1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境胰蛋白酶、SDS对三疣梭子蟹酚氧化酶活力的影响一、选题的背景与意义三疣梭子蟹PORTUNNSTRITUBERCULATUS属甲壳纲短尾族梭子蟹科，是著名的大型海产食用蟹，具有较高的经济价值。该蟹遍布我国沿海，东海、黄渤海产量较大。近年来，由于海洋渔业资源结构的变化，梭子蟹自然资源急剧衰退，使得其商品价值倍增，人工养殖迅速兴起。甲壳类等节肢动物不具有特异性免疫功能，免疫防御是通过非特异性免疫发挥作用。酚氧化酶原激活系统PROPHENOLOXIDASEACTIVATINGSYSTEM是甲壳动物重要的防御和识别系统，由丝氨酸蛋白酶和其他相关因子组成，类似于脊
2、椎动物补体系统，在识别异物、释放调理素促进血细胞的吞噬和包囊以及介导凝集和凝固产生杀菌物质等免疫功能方面发挥重要作用。酚氧化酶PHENOLOXIDASE，PO是酚氧化酶原激活系统的产物，是衡量机体免疫功能的重要指标。已有研究表明甲壳血蓝蛋白在体外条件下不仅可以受十二烷基硫酸钠SDS、胰蛋白酶、尿素等的诱导表现出酚氧化酶活性，而且在一些内源性物质如血细胞溶解产物、凝集因子等的诱导下亦可显示出酚氧化酶活性，同时PERDOMO等研究证实美洲龙虾PANULIRUSARGUS血蓝蛋白在正常机体内具有酚氧化酶活性。本实验试图分别将胰蛋白酶和十二烷基硫酸钠（SDS）作用于三疣梭子蟹的血淋巴及血细胞溶解产物，
3、测定酚氧化酶活力的变动情况。本实验将在这方面进行初步的探索，为以后的实验打下基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容（1）在三疣梭子蟹第三步足基关节处用玻璃注释器提取淋巴液；（2）血浆样品和血细胞溶解产物的制备；（3）血淋巴、血细胞酚氧化酶活力的测定；（4）数据处理与分析。拟解决的主要问题试图分别将胰蛋白酶和十二烷基硫酸钠（SDS）作用于三疣梭子蟹的血淋巴及血细胞溶解产物，测定酚氧化酶活力的变动情况。三、研究的方法与技术路线研究方法首先准备好实验材料，其次配置和稀释好各种实验试剂，做好实验前期的准备工作。分好实验梯度，接下来采集血淋巴、血浆样品及血细胞溶解产物的制备。将配置的不用浓度
4、的试剂作用于获取的样品，测定酚氧化酶的活力变动情况。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月2010年12月开题2011年2月2011年4月（1）翻译外文文献；（2）完成实验操作；（3）数据分析；（4）撰写论文。五、主要参考文献购买三疣梭子蟹并喂养测定酚氧化酶的活力变动样品制备将试剂作用于样品论文撰写配制实验试剂数据分析、制表1王雷,李光友甲壳动物的体液免疫研究进展J海洋科学,1992,318192夏栋,卞疆龙虾多酚氧化酶的纯化及其部分生化特性J江苏食品与发酵,2000,116193赵东海,张建平,侯菊花蘑菇中多酚氧化酶的酶学特性研究J食品与机械,2004,20512174张明辉,陆宏
5、达中华绒螯蟹血淋巴液抗凝剂的筛选J水产科技情报,2005,32（增刊）93995陆宏达,张明辉中华绒螯蟹血细胞数及离体后形态学变化J水产学报,2006,3044444626孙虎山,李光友栉孔扇贝血淋巴中酚氧化酶和髓过氧物酶活力J中国水产科学,1999,629137黄辉洋,李少菁,王桂忠甲壳动物酚氧化酶活力及其在养殖中的应用J海洋通报,2000,19379848章跃陵,王三英,彭宣宪虾类免疫学的基础和应用研究J海洋科学,2000,24（12）26299章跃陵,王三英,刘光明南美白对虾血蓝蛋白对酚氧化酶活性的影响J中国水产科学,2005,12（4）40240610章跃陵,陈俊,林伯坤,等南美白对虾
6、血蓝蛋白血细胞凝集活性初探J汕头大学学报自然科学版,20053485311冯从经,杜宇州,陆自强,等亚洲玉米暝幼虫血清中酚氧化酶原的性质J昆虫学报,2005,48564965412JUNWAH,YYANG,AWANGRECONSIDERATIONOFPHENOLOXIDASEACTIVITYDETERMINATIONINWHITESHRIMPLITOPENAEUSVANNAMEIJFISHPHENOLOXIDASETRYPSINLAURYLSODIUMSULFATE1引言三疣梭子蟹没有特异性免疫系统，只有非特异性免疫系统1。在三疣梭子蟹中含有一类重要的免疫因子如抗菌肽、酚氧化酶原PROPO激活
7、系统、凝集素等。酚氧化酶原激活系统被一些特定物质激活后产生的黑色素及其中间产物，可通过多种方式参与宿主防御反应，包括促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节的形成，介导凝集和凝固，产生杀菌物，提供调理素等2，是甲壳动物中一类非常重要的免疫防御因子。11酚氧化酶（PHENOLOXIDASE，PO）在甲壳动物中酚氧化酶PHENOLOXIDASE,PO一般以无活性的酶原形式酚氧化酶原（PROPHENOLOXIDASE，PROPO）存在3。在甲壳动物中还存在一种酶叫丝氨酸型蛋白酶，其本身也是以酶原的形式存在，不显示活性，但是容易被真菌和细菌等的细胞壁成分激活4。丝氨酸型蛋白酶被激活后，在其作用下无活性的酚氧
8、化酶原（PROPO）转变成具有活性的酚氧化酶（PO）。酚氧化酶及其激活因子构成了一个复杂的酶级联反应系统，即所谓的酚氧化酶原激活系统（PROPHENOLOXIDASEACTIVATEDSYSTEM，PROPOAS）。这个系统由蛋白酶、PO、蛋白酶的抑制剂和模式识别蛋白组成57。该系统能被微生物的表面分子所识别，因为已有研究显示PROPOAS能被微生物的细胞壁成分如1，3葡聚糖、革兰氏阴性菌的LPS、革兰氏阳性菌的肽聚糖等激活。在PROPOAS活化过程中还产生一些对于生理活动非常重要的物质，它们可以参与宿主的免疫防御反应，包括促进血细胞吞噬作用、提供调理素、产生杀菌物质、包囊作用和结节形成以及介
9、导凝集和凝固等。酚氧化酶又称为酪氨酸酶（TYROSINASE），它是一种含铜的酶，能够催化单酚羟化成二酚（如多巴），并把二酚氧化成醌；醌在非酶促条件下形成最终的反应产物黑色素8。单从两者所起的生理作用来看，两者并无区别，但是了解了两者的DNA序列后，发现并不完全一样，酚氧化酶缺乏酪氨酸酶的信号肽和跨膜域的氨基酸序列，并且酚氧化酶存在于大部分的脊椎动物和无脊椎动物和中。科研工作者已经从多种动物中纯化并鉴定了酚氧化酶。根据种类的不同，其分子量、最适温度、最适PH、抑制剂和激活剂等也不相同。从已有的以无脊椎动物为实验对象的研究来看，酚氧化酶大部分以无活性的酚氧化酶原形式存在，可被外源性的激活剂和内源
10、性的激活系统如有机溶剂或去污剂、蛋白酶等激活。还有研究结果表明9对PROPO有激活作用的蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳酶、胰蛋白酶和组织蛋白酶等；去污剂有十六烷基氯化吡啶CETYLPYRIDINIUMCHLORIDE，CPC和十二烷基硫酸钠SODIUMDODECYLSULFATE，SDS；对PROPO有激活作用的微生物细胞壁成分包括LPS、酵母聚糖、1，3葡聚糖和肽聚糖；另外，金属离子MG2、CA2等也能激活酚氧化酶原系统，加热也有一定的效果。夜蛾血浆中的PROPO可被甲醇激活。在两栖类中，光线也可以激活酪氨酸酶原。根据激活剂对酚氧化酶原的激活机理不同，昆虫的酚氧化酶原激活系统可以分为两种形
11、式，一种是去污剂激活，另一种是酶原的蛋白裂解。HALL7等发现昆虫MANDUCASEXTA血淋巴中纯化的PROPO通过这两种模式都可以激活。在蟑螂中，内源性的凝集素能诱导酚氧化酶原的激活。在马蹄蟹中，磷脂诱导粗制品中酚氧化酶的激活10。有关微生物多肽对酚氧化酶原的激活作用，有人认为它也许与特异性的血浆蛋白结合，以一种尚未知晓的方式，诱导酚氧化酶原激活酶的活化，最终导致酚氧化酶原的激活11。这些激活反应的生化机理尚待进一步探索。大量的实验结果都验证了一点，即酚氧化酶原的激活系统可能包含其它因子。比如在海鞘的研究中，用大豆胰蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶的抑制剂如苯嘧啶处理血细胞溶解物的上清液12。结
12、果发现这两种抑制剂并不能完全的抑制激活剂的刺激作用，只是降低了酚氧化酶的活力，大概降低了20。这暗示着LPS对海鞘血细胞酚氧化酶的激活作用中可能还包括其它未被考虑到的物资的参与。这说明PO是一种含铜的酶，是铜的螯合剂能够特异性地抑制酚氧化酶活性。托酚酮、苯硫脲和二乙基二硫氨基甲酸钠等均被用来作为PO的特异性抑制剂13。12十二烷基硫酸钠SODIUMDODECYLSULFATE，SDS十二烷基硫酸钠SODIUMDODECYLSULFATE，SDS是一种常见的极易溶于水的阴离子表面活性剂。广泛应用于液体洗涤剂及化学试剂的工业生产中，在生化实验及免疫检验中常用作助溶剂和蛋白质变性剂。SDS污染物随着
13、工业废水及生活污水被排入水体中，对水生生物具有潜在的毒性作用。已有研究报道显示，SDS等表面活性剂对哺乳动物有致毒作用14。近年来已有非常直观的数据显示随着工业化的发展以及人民生活水平的提高。SDS的生产量以及使用量相较于以前有了非常大的增长，随之而来的是SDS的排放量不断增加，当浓度达到一定程度之后必然对生态以及生物造成影响。当然这个影响是全方面的，其对三疣梭子蟹酚氧化酶原的影响自然是相关科研工作者比较感兴趣的。已有报到显示SDS对节肢动物的酚氧化酶原有比较强的激活作用，但是具体到三疣梭子蟹则没有相关的报道。13胰蛋白酶在脊椎动物中，胰蛋白酶做为蛋白酶的一种，主要起消化酶的作用。在胰脏中酶的
14、前体胰蛋白酶原被合成并分泌，之后受到胰蛋白酶或肠激酶限制分解成为活化胰蛋白酶。它不仅能起消化酶的作用，而且还能限制分解磷脂酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶原等其它酶的前体，起到一定程度的活化作用。具有非常强的特异性，是决定氨基排列时不可缺少的工具15。胰蛋白酶在体内扮演着非常重要的角色，它的含量的多少以及活性的强弱直接影响生物体的生理状态，是一种非常重要的酶。而酚氧化酶原在体内也存在并具有特别重要的意义，因此胰蛋白酶对酚氧化酶原有没有激活作用自然是相关科研工作者比较关注的问题，已经有研究报告显示在有些节肢动物中有比较显著的激活作用，而在另一些节肢动物中则显得不难么明显，而在三疣梭子蟹中的相关科研报到则
15、未见报道。2材料与方法21试验材料三疣梭子蟹购买于宁波水产大世界，体重约110G甲壳长度平均4CM，为雌性野生三疣梭子蟹。选取健康，活动力强，步足完整的三疣梭子蟹做为实验对象。22试剂十二烷基硫酸钠、LDOPA等试剂购买于上海SANGON生物工程有限公司。抗凝剂（450MMOL/LNACL，100MMOL/L葡萄糖，30MMOL/L柠檬酸三钠，26MMOL/L柠檬酸，PH745）。裂解液为SSS（SHRIMPSALTSOLUTION，450MMOL/LNACL，10MMOL/LKCL，10MMOL/LHEPES，PH73）。23方法231三疣梭子蟹抗凝血淋巴样品的制备用以实验的三疣梭子蟹放置于
16、冰上，用吸水纸擦干蟹体表水分，在第五步足基关节处用5ML一次性无菌注射器取血液淋巴，针头插入深度约05CM，使抽取的血液淋巴与抗凝剂11混合16。因为本实验所需要的样品需求量较大，所以一次试验需要多只身体健全的三疣梭子蟹，具体到本实验一次需要3只三疣梭子蟹，这样能确保满足实验需要的量。232血浆样品的制取取通用抗凝血淋巴样品，不同三疣梭子蟹的样品在混合均匀后4下1000R/MIN离心10MIN，取蓝色上清液，保存于20冰箱中，作为血浆样品17。233血细胞溶解产物的制取将沉于底部的血细胞用SSS透析过夜，细胞溶液与SSS溶液体积比为110。下层沉淀的细胞用抗凝剂离心洗涤1次，再用SSS离心洗涤
17、1次，最后将沉淀的细胞用SSS制成悬液（体积比15）。在4下20000R/MIN离心20MIN，取上清液即为血细胞溶解产物（HLS）。立即放入20度冰箱中保存。234用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度小牛血清白蛋白标准溶液的配制准确称取牛血清白蛋白104MG，用蒸馏水定溶至100ML，配成104G/ML的标准溶液，置于4冰箱中备用。考马斯亮蓝G250溶液的配制准确称取考马斯亮蓝G25060MG，溶于100ML30G/L的过氯酸溶液中，用滤纸过滤，将滤液置于棕色试剂瓶中备用。在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液00、02、04、06、08、10、12、14ML，加蒸馏水至2ML，配制成浓度为00、
18、104、208、312、416、502、624、728G/ML的蛋白质标准溶液18，然后在各支试管中分别加入20ML考马斯亮蓝G250溶液，摇匀，在595NM波长处测定吸光度，以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，写出回归方程。加入1ML血浆溶液到5MLEP管中，加入20ML考马斯亮蓝G250溶液，用蒸馏水定容至40ML，摇匀，在室温下反应10MIN，以空白作参比溶液，用751GD型分光光度计于595NM波长处测定样品组的吸光度。据此算出血浆溶液中的蛋白质含量。计算血细胞裂解产物中的蛋白质含量方法同上。235三疣梭子蟹血浆样品酚氧化酶活性的测定PO活性测定采用分光
19、光度法，通过测定底物L多巴（33，4DIHYDROXYPHENYLLALANINE被氧化形成多巴色素DOPACHROME过程中光密度的变化来进行定量研究。实验中PO活性的测定使用分光光度计，使用分光光度计记数之前应先预热20分钟。以LDOPA为底物，将06ML血浆样品与2MLSSS溶液在室温（25）黑暗条件下预先孵育30MIN，然后加入1MLLDOPA（2MG/ML）溶液，孵育10MIN后，加04ML蒸馏水后立即放入分光光度计中，在490NM下每间隔2MIN测定光密度值（OD），共测定30MIN。当测定SDS与胰蛋白酶对酚氧化酶活力影响时，只需把2MLSSS溶液换成对应的2MLSDS（01MO
20、L/ML）与2ML01MOL/ML胰蛋白酶溶液，其它操作步骤都一样。为了确保试验的准确性必须用相同的血浆样品并且一次试验完成。236三疣梭子蟹血细胞溶解产物的酚氧化酶活性测定以LDOPA为底物，将06ML血细胞溶解产物样品与2MLSSS溶液在室温（25）黑暗条件下预先孵育30MIN，然后加入1MLLDOPA（2MG/ML）溶液，孵育10MIN，加04ML蒸馏水后立即放入分光光度计中，在490NM下每间隔2MIN测定光密度值（OD），共测定30MIN。当测定SDS与胰蛋白酶对酚氧化酶活力影响时，只需把2MLSSS溶液换成对应的2MLSDS01MOL/ML与2ML01MOL/ML胰蛋白酶溶液，其它
21、操作步骤都一样。237数据处理采用MICROSOFTEXCEL2003和SPSS130FORWINDOWS软件进行统计分析，数据均以“平均值标准误差”表示，差异分析采用T检验，P005）。有研究文献表明，SDS活化酚氧化酶原的主要原理是通过与酚氧化酶原直接结合，使蛋白去折叠，导致酚氧化酶原构象发生变化，暴露其活性位点，在这栋情况下，酚氧化酶原被激活了22。这个原理与1，3葡聚糖、LPS和肽聚糖等其它化合物是有很大的不同的。本实验的结论是SDS可以显著的激活酚氧化酶原，可以非常明显的提高酚氧化酶的活力，这和已经有报道的结果是相似的。可能胰蛋白酶自身无法直接激活酚氧化酶原，所以胰蛋白酶对三疣梭子蟹
22、体内的酚氧化酶原激活作用不明显，这和以斑节对虾PENAEUSMONODON为实验对象的实验结果相似。但也有报道显示23胰蛋白酶对克氏原螯虾PROCAMBARUSCLARKII和圣保罗对虾PENAEUSPAULENSIS的酚氧化酶原激活作用明显（P005），而HLS中添加胰蛋白酶或SDS后（表2），HLS中PO活力显著高于对照HLS中PO的活力（P005）。故由本实验可以得出三疣梭子蟹中的PROPO系统主要存在于血细胞中。5结论经过对三疣梭子蟹血浆中以及血细胞溶解产物中酚氧化酶活力的测定，可以知道酚氧化酶原激活系统主要存在于血细胞中，根据本实验的操作得出胰蛋白酶对酚氧化酶活力的影响不显著，这方面
23、的原因有待于进一步的研究，SDS对酚氧化酶活力的提升有显著的影响。从SDS能使PO活力巨增这一结果，可以认为PO在正常条件下，主要是以PROPO形式存在于血细胞中，只有在受到某些因子的刺激或激活时，PROPO才以PO的形式释放到血淋巴液中。参考文献1王雷,李光友甲壳动物的体液免疫研究进展J海洋科学,1992,318192夏栋,卞疆龙虾多酚氧化酶的纯化及其部分生化特性J江苏食品与发酵,2000,116193赵东海,张建平,侯菊花蘑菇中多酚氧化酶的酶学特性研究J食品与机械,2004,20512174张明辉,陆宏达中华绒螯蟹血淋巴液抗凝剂的筛选J水产科技情报,2005,32（增刊）93995陆宏达,
24、张明辉中华绒螯蟹血细胞数及离体后形态学变化J水产学报,2006,3044444626孙虎山,李光友栉孔扇贝血淋巴中酚氧化酶和髓过氧物酶活力J中国水产科学,1999,629137黄辉洋,李少菁,王桂忠甲壳动物酚氧化酶活力及其在养殖中的应用J海洋通报,2000,19379848章跃陵,王三英,彭宣宪虾类免疫学的基础和应用研究J海洋科学,2000,24（12）26299章跃陵,王三英,刘光明南美白对虾血蓝蛋白对酚氧化酶活性的影响J中国水产科学,2005,12（4）40240610章跃陵,陈俊,林伯坤,等南美白对虾血蓝蛋白血细胞凝集活性初探J汕头大学学报自然科学版,20053485311冯从经,杜宇州
25、,陆自强,等亚洲玉米暝幼虫血清中酚氧化酶原的性质J昆虫学报,2005,48564965412JUNWAH,YYANG,AWANGRECONSIDERATIONOFPHENOLOXIDASEACTIVITYDETERMINATIONINWHITESHRIMPLITOPENAEUSVANNAMEIJFISHSHELLFISHIMMUNOLOGY,2010,2824024413陈丽娇,郑明锋,李怡宾南美白对虾多酚氧化酶的生化特性J福建农林大学学报自然科学版,2004,33（3）37738014YILIANGW,LPINGPAN,SLIYU,HHANGLICLONING,MICROBIALEXPRES
26、SIONANDSTRUCTUREACTIVITYRELATIONSHIPOFPOLYPHENOLOXIDASESFROMCAMELLIASINENSISJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2010,145667215樊廷俊,汪小锋中国对虾酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质J生物化学与生物物理学报,2002,34558959416孟凡伦,张玉臻,孔键,等甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统研究评价J海洋与沼,1999,30111011617罗日祥,姜玉香,李光友中国对虾细胞中酚氧化酶活力研究J海洋科学,1996（6）1318李义温度PH对日本沼虾血清酚氧化酶活力及稳定性的影响J海洋科学
27、,2002,26（10）1319孙兆峰,王雷中国明对虾和凡纳滨对虾血清酚氧化酶活性的研究J高技术通讯,2001（12）242720沈锦玉,刘问,曹铮,等免疫增强剂对中华绒鳌蟹免疫功能的影响J浙江农业学报,2004,16（1）252921彭涤非,钟彩虹,王仁才桃多酚氧化酶的纯化及其特性J湖南农业大学学报（自然科学版）,2004,30（3）25125622宗亦臣冬枣果实中酚类物质及其多酚氧化酶性质的研究J中国农学通报2004,2（4）979823赵欣平,舒畅,杨芳,等金属离子和脲对白蜡虫碱性磷酸酶的影响J昆虫学报,2002,45（2）31832224于新,黄小丹,冯彤,等草菇酚氧化酶及过氧化物酶特性的研究J仲恺农业技术学院学报,1998,1132733樊廷俊,汪小锋中国对虾酚氧化酶的分离纯化及其部分生物化学性质J生物化学与生物物理学报,2002,345589594
