒素污染的危险。如今，国内外贸易增多，国外食品和食品原料大量进入我国市场，检验局经常从进口的2冷冻虾仁中检验出金葡菌，因此该产品也有存在金葡菌肠毒素的危险，而对于此肠毒素未做过相应的检测。因此研究冻虾仁中金葡菌和产生金葡菌肠毒素之间的关系，研究虾仁中金葡菌的产肠毒素条件，对于预示冷冻虾仁中是否有肠毒素，防止金葡菌产生肠毒素和改进虾仁后加工工序步骤有指导作用。金葡菌是一种重要的致病菌，当它污染食品后，在适宜的条件下会产生金黄色葡萄球菌肠毒素。因此，本实验拟调查研究冻虾仁中金黄色葡萄球的数量，按照国家标准方法GB/T478910检测并计数。同时采用MINIVIDAS的葡萄球菌肠毒素（SET）试剂
5、盒提供的方法提取产品肠毒素，根据酶联荧光免疫分析原理检测是否污染肠毒素，研究金葡菌和肠毒素间存在的关系。在虾仁中感染接种入金葡菌，初步研究虾仁中金葡菌的产毒情况，包括培养时间和培养温度等条件的影响，为现实条件中的产品存放和安全食用供指导。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1、金黄色葡萄球菌致病性研究金黄色葡萄球菌污染食物后，不仅使其腐败变质，而且部分细菌产生肠毒素，引起食物中毒。金葡菌具有多种蛋白质抗原，常用于食品检测的有葡萄球菌肠毒素和葡萄球菌A蛋白（STAPHYLOCOCCALPROTEINA,SPS）,葡萄球菌肠毒素是一组结构相关，毒力相近的胞外蛋白质，迄今为止从血清上已被鉴定的SE有
6、10种A，B，C，D，E，G，H，I，J，K型，其中C型抗原又根据等电点的不同分为3个严型（C1，C2，C3），其中肠毒素A是分子量为27KD的单体蛋白，它是葡萄球菌食物中毒最常见的类型，D，B，C次之4。肠毒素可与相应的抗毒素特异性结合。因此，采用其中之一有可检测标记的，特异性的单克隆或多克隆抗体，与样品中肠毒素结合，结果可采用比色、放免、荧光检测，或采用凝集、沉淀等肉眼可观察的免疫学现象来判断肠毒素的有无。A蛋白存在于葡萄球菌的表面，具有种属特异性，无型别特异性，能与人与多种哺乳动物的免疫球蛋白IGG和FC片段结合。因此可采用IGG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来
7、检测金葡菌的有无。按照国家标准GB/T4789102008的附录B中，对金葡菌肠毒素的检测，采用酶联免疫分析法（ELISA）方法，预先将肠毒素的抗体（单价或多价抗体）与载体吸附。当加入待检样品后，如样品中含有肠毒素，即可与之特异性结合。再采用第二抗体（抗抗体）与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体抗抗体三层“夹心”结构，而抗抗体上标记有某种酶（如碱性磷酸酶、过氧化物酶等），最后加上该酶的底物使之显色。根据颜色深浅进行定性或定量检测。3利用该方法的已经有多种商品化的试剂盒，提供已吸附单价或多家抗体的微孔板，以及阴性、阳性对照等。此法灵敏（05MG/ML），专一，操作简单而快速（约4个小时）。但其缺点
8、是由相关抗原引起的交叉反应或内源性过氧化物干扰酶，肠毒素蛋白可能会凝集，而降低反应原性（仍保持毒性），造成假阴性。2、肠毒素检测（ELFA）VIDASSET2试剂盒是用自动化VIDAS设备进行酶联荧光免疫分析（ELFA）以测定葡萄球菌肠毒素。小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌毒素肯有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等优点。VIDAS食品自动完成全冲毁实验程序。将食物提取物加于试剂条上，样品将在SPR内定时循环，样品中的葡萄球菌肠毒素与包被在SPR内侧的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体结合，未结合的样品则被洗去。抗体碱性磷酸复合物通过SPR循环并与SPR内壁上的任何肠毒素抗原结合，最后洗去未结合复合物。
9、荧光底物（4甲基香琣素磷酸酯）在SPR内外反复循环，SPR上存留的酶催化底物分解为荧光底物（4甲基伞形酮）。VIDAS的光扫描仪在450NM处自动测定荧光产物。试验结束时，计算机自动分析结果并打印报告，得出检测并与阈值比较，得出最终解释（阴性或阳性）。该方法只需简单的提取后，VIDASSET2试剂盒可直接用于筛选食物中任何一种肠毒素的存在，实验室全自动化，80分钟可获得结果。该方法可以弥补国家标准中的检测金黄色葡萄球菌肠毒素时的提取困难，试剂来源难，保存时间短，毒素检测样本少而导致试剂盒过期，操作繁等问题而无法检测此毒素的空白，弥补了用金黄色葡萄球菌计数来确定是否为此菌引起食物中毒过程中由于标
10、本量太少及一些特殊改善标本而无法进行计数的缺陷。尽管目前用小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌肠毒素还不能分型，但对判断此菌引起民的食物中毒的诊断起到简便操作并明示作用。三、研究的方法与技术路线1细菌分离检验金葡菌的检测金葡菌能耐受1015的氯化钠，对温度适应强，最适温度3536度。多数能产生溶血素、血浆凝固酶，以及卵磷脂，热稳定核酸酶、磷酸酶、脲酶，还原亚碲酸钾、还原硝酸盐，发酵甘露醇产酸、触酶阳性、产生金黄色或柠檬色色素。11金葡菌的定性检测金葡菌的检测根据GB/T487910方法来检测。样品接种。4氯化钠胰蛋白胨肉汤，培养后转接BAIRDPARKER琼脂和血平板。4金葡菌在BAIRDPARK
11、ER平板上典型菌落为圆形光学的灰黑色菌落（因还原亚碲酸钾生产碲，所以菌落呈灰黑色），直径13MM，边缘颜色较浅，周围有透明圈（因含卵磷脂酶分解培养基中的卵黄所致）。在血平板上典型菌落为圆形光滑的金黄色或者黄白色菌落。直径23MM，周围有溶血圈（因含溶血素所致）。血浆凝固酶试验将可疑菌落转接到营养肉汤中，培养物加入到14的兔血浆中36度放置26小时，试管中呈凝块者，为血浆凝固酶试验阳性，同时以阳性菌株及内分泌作为对照，血浆凝固酶试验采用商品化的北京陆桥公司生产的冻干血浆。可疑金葡菌进行镜检为革兰氏阳性球菌，直径081UM的不规则成堆排列，类似葡萄串，无芽孢。挑平板上的可疑菌进行血浆凝固酶实验并进
12、行VITEK生化鉴定。报告样品中是否含带金黄色葡萄球菌。12虾仁产品中的金葡菌的定量检测取25G样品于225ML生理盐水中稀释均匀，并取该1ML十倍稀释液涂布于BAIRDPARKER琼脂平板培养48小时进行可疑菌的计数及鉴定，可疑菌的判断同上。可疑菌同时分离纯化，接种于血平板上，并进行VITEK生化鉴定。根据结果报告样品的金黄色葡萄球菌含量（CFU/G）。2肠毒素中的毒素提取与检测毒素提取后采用酶联免疫荧光分析方法，用全自动免疫荧光分析仪（MINIVIDAS）检测。提取的方法生肉、海产品与熟肉1称取25克的样品加入25ML蒸馏水。2反复混匀以得到均匀悬液，如悬液过稠，再加25ML蒸馏水混匀。3
13、回收全部的提取液。4使用5的盐酸调整PH值至40。51825摄氏度静置1530分钟。6将悬液1825摄氏度，30005000转，15MIN离心。7使用1氢氧化钠调整滤液P至7580之间。取05ML离心上清液作为毒素样品，放入VIDASSET2试剂条的样品孔中，测定肠毒素。80MIN后自动出结果。判断肠毒素有无及其强弱程度。综合以上实验得出结论。5四、总体安排与进度2010年11月查找资料，撰写综述和开题报告。开题答辩。2010年12月翻译外文文献201年1月确定实验方案，准备材料和实验仪器，开展实验。2011年2至3月处理数据2011年5月撰写毕业论文，准备论文答辩五、主要参考文献1胡荣华，徐
14、景野，速冻食品中金黄色葡萄球菌污染调查及存活观察J中国食品卫生杂志，2002，VOL14,NO4,37382向阳，食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法J，中国食品学报，2002，VOL2,NO23刘雪云，武海燕，陆峥等，速冻食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的调查研究J，中国卫生杂志，200312，VOL13,NO24王小红，谢笔钧，史贤明，食品中金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展J，山西食品工业，2003，NO65高涛，食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展J，福建分析测试，2003，12（2）6叶鹿鸣，徐景野，速冻食品中金黄色葡萄球菌检测及存活观察J，中国卫生检验杂志，20034，V
15、OL13,NO27斯国静，张蔚，韦东芳，采用小型VIDAS全自动荧光酶标免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素J，中国卫生检验杂志，20088，VOL12,NO48吴双，张仁利，耿艺介等，产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达J，中国人兽共患病学报，2008，24（5）4514549谢士嘉,王静,姜永强等，胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素BJ,中国食品卫生杂志，313510SMORANDI,MBRASCA，RLODIETAL，DETECTIONOFCLASSICALENTEROTOXINSANDIDENTIFICATIONOFENTEROTOXINGENESINSTAPHYLO
16、COCCUSAUREUSFROMMILKANDDAIRYPRODUCTSSMORANDIETAL/VETERINARYMICROBIOLOGY1242007667211NINAWALLINCARLQUIST,DRAMRTA,ELISABETHBORCH,PETERRDSTRM，PROLONGEDEXPRESSIONANDPRODUCTIONOFSTAPHYLOCOCCUSAUREUSENTEROTOXINAINPROCESSED6PORKMEATINTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY1412010697412MARCELLEVIANNADECARVALHO
17、UHL，RICARDOJOSEBOTTECCHIA，JULIANAAZEVEDOSILVAETAL,SUITABILITYOFARECOMBINANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUSENTEROTOXINCBOVINEVARIANTFORIMMUNODIAGNOSTICSANDTHERAPEUTICVACCINEDEVELOPMENT,MVCUHLETAL/VACCINE2220044191420213张宏伟，郑冬梅，孔保华，原料乳在低温储存过程中金黄色葡萄球菌生长及产毒情况研究J，农产品加工学刊，第10期2009年10月，525414张雅琪，刘建学，罗登林等，食品中金黄色葡萄球菌检测
18、方法的研究进展J，农产品加工学刊第9期2009年9月，848615李毅，章乐怡，李小春等，食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素检测分析报告J，中国卫生检验杂志2009年10月第19卷第10期2073207516李婉芬，生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分布J，中国卫生检验杂志2008年5月第18卷每5期84384517章乐怡，李毅，马雪莲，食物中毒及食品中金黄色葡萄球菌的肠毒素及基因的研究J，中国卫生检验杂志2009年12月第19卷第12期2851285318张严峻，王志刚，程苏云等，金黄色葡萄球菌食品和病人分离株场毒素基因和耐药性比较J，中国卫生检验杂志2008年1月第18卷第1期333519
19、任天红，刘景武，付素兰，金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的应用及进展J，河北医药2008年8月第30卷第8期1224122620梁毅珊，金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展J,中国热带医学2008年第8卷第9期,1658165921陈国兵，唐朝晖，金黄色葡萄球菌肠毒素B研究进展J，微生物学免疫学进展2008年第36卷第1期596422韩佳丽，李昌，沈国顺等，金黄色葡萄球菌肠毒素A在枯草芽孢杆菌中的表达及其活性分析J，中国兽医学报2010年3月第30卷第3期3273317毕业论文文献综述食品质量与安全冻虾仁中金黄色葡萄球菌的产肠毒素研究金黄色葡萄球菌（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）
20、以下简称金葡菌是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物排泄物中都可能存在，金葡菌最常见的污染是通过化脓性皮肤疾病、上呼吸道炎症、口腔内疾病的人，以及健康人咽喉和鼻腔内带菌，经与食物接触或者通过空气传播而污染食物，并在其中污染和产毒。因而食品受其污染的机会很多。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的肠毒素和侵袭性酶，当金葡菌污染了含淀粉和水分较多的食品时，在温度等条件适宜时，经10个小时左右即可产生相当数量的肠毒素。因此食品和食品原料中污染有金葡菌就有可能产生肠毒素（ENTEROTOXIN,简称SE），就有食物中毒的潜在危险，引起中毒的不是金葡菌本身，而是
21、其产生的肠毒素。据估计，进食者吃下约100ML的肠毒素A即可出现食物中毒症状。此肠毒素能耐受10030MIN而保持毒力。据统计在美国由金葡菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌食物中毒的33左右，我国发生的此类事件也相当多。而在金葡菌引起食物中毒的物质中，肠毒素的毒性相对于人体来讲已经比较具有毒性的了。它是由血浆凝固酶或耐热酸酶阳性的金黄色葡萄球菌所产生的一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质,能引起食物中毒。葡萄球菌肠毒素已演化多种变种，大部分已有耐药性，经药敏性实验可以得出，从食物中分享出来的金葡菌对苯唑西林纸片敏感，不耐药。对青霉素和氨苄青霉素的耐药率比较高，对常用药镼古霉素敏感，未检
22、出耐万古霉素的金葡菌。对其他类别抗生素比较敏感。而在部分医院和病人身上，就已检出耐西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。金黄色葡萄球菌在医院内感染比较常见，然而在近几年出现一种“超级病毒”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA,是医院内感染见到的病原菌之一，MRSA也是目前医院内感染最棘手的病原菌之一。检出的MRSA一般呈多重耐药性，MRSA已经成为多重耐药性金黄色葡萄球菌的代名词，并且这现象的出现是不规范地使用大量抗菌药物的结果，耐药性可通过垂直或水平传播，虽然从各个环境分享出来的MRSA检出率不一，但据报道，从临床上分享的SA，耐青霉素高达60以上。感染该耐药菌治疗困难，已成为日益严重是的临床问题，国
23、内外已有过多次报道，而对分享于医院外环境（食品、公共用品、空气、食物中毒等）标本中的金黄8色葡萄球菌（SA）发生MRSA的概率了解甚少。在日常生活中金黄色葡萄球菌一般不会致病，更不会出现不易治愈的实例。从院外环境中分离的SA大部分不拾耐药性基因，也不产生耐药性，这与实际情况较接近，说明院内和院外普通环境的SA菌株之间，在耐药性上存在明显的差别。原因可能是与基因的不稳定性有关。医院内的MRSA一到院外易受多种因素（如诱导剂、不良的生理环境等）的影响，使耐药基因的周围DNA产生不同程度的缺损，导致耐药性的丧失。SA的耐药性有可能通过环境因素的影响而丢失。因此这些菌株主要来自于院内感染的病人或密切接
24、触者，甚至是普通人，虽然食品和环境中的SA携带MRSA频率较低，但SA的耐药性机制提醒我们，其垂直或水平传播耐药性的特征，还是应该引起我们的高度重视。参考论文1、胡荣华，徐景野，速冻食品中金黄色葡萄球菌污染调查及存活观察J中国食品卫生杂志，2002，VOL14,NO4,37382、向阳，食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法J，中国食品学报，2002，VOL2,NO23、刘雪云，武海燕，陆峥等，速冻食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的调查研究J，中国卫生杂志，200312，VOL13,NO24、王小红，谢笔钧，史贤明，食品中金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展J，山西食品工业，2003，NO65、高
25、涛，食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检测方法的研究进展J，福建分析测试，2003，12（2）6、叶鹿鸣，徐景野，速冻食品中金黄色葡萄球菌检测及存活观察J，中国卫生检验杂志，20034，VOL13,NO27、斯国静，张蔚，韦东芳，采用小型VIDAS全自动荧光酶标免疫法检测金黄色葡萄球菌肠毒素J，中国卫生检验杂志，20088，VOL12,NO48、吴双，张仁利，耿艺介等，产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达J，中国人兽共患病学报，2008，24（5）4514549、谢士嘉,王静,姜永强等，胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素BJ,中国食品卫生杂志，313510、SMORANDI,
26、MBRASCA，RLODIETAL，DETECTIONOFCLASSICALENTEROTOXINSAND9IDENTIFICATIONOFENTEROTOXINGENESINSTAPHYLOCOCCUSAUREUSFROMMILKANDDAIRYPRODUCTSSMORANDIETAL/VETERINARYMICROBIOLOGY1242007667211、NINAWALLINCARLQUIST,DRAMRTA,ELISABETHBORCH,PETERRDSTRM，PROLONGEDEXPRESSIONANDPRODUCTIONOFSTAPHYLOCOCCUSAUREUSENTEROTOXI
27、NAINPROCESSEDPORKMEATINTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY1412010697412、MARCELLEVIANNADECARVALHOUHL，RICARDOJOSEBOTTECCHIA，JULIANAAZEVEDOSILVAETAL,SUITABILITYOFARECOMBINANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUSENTEROTOXINCBOVINEVARIANTFORIMMUNODIAGNOSTICSANDTHERAPEUTICVACCINEDEVELOPMENT,MVCUHLETAL/VACCINE222004419142
28、0213、张宏伟，郑冬梅，孔保华，原料乳在低温储存过程中金黄色葡萄球菌生长及产毒情况研究J，农产品加工学刊，第10期2009年10月，525414、张雅琪，刘建学，罗登林等，食品中金黄色葡萄球菌检测方法的研究进展J，农产品加工学刊第9期2009年9月，848615、李毅，章乐怡，李小春等，食品中金黄色葡萄球菌及肠毒素检测分析报告J，中国卫生检验杂志2009年10月第19卷第10期2073207516、李婉芬，生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分布J，中国卫生检验杂志2008年5月第18卷每5期84384517、章乐怡，李毅，马雪莲，食物中毒及食品中金黄色葡萄球菌的肠毒素及基因的研究J，中
29、国卫生检验杂志2009年12月第19卷第12期2851285318、张严峻，王志刚，程苏云等，金黄色葡萄球菌食品和病人分离株场毒素基因和耐药性比较J，中国卫生检验杂志2008年1月第18卷第1期333519、任天红，刘景武，付素兰，金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的应用及进展J，河北医药2008年8月第30卷第8期1224122620、梁毅珊，金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展J,中国热带医学2008年第8卷第9期,1658165921、陈国兵，唐朝晖，金黄色葡萄球菌肠毒素B研究进展J，微生物学免疫学进展2008年第36卷第1期596422、韩佳丽，李昌，沈国顺等，金黄色葡萄球菌肠毒素A在
30、枯草芽孢杆菌中的表达及其活性分析J，中国兽医学报2010年3月第30卷第3期32733110本科毕业设计（20_届）金黄色葡萄球菌产肠毒素的研究11【摘要】金黄色葡萄球菌是动物和人类化脓感染中最常见的病菌，在自然界中无处不在，因而食品受其污染的机会很多。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，葡萄球菌肠毒素是中毒的主要致病毒素，它对热稳定，可在热处理过程中保持甚至增加活性，因此金葡菌一旦污染了食品并在其中产生了肠毒素，用一般的烹调方法将活菌体灭活后，也不能将肠菌素破坏，必须加热100持续2H才能破坏其毒性。对生产的危害比较重大，为了在普通生产中杜绝或减少金葡菌及其肠毒素的危害，在生
31、产加工的时候要杜绝营养丰富水分充足的环境，以降低金葡菌及其肠毒素对食品和食品原料的污染。【关键词】金黄色葡萄球菌；肠毒素；冻虾仁。【ABSTRACT】STAPHYLOCOCCUSAUREUSWASINFECTEDANIMALSANDHUMANSARETHEMOSTCOMMONROTTINGBACTERIA,INNATURE,ANDFOODEVERYWHEREBYITSPOLLUTIONOPPORTUNITYMANYTHEIRULENCEAUREAUSDEPENDMAINLYONITSSTRENGTHOFTHETOXINSTHATANDINVASIVEENZYMES,STAPHYLOCOCCUS
32、BOWELTOXINISTHEMAINPATHOGENICTOXINPOISONING,ITMAY,INTHETHERMALSTABILITYOFHEATTREATMENTPROCESS,THUSMAINTAININGOREVENINCREASEACTIVITYAUREAUSONCEPOLLUTEDFOODANDAMIDPRODUCEDBOWELPOISON,USINGGENERALCOOKINGMETHODSWILLLIVEBACTERIAINACTIVATED,ALSOCANNOTAFTERINTESTINALBACTERIAELEMENTDAMAGE,MUSTBEHEATING100CO
33、NTINUETODISRUPTITSTOXICITY2HTHEHARMOFPRODUCTIONINGENERAL,COMPAREDTOMAJORPRODUCTIONOFELIMINATEORREDUCEAUREAUSANDBOWELPOISONHARMSOINPRODUCTIONPROCESSINGTOELIMINATENUTRITIONISRICHENOUGHMOISTURE,INORDERTOREDUCETHEENVIRONMENTAUREAUSANDBOWELPOISONTOFOODANDFOODRAWMATERIALSPOLLUTION【KEYWORDS】STAPHYLOCOCCUSA
34、UREUS；BOWELPOISON；FROZENSHRIMP。12目录1引言132材料与方法1421试剂与材料1422仪器设备1423金黄色葡萄球菌培养方法及肠毒素检测方法15231金黄色葡萄球菌致病性研究15232肠毒素检测（ELFA）324操作步骤及方法16241细菌分离检验3242肠毒素中的毒素提取与检测43结果与分析1831进口冻虾仁中金葡菌的检测1832进口冻虾仁中金葡菌含量与肠毒素之间的关系1933冻虾仁中部分金黄色葡萄球菌菌株的产肠毒素分析2034模拟样品在不同温度和不同污染时间下的产毒分析2135不同培养介质之间的产毒差异性比较224结论23参考论文23131引言金黄色葡萄球菌
35、（STAPHYLOCOCCUSAUREUS）以下简称金葡是动物和人类化脓感染中最常见的病原菌，在自然界中分布广泛，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可能存在8，因而食品特别是牛奶及奶制品受其污染的机会很多10。金葡菌最常见的污染是通过化脓性皮肤疾病、上呼吸道炎症、口腔内疾病的人，以及健康人咽喉和鼻腔内带菌，经与食物接触或者通过空气传播而污染食物，并在其中繁殖和产毒14。金葡菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶的数量，当金葡菌污染了含淀粉和水分较多的食品时，在温度等条件适宜时，经10小时左右即可产生相当数量的肠毒素，据估计，进食者吃下约100G的肠毒素A即可出现食物中毒的症状2。因此
36、食品和食品原料中污染有金葡菌就有可能产生肠毒素，就有食物中毒的潜在危险。葡萄球菌毒素（SE）是食物中毒最常见的原因之一，它引起的食物中毒症状主要是呕吐和腹泄，这些毒素蛋白质的结构主要为金葡菌的次生代谢产物。虽然热处理可破坏葡萄球菌，但致病毒素对热稳定，可在热处理过程中保持甚至增加活性，100加热30分钟仍不失去其活性，因此金葡菌一旦污染了食品并在其中产生了肠毒素，用一般的烹调方法将活菌体灭活后，也不能将肠毒素破坏，必须加热100两小时才能破坏其毒性9。而对于冷冻食品，由于其制作及保藏处于温状态，所以更易感染金葡菌1。金葡菌肠毒素还有一种特点是对蛋白酶有耐性，在活性阶段可抗蛋白水解酶水解，故在水
37、货道中也不易被破坏，因而食品极易被金葡菌污染极易引起食源性疾病的爆发。金葡菌繁殖、是否产毒和产毒程度与食品的性质和组分密切相关，金葡菌污染食品后，如果被污染食品具备产毒条件时，就会产生肠毒素，对产品造成更进一步的污染16，一般地，在PH6080、水分含量较多、蛋白质或者淀粉比较丰富的食品中，在温度等条件合适的情况下，该菌最容易繁殖并产生毒素，并且当氧分压较低时肠毒素较易形成，而冻虾仁具备金葡菌的繁殖和生产的主要条件。即使通过物理或者化学的方法将产口中的金葡菌完全灭活，但其中肠毒素仍不容易被破坏，因此产品也你存在肠毒素污染的危险15。如今，国内外贸易增多，国外食品和食品原料大量进入我国市场，检验
38、局经常从进口的冷冻虾仁中检验出金葡菌，因此该产品也有存在金葡菌肠毒素的危险，而对于此肠毒素未做过相应的检测。因此研究冻虾仁中金葡菌和产生金葡菌肠毒素之间的关系，研究虾仁中金葡菌的产肠毒素条件，对于预示冷冻虾仁中是否有肠毒素，防止金葡菌产生肠毒素和改进虾仁后加工工序步骤有指导作用22。14金葡菌是一种重要的致病菌，当它污染食品后，在适宜的条件下会产生金黄色葡萄球菌肠毒素。因此，本实验拟调查研究冻虾仁中金黄色葡萄球的数量，按照国家标准方法GB/T478910检测并计数。同时采用MINIVIDAS的葡萄球菌肠毒素（SET）试剂盒提供的方法提取产品肠毒素，根据酶联荧光免疫分析原理检测是否污染肠毒素，研
39、究金葡菌和肠毒素间存在的关系18。在虾仁中感染接种入金葡菌，初步研究虾仁中金葡菌的产毒情况，包括培养时间和培养温度等条件的影响，为现实条件中的产品存放和安全食用供指导。2材料与方法21试剂与材料75氯化钠胰蛋白胨肉汤（北京陆桥）每一千ML中含酪蛋白胨170G，磷酸二氢钾25G大豆木瓜蛋白酶消化物30G，氯化钠50G，葡萄糖25G，去离子水1000ML。PH调剂。血琼脂平板（上海程嘉）每1000ML琼脂含酪蛋白胰酶消化物100G，心胰酶消化物30G，玉米淀粉10G，琼脂130G150G，肉胃酶消化物50G，酵母浸出粉50G，氯化钠50G，蒸馏水1000ML，兔血50ML70ML。BAIRDPAR
40、KER琼脂（北京路桥）BAIRDPARKER氏培养基每1000ML成分胰蛋白胨10G，牛肉膏5G，酵母膏1G,丙酮酸钠10G,甘氨酸12G,氯化锂LICL6H2O5G,琼脂20G,蒸馏水950ML，将PH调至75，增菌剂的配法30卵黄盐水50ML与除菌过滤的1亚蹄酸钾溶液10ML混合，保存于冰箱内。制法将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解。冷至25，校正PH。分装每瓶95ML，121高压灭菌15MIN。临用时加热溶化琼脂，冷至50，每95ML加入预热至50的卵黄亚蹄酸钾增菌剂5ML，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48H。冻干血浆北京路桥VIDASSET2试
41、剂盒生物梅里埃22仪器设备生化培养箱PSH300ROWSEN全自动免疫荧光分析仪MINIVIDAS,法国生物梅里埃公司离心机802离心沉淀器上深入细致手术器械厂1523金黄色葡萄球菌培养方法及肠毒素检测方法231金黄色葡萄球菌致病性研究金黄色葡萄球菌污染食物后，不仅使其腐败变质，而且部分细菌产生肠毒素，引起食物中毒。金葡菌具有多种蛋白质抗原，常用于食品检测的有葡萄球菌肠毒素和葡萄球菌A蛋白（STAPHYLOCOCCALPROTEINA,SPS）,葡萄球菌肠毒素是一组结构相关，毒力相近的胞外蛋白质，迄今为止从血清上已被鉴定的SE有10种A，B，C，D，E，G，H，I，J，K型，其中C型抗原又根据
42、等电点的不同分为3个严型（C1，C2，C3），其中肠毒素A是分子量为27KD的单体蛋白，它是葡萄球菌食物中毒最常见的类型，D，B，C次之4。肠毒素可与相应的抗毒素特异性结合。因此，采用其中之一有可检测标记的，特异性的单克隆或多克隆抗体，与样品中肠毒素结合，结果可采用比色、放免、荧光检测，或采用凝集、沉淀等肉眼可观察的免疫学现象来判断肠毒素的有无。A蛋白存在于葡萄球菌的表面，具有种属特异性，无型别特异性，能与人与多种哺乳动物的免疫球蛋白IGG和FC片段结合。因此可采用IGG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金葡菌的有无。按照国家标准GB/T4789102008的附录B
43、中，对金葡菌肠毒素的检测，采用的就是免疫学的方法用玻片双相琼脂扩散法和酶联免疫分析法（ELISA）两个方法。新国家标准GB4789102010的附录B中则只保留了酶联免疫分析法（ELISA）的方法。两种方法的步骤都非常繁锁。玻片双相琼脂扩散法原理是用含有电解质的琼脂凝胶为载体，侃肠毒素和抗肠毒素在凝胶中相对扩散，当扩散的肠毒素和相应的抗毒素相遇，比例适当时，就形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀物。此法灵敏度有限，需要肠毒素深度至少3060NG/G才能检出。因此需要先将食物样品经层析纯化和浓缩，以达到一定深度，才可进行琼脂扩散。酶联免疫分析法（ELISA）方法的原理是预先将肠毒素的抗体（单价或多价
44、抗体）与载体吸附。当加入待检样品后，如样品中含有肠毒素，即可与之特异性结合。再采用第二抗体（抗抗体）与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体抗抗体三层“夹心”结构，而抗抗体上标记有某种酶（如碱性磷酸酶、过氧化物酶等），最后加上该酶的底物使之显色。根据颜色深浅进行定性或定量检测。利用该方法的已经有多种商品化的试剂盒，提供已吸附单价或多家抗体的微孔板，以及阴性、阳性对照等。此法灵敏（05MG/ML），专一，操作简单而快速（约4个小时）。但其16缺点是由相关抗原引起的交叉反应或内源性过氧化物干扰酶，肠毒素蛋白可能会凝集，而降低反应原性（仍保持毒性），造成假阴性。232肠毒素检测（ELFA）目前对于金葡菌肠
45、毒素的研究检测方法，按照检测原理不同，可以分为五大类，包括生物学检测方法、免疫血清学方法、聚合酶链反应技术、生物传感器技术及超抗原技术等5。VIDASSET2试剂盒是用自动化VIDAS设备进行酶联荧光免疫分析（ELFA）以测定葡萄球菌肠毒素。小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌毒素肯有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等优点。VIDAS食品自动完成全冲毁实验程序。将食物提取物加于试剂条上，样品将在SPR内定时循环，样品中的葡萄球菌肠毒素与包被在SPR内侧的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体结合，未结合的样品则被洗去。抗体碱性磷酸复合物通过SPR循环并与SPR内壁上的任何肠毒素抗原结合，最后洗去未结合复合物。
46、荧光底物（4甲基香琣素磷酸酯）在SPR内外反复循环，SPR上存留的酶催化底物分解为荧光底物（4甲基伞形酮）。VIDAS的光扫描仪在450NM处自动测定荧光产物。试验结束时，计算机自动分析结果并打印报告，得出检测并与阈值比较，得出最终解释（阴性或阳性）7。该方法只需简单的提取后，VIDASSET2试剂盒可直接用于筛选食物中任何一种肠毒素的存在，实验室全自动化，80分钟可获得结果17。该方法可以弥补国家标准中的检测金黄色葡萄球菌肠毒素时的提取困难，试剂来源难，保存时间短，毒素检测样本少而导致试剂盒过期，操作繁等问题而无法检测此毒素的空白，弥补了用金黄色葡萄球菌计数来确定是否为此菌引起食物中毒过程中
47、由于标本量太少及一些特殊改善标本而无法进行计数的缺陷。尽管目前用小型VIDAS检测金黄色葡萄球菌肠毒素还不能分型，但对判断此菌引起民的食物中毒的诊断起到简便操作并明示作用。24操作步骤及方法241细菌分离检验金葡菌的检测金葡菌能耐受1015的氯化钠，对温度适应强，最适温度3536度。多数能产生溶血素、血浆凝固酶，以及卵磷脂，热稳定核酸酶、磷酸酶、脲酶，还原亚碲酸钾、还原硝酸盐，发酵甘露醇产酸、触酶阳性、产生金黄色或柠檬色色素。2411金葡菌的定性检测17金葡菌的检测根据GB/T487910方法来检测。样品接种。4氯化钠胰蛋白胨肉汤，培养后转接BAIRDPARKER琼脂和血平板。金葡菌在BAIR
48、DPARKER平板上典型菌落为圆形光学的灰黑色菌落（因还原亚碲酸钾生产碲，所以菌落呈灰黑色），直径13MM，边缘颜色较浅，周围有透明圈（因含卵磷脂酶分解培养基中的卵黄所致）。在血平板上典型菌落为圆形光滑的金黄色或者黄白色菌落。直径23MM，周围有溶血圈（因含溶血素所致）。血浆凝固酶试验将可疑菌落转接到营养肉汤中，培养物加入到14的兔血浆中36度放置26小时，试管中呈凝块者，为血浆凝固酶试验阳性，同时以阳性菌株及内分泌作为对照，血浆凝固酶试验采用商品化的北京陆桥公司生产的冻干血浆。可疑金葡菌进行镜检为革兰氏阳性球菌，直径081UM的不规则成堆排列，类似葡萄串，无芽孢。挑平板上的可疑菌进行血浆凝固
49、酶实验并进行VITEK生化鉴定。报告样品中是否含带金黄色葡萄球菌19。2412虾仁产品中的金葡菌的定量检测取25G样品于225ML生理盐水中稀释均匀，并取该1ML十倍稀释液涂布于BAIRDPARKER琼脂平板培养48小时进行可疑菌的计数及鉴定，可疑菌的判断同上。可疑菌同时分离纯化，接种于血平板上，并进行VITEK生化鉴定。根据结果报告样品的金黄色葡萄球菌含量（CFU/G）20。242肠毒素中的毒素提取与检测毒素提取后采用酶联免疫荧光分析方法，用全自动免疫荧光分析仪（MINIVIDAS）检测。提取的方法生肉、海产品与熟肉8称取25克的样品加入25ML蒸馏水。9反复混匀以得到均匀悬液，如悬液过稠，再加25ML蒸馏水混匀。10回收全部的提取液。11使用5的盐酸调整PH值至40。121825摄氏度静置1530分钟。13将悬液1825摄氏度，30005000转，15MIN离心。14使用1氢氧化钠调整滤液P至7580之间。取05ML离心上清液作为毒素样品，放入VIDASSET2试剂条的样品孔中，测定肠毒
