1、本科毕业论文系列开题报告食品科学与工程乳酸菌发酵生产共轭亚油酸基本条件的优化一、选题的背景与意义目前，养殖鱼类的重要问题之一是鱼体沉积大量的脂肪组织。通过人工投喂营养平衡的饲料来进行营养调控是一种相对安全而且有效的降脂途径。近年来，共轭亚油酸CLA被誉为“奇异天然营养素”，经研究发现CLA具有减少脂肪累积和改变脂肪代谢，抑制肿瘤和动脉粥样硬化，增强机体免疫等功能，但其来源有限且动物不能自行合成。如果在饵料中直接添加CLA会大大提高饵料成本，因此通过发酵法生产富含CLA的豆粕并用于饲料的合成就具有重大的现实意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1研究的基本内容（1）采用植物乳杆菌固态发酵法生
2、产功能性发酵豆粕，利用其催化葵花籽油中的亚油酸转化为共轭亚油酸CLA，并以功能性发酵豆粕为饵料蛋白源之一合成鱼饲用饵料。（2）发酵条件的确定从时间，接种量，黄豆粉添加量三个方面探讨其产CLA的最适条件。2拟解决的主要问题（1）优化发酵条件，提高产共轭亚油酸能力。（2）从发酵液中提取共轭亚油酸，对其含量进行测定。（3）以功能性发酵豆粕为原料之一制备饵料。三、研究的方法与技术路线1研究的方法1通过单因素实验，分析发酵过程中时间，接种量，黄豆粉添加量对产共轭亚油酸的影响。2运用紫外分光光度计在波长234NM处测定发酵液中CLA的含量，并用气相色谱法作对照以消除其他有机物对CLA测定时的干扰。2技术路
3、线四、研究的总体安排与进度2010年11月12月1查找相关文献，确定实验方案；2撰写开题报告和文献综述。3翻译外文文献。2011年1月4月1准备好实验中所用的仪器和试剂；2进行本课题的相关实验。2011年5月1处理实验数据，完成并提交本课题的毕业论文。2论文答辩。五、主要参考文献1JONESELCHETNICAL,PHYSICAL,ANDSENSORYPROPERTIESOFDAIRYPRODUCTSENRICHEDWITHCONJUGATEDLINOLEICACIDJJDAIRYSCI,2005,888292329372PARIZAMWCONJUGATEDLINOLEIEACID,ANEWL
4、YRECOGNIZEDNUTRIENTJCHEMISTRYINDUSTRY,1997,124644663PARKY,ALBRIGHTKJ,STORKSONJ1,ETA1CHLLNGE8INBODYCOMPOSITIONINMICEDURINGFEEDINGANDWITHDRAWOFCONJUGATEDLINOLEICACIDJLIPIDS,1999,3432342484PARKY,ALBRIGHTKJ,STORKSONJM,ETA1EFFECTOFCONJUGATEDLINOLEICACIDONBODYCOMPOSITIONINMICEJLIPIDS,1997,3288538585OSHEAM
5、,SLANTONCANTIOXIDANTENZYMEDEFENSERESPONSESOFHUMANMCF7ANDSW480CANCERCE11STOCONJUGATEDLINOLEICACIDJANTICACERRES,1999,19195319596CHINSF,STORKSONJM,LIUW,ETA1DIETARYSOURCESOFCONJUGATEDDIENOICISOMERSOFLINOLEICACID，ANEWLYRECOGNIZEDCLASSOFANTICARCINOGENSJFOODCOMPANA1,1992,51851977MICHIHIROSUGANO,AKIRAJSUJIT
6、A,MASAOYSMASAKI,ETA1CONJUGATEDLINOLEICACIDMODULATESTISSUELEVELSOFCHEMICALMEDIATORSANDIMMUNOGLOBULINSINRATSJLIPIDS,1998,3355215278HAYEKMG,HANSN,WUNDY,ETA1DIETARYCONJUGATEDLINOLEICACIDINFLUENCESTHEIMMUNERESPONSEOFYOUNGANDOLDC57BL/6NERLBRMICEJNULR,1999,12932389STEVENA,WEMER,LLOYD0LUEDECKE,ETA1DETEMAINA
7、TIONOFCONJUGATEDLINOLEICACIDCONTENTANDISOMERDISTRIBUTIONINTHREECHEDDARTYPECHEESESEFFECTOFCHEESECULTURESPROCESSING,ANDAGINGJAGRICFOODCHEM,1992,40101817182110TILAKRDHIMAN,SHAHIDUZZAMAN,KENNETHCOLSONETALINFLUENCEOFFEEDINGSOYBEANOILONCONJUGATEDLINOLEICACIDCONTENTINBEEFJJAGRICFOODCHEM,2005,53,68468911ZUB
8、EYDEBAYSAL,FIKRETUYAR,CETINAYTEKINSOLIDSTATEFERMENTATIONFORPRODUCTIONOFAMYLASEBYATHERMOTOLERANTBACILLUSSUBTILISFROMHOTSPRINGWATERJPROCESSBIOCHEMISTRY,2003,381665166812邵群,边际,马丽等乳酸菌发酵产生共扼亚油酸条件的研究J山东师范大学学报自然科学版,2001,164444513张亚刚,樊莉,文彬等紫外可见分光光度法在共扼亚油酸定量分析中的应用J新疆石油学院学报,2002,144323514陈忠周,李艳梅,赵刚,等共轭亚油酸的性质及
9、合成J中国油脂,2OOO,255414515郑玉梅奶及奶制品中C9,T11CLA检测方法的建立及氧化稳定性的研究D哈尔滨医科大学博士论文,200216吴冀华,裘爱泳气相色谱法分析共扼亚油酸异构体J中国油脂,2002,21656817YAMASAKIM,KISHIHARAK,IKEDAIETALARECOMMENDEDESTERIFICATIONMETHODFORGASCHROMATOGRAPHICMEASUREMENTOFCONJUGATEDLINOLEICACIDAOCS199918王小静毛细管气相色谱法测定乳脂中的CIS9,THRANS11共轭亚油酸J色谱,2006,0664564719R
10、OACHJAG,MMMOSOSOBA,MPYURAWECZ,ETALCHROMATOGRAPHICSEPARATIONANDIDENTIFICATIONOFCONJUGATEDLINOLEICACIDISOMERSJANALYTICACHIMICAACTA,2002,46515215620薛英本不同来源CLA抑制小鼠前胃癌及其对B16MB转移特性影响的研究D哈尔滨医科大学博士论文,2001毕业论文文献综述食品科学与工程CLA的生理功能及其合成检测方法的研究摘要共轭亚油酸是一系列位置和几何异构体的总称，其中的活性异构体具有多种重要的生理功能，近年来已成为研究热点。本文简单概括了活性共轭亚油酸异构
11、体的主要生理功能、CLA的合成方法机理及分析检测方法。关键词共轭亚油酸；生理功能；合成；检测方法共轭亚油酸（CONJUGATEDLINOLEICACID，以下简称CLA），又称共轭二烯亚油酸,是指在碳9、碳11或碳10、碳12位具有双键的亚油酸（LINOLEICACID，以下简称LA）的位置和几何异构体。在众多CLA异构体中,CIS9，TRANS11十八碳二烯酸（C9,T11CLA）,和TRANS10,CIS12十八碳二烯酸（T10,C12CLA）被认为是具有生理活性的种异构体,尤其是C9,T11CLA,被认为是最具生理活性的异构体，主要存在于反刍动物的乳制品和肉制品【1】。1CLA的生理功能
12、CLA能参与脂肪的分解和新陈代谢24，诱导能量利用，导致体重下降且不储存脂肪，缓和免疫反应的副作用，还可以提高人体的某些生理功能。11抗癌作用对实验老鼠进行研究发现，CLA能减少致癌物引起的皮肤癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌和胸腺癌等5。生理浓度的CLA可以杀死或抑制用人类恶性黑素瘤、结肠癌和胸腺癌的培养细胞。另外，CLA还能调节细胞色素P450的活性，抑制癌过程涉及到的鸟氨酸脱羧酶、蛋白激酶C等酶的活性，以及抑制癌细胞中蛋白质和核酸的合成6。总结众多的有关CLA抗癌文献报导，其抗癌作用主要通过以下几个方面起作用抑制化学致癌剂与DNA的附加体形成；抑制细胞毒素LTB4以及内毒素IL等的产生；增强免疫
13、效果；抑制持有雌激素受体的癌细胞增殖作用等等。总之，有关CLA的抗癌研究还在进一步深入之中。12抗粥状动脉硬化作用研究表明，饲喂含CLA饲料的田鼠和兔子，其主动脉壁上的病灶逐渐变小变薄，血液中总胆固醇水平及坏胆固醇水平均较低，大动脉中动脉硬化概率小3。另有报道，CLA能阻止脂肪和血小板在粥状病变的动脉壁上沉积，这可能是CLA抗粥状动脉硬化的重要原因，其作用是亚油酸的5倍2。13提高机体免疫力和改善骨组织代谢的作用研究表明，CLA能促进细胞分裂、阻止肌肉退化、延缓机体免疫力的衰退7采用有丝分裂促剂（MITOGEN）刺激摄食CLA的白鼠脾脏淋巴细胞，结果发现天然吞噬细胞活性及前列腺素（PGE2）的
14、产生几乎没有影响，而白介素2细胞和T细胞的增殖反应却有所增加。由此可见，CLA可能具有促进脾的白介素2细胞和T细胞繁殖的作用8，也就是说有提高机体免疫力的作用。CLA你呢个促进骨组织的分裂和再生，促进软骨组织细胞的合成及矿物质在骨组织中的沉积，对骨质的健康有积极作用。这可能是PGE2浓度调节的结果，PGE2浓度过高能抑制骨质的合成，而CLA能有效降低PGE2的浓度，因而能促进骨质的形成。14抗氧化作用CLA具有抗氧化性，其共轭双健更易氧化，抗氧化性与花生四烯酸类似。实验发现，CLA的氧化速率与二十二碳六烯酸类似，比亚油酸、亚麻酸要快。15其他方面的作用除上述功能以外，动物实验中还发现CLA具有
15、其他一些保健功能，如降低胆固醇合抗血栓的作用。另外，CLA还具有提高饲料效价、防霉变的作用，其钠盐可以抑制霉菌生长，无毒副作用，性质相对稳定9。随着有关研究的进一步深化，CLA对人体健康产生积极影响的生理机制功效将会逐渐被揭开。2CLA的合成方法由于CLA的独特生理作用，最近20年引起了人们的关注。目前，CLA工业化生产采用化学异构法，主要是利用碱法生产,即亚油酸在强碱条件下异构化为CLA,但其产物中异构体组成复杂，不利于在食品和医药方面使用。而由生物法转化亚油酸生成的CLA，产物中异构体组成单一，产品安全性较高，有很好的应用前景。21生物转化的菌种CLA的微生物生产主要以细菌为主。研究人员发
16、现，在特殊的培养基、脱脂乳或全脂乳条件下，许多的乳杆菌、乳酸球菌和链球菌菌株能够利用亚油酸产生CLA，但是也有部分菌株并没有这样的活性。目前发现的能通过LA生物异构化生成CLA的菌种主要是一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌。目前，人们通过给奶牛饲喂富含亚油酸的饲料，在奶牛胃肠道微生物的作用下，可以显著提高牛奶中CLA的含量10，该类富含CLA的乳及乳制品具有很好的贮藏和感官特性。然而，瘤胃菌的培养需要严格的厌氧条件，培养困难，给菌株的筛选和生产应用带来较大的困难。而丙酸细菌从亚油酸代谢生成共轭亚油酸的能力是与菌株相关的。此外，游离亚油酸的质量浓度和培养基种类不同，对丙酸细菌生成CAL的能力也有很大的影
17、响。由于乳酸菌兼性厌氧，培养条件易于控制，无毒安全，同时乳酸菌含有的亚油酸异构酶对作用底物具有很强的专一性，而且大多数乳酸菌又是一种人体益生菌，可以直接将其应用于食品、保健品,还可以通过固态发酵11提高饲料中CLA的含量。相比之下，乳酸菌更适合工业化生产CLA。22生物转化的机理近年来的研究表明，生物合成共轭亚油酸的途径主要有2种，一种是亚油酸异构酶先作用于亚油酸使之发生异构化，生成CLA，接着氢化酶作用于CLA使之最终氢化为硬脂酸，这种途径常见于瘤胃细菌生物转化CLA的过程；另一种是亚油酸不从非共轭双键经一步异构化而成为共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，然后进一步脱水形成CLA，
18、这种途径则常见于乳酸菌生物转化CLA的过程。亚油酸异构酶是一种膜结合蛋白,可以以细胞形式发生催化反应,产生的共轭亚油酸大多在胞内以游离形式存在,也可以分离出膜后发生催化反应，是一种与细菌生长无关的诱导酶。它来源于多种细菌、真菌，在很多乳酸菌中也存在。23转化条件的研究菌种是微生物转化的产生差异的重要条件，不同的菌株转化LA生成CLA的能力不同，需要的培养基不同，其转化结果也不尽相同。其他的影响因素还有反应时间、温度、PH、LA添加量、接种量等。231反应时间对生物转化CLA的影响反应时间的长短会对生物转化CLA产生直接影响，若反应时间太短，则CLA的积累不充分；若反应时间太短，则CLA易被氧化
19、。因此需要控制好异构化反应的时间，对其不同时间段的生物转化CLA进行研究。232反应温度对生物转化CLA的影响反应温度对酶催化转化反应的影响有2个方面随着温度的升高，活化分子数增多，酶反应速度加快，促进酶转化反应；随着温度的升高，酶蛋白逐步变性失活，酶的活性随之降低，减弱转化效果。233反应缓冲液PH值对生物转化CLA的影响在微生物细胞生物转化的反应过程中，反应体系的PH值不但会影响酶蛋白的构型和酶的稳定性，以及酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态，还会影响涉及氧化还原反应的辅酶体系和反应中氢的传递及电子的转移。在最适PH值条件下，酶催化转化反应的活性最佳，转化效果最好，高于或低于此
20、PH值时，酶的活性会下降。234LA添加量对生物转化CLA的影响但是LA对革兰氏阳性菌又具有明显的抑制作用。当LA浓度过低时，诱导生成的酶少，对CLA的转化有阻碍作用；当LA浓度过高时，细胞也会受到抑制而停止生长。235接种量对生物转化CLA的影响接种量较小时，LA对细胞存在明显的抑制现象，转化的CLA含量很低；增大接种量，LA对细胞的抑制现象减弱，就会增加产物CLA的含量；当接种量增加到足够大时，所有细胞都与底物结合反应，反应充分，此时CLA含量最大；继续增加大接种量，底物反应完全，但并不能增加产物CLA的产量。3CLA检测方法31紫外UV检测法紫外分光光度法是利用共扼亚油酸所含有的共扼双键
21、在紫外区处有特征吸收峰,而亚油酸却没有的特点,故色谱上常在这个波长下检测的存在及含量1213。改方法检测成本最低、操作简便快速,检测结果为各种CLA异构体的总和，适合于单一异构体转化产物的高通量操作。32红外IR检测法在9OO1000CM1的红外区，CLA的各种异构体在不同的波长处有吸收峰，借此可检测各种异构体的含量14。33高效液相色谱法HPLC高效液相色谱法也能用于共扼亚油酸的分离检测。如以CH3CNH2O8515V/V为洗脱液,可在C8柱或C18柱上对共扼亚油酸甲脂进行分离,但无法使共扼亚油酸的异构体分开14。现已发展起来一种新的色谱分析方法,即银离子高效液相色谱法,它是分离饱和度不相同
22、的同系物的有效方法。在流动相中添加银离子后,可降低带有不饱和双键化合物的保留时间。银离子是电子接受体,能选择性地与化合物的双键作用,形成银的键络和物,从而改变化合物的存在形式和分配平衡浓度,使其亲水性增强,保留时间减少15。这种亲和能力和极性的差异导致化合物在固定相和流动相中的分配特性不同,因此提高了分析灵敏度和分离的选择性,可把大部分共扼亚油酸异构体分开,但无法使C9,C11,异构体与其他9,11异构体分开16。此法适合于生物转化产物脂肪酸组成较复杂的反应体系。34气相色谱法（GC）GC是传统用来分析脂肪酸的方法。因为它具有快速、高效、灵敏的优点。对于GC分析,脂肪酸应该转化成非极性的挥发性
23、的衍生物,比如脂肪酸甲脂。常用的甲脂化方法有BF3/CH3OH,H2SO4/CH3OH,HCL/CH3OH17。对于常规的脂肪酸分析,通用的或普通的填充柱或毛细管柱就可以满足要求。而共扼亚油酸各异构体的分析,对色谱柱的要求则有所不同。几乎所有涂有极性固定液的色谱柱在分析时都能得到共扼亚油酸相对于其他组分的总含量。该方法对有生理活性的C9,T11CLA和T10,C12CLA异构体分离效果好,较适用于生物转化生成专一性活性异构体的反应,此法也能将活性异构体和其他副产物如羟基脂肪酸酸HY18进行分离。35气质联用法GCMS色谱法虽有其独特的分离功能,但对未知物的定性分析,往往由于标准品不易求得,给分
24、析带来了困难,而质谱法在定性方面的特殊作用,使得GC/MS联用法发展起来,二者联用后可达到相辅相成的效果,所得分析结果准确可靠19，但是对样品的处理要求较高,操作较复杂。36核磁光谱法核磁共振光谱法是基于元素的原子核在很强的外磁场的作用下,发生能级分裂,对相应能量的电磁辐射产生共振吸收现象而建立起来的分析方法,主要应用于有机结构分析。13C核磁光谱法用于鉴定和定量CLA混合物中的同分异构体,结果与GC/MS法一致,可分析混合物中7,9,8,10,9,11,10,12,11,13182的CC,CT,TC,TT同分异构体，核磁共振的主要优点是可以给CLA混合物中的不同构象的同分异构体定量20。参考
25、文献1JONESELCHETNICAL,PHYSICAL,ANDSENSORYPROPERTIESOFDAIRYPRODUCTSENRICHEDWITHCONJUGATEDLINOLEICACIDJJDAIRYSCI,2005,888292329372PARIZAMWCONJUGATEDLINOLEIEACID,ANEWLYRECOGNIZEDNUTRIENTJCHEMISTRYINDUSTRY,1997,124644663PARKY,ALBRIGHTKJ,STORKSONJ1,ETA1CHLLNGE8INBODYCOMPOSITIONINMICEDURINGFEEDINGANDWITHDRA
26、WOFCONJUGATEDLINOLEICACIDJLIPIDS,1999,3432342484PARKY,ALBRIGHTKJ,STORKSONJM,ETA1EFFECTOFCONJUGATEDLINOLEICACIDONBODYCOMPOSITIONINMICEJLIPIDS,1997,3288538585OSHEAM,SLANTONCANTIOXIDANTENZYMEDEFENSERESPONSESOFHUMANMCF7ANDSW480CANCERCE11STOCONJUGATEDLINOLEICACIDJANTICACERRES,1999,19195319596CHINSF,STORK
27、SONJM,LIUW,ETA1DIETARYSOURCESOFCONJUGATEDDIENOICISOMERSOFLINOLEICACID，ANEWLYRECOGNIZEDCLASSOFANTICARCINOGENSJFOODCOMPANA1,1992,51851977MICHIHIROSUGANO,AKIRAJSUJITA,MASAOYSMASAKI,ETA1CONJUGATEDLINOLEICACIDMODULATESTISSUELEVELSOFCHEMICALMEDIATORSANDIMMUNOGLOBULINSINRATSJLIPIDS,1998,3355215278HAYEKMG,H
28、ANSN,WUNDY,ETA1DIETARYCONJUGATEDLINOLEICACIDINFLUENCESTHEIMMUNERESPONSEOFYOUNGANDOLDC57BL/6NERLBRMICEJNULR,1999,12932389STEVENA,WEMER,LLOYD0LUEDECKE,ETA1DETEMAINATIONOFCONJUGATEDLINOLEICACIDCONTENTANDISOMERDISTRIBUTIONINTHREECHEDDARTYPECHEESESEFFECTOFCHEESECULTURESPROCESSING,ANDAGINGJAGRICFOODCHEM,1
29、992,40101817182110TILAKRDHIMAN,SHAHIDUZZAMAN,KENNETHCOLSONETALINFLUENCEOFFEEDINGSOYBEANOILONCONJUGATEDLINOLEICACIDCONTENTINBEEFJJAGRICFOODCHEM,2005,53,68468911ZUBEYDEBAYSAL,FIKRETUYAR,CETINAYTEKINSOLIDSTATEFERMENTATIONFORPRODUCTIONOFAMYLASEBYATHERMOTOLERANTBACILLUSSUBTILISFROMHOTSPRINGWATERJPROCESSB
30、IOCHEMISTRY,2003,381665166812邵群,边际,马丽等乳酸菌发酵产生共扼亚油酸条件的研究J山东师范大学学报自然科学版,2001,164444513张亚刚,樊莉,文彬等紫外可见分光光度法在共扼亚油酸定量分析中的应用J新疆石油学院学报,2002,144323514陈忠周,李艳梅,赵刚,等共轭亚油酸的性质及合成J中国油脂,2OOO,255414515郑玉梅奶及奶制品中C9,T11CLA检测方法的建立及氧化稳定性的研究D哈尔滨医科大学博士论文,200216吴冀华,裘爱泳气相色谱法分析共扼亚油酸异构体J中国油脂,2002,21656817YAMASAKIM,KISHIHARAK,I
31、KEDAIETALARECOMMENDEDESTERIFICATIONMETHODFORGASCHROMATOGRAPHICMEASUREMENTOFCONJUGATEDLINOLEICACIDAOCS199918王小静毛细管气相色谱法测定乳脂中的CIS9,THRANS11共轭亚油酸J色谱,2006,0664564719ROACHJAG,MMMOSOSOBA,MPYURAWECZ,ETALCHROMATOGRAPHICSEPARATIONANDIDENTIFICATIONOFCONJUGATEDLINOLEICACIDISOMERSJANALYTICACHIMICAACTA,2002,4651
32、5215620薛英本不同来源CLA抑制小鼠前胃癌及其对B16MB转移特性影响的研究D哈尔滨医科大学博士论文,2001本科毕业设计（20_届）乳酸菌发酵生产共轭亚油酸基本条件的优化目录前言11材料和方法211实验材料2111菌种2112培养基2113溶液和试剂3114仪器312产CLA条件优化3121发酵时间对产CLA的影响3122不同接种量对产CLA的影响4123黄豆粉添加量对产CLA的影响413CLA的提取和检测4131CLA的提取4132CLA的检测414气相色谱法验证415数据处理42结果与讨论521乳酸菌的产CLA条件5211发酵时间对乳酸菌产CLA的影响5212不同接种量对乳酸菌产C
33、LA的影响6213黄豆粉添加量对乳酸菌产CLA的影响722思考与讨论73结论7致谢8参考文献8附录10摘要目的本实验利用1株经化学诱变获得的高产亚油酸异构酶突变乳酸菌株LPLANH31分泌亚油酸异构酶催化黄豆粉中的亚油酸LA转化为共轭亚油酸CLA，并对其进行了发酵基本条件的优化，以期提高菌株的产酶能力，为以后的发酵生产含CLA的功能性豆粕提供理论依据。方法通过单因素实验，对发酵产CLA的发酵时间，接种量，黄豆粉添加量进行研究分析以确定其最佳条件。结果在发酵优化中，单因素法确定了其最适产酶条件为发酵时间60H，接种量10，黄豆粉添加量35G。结论LPLANH31菌株产共轭亚油酸的最佳发酵条件是发
34、酵时间60H，接种量10，黄豆粉添加量35G。并在实验过程中发现用黄豆粉未灭菌的比灭过菌的发酵产品好，前者具有大豆清香，保存时间更长。关键词乳酸菌；共轭亚油酸；条件优化ABSTRACTOBJECTIVEINTHISSTUDY,AHIGHYIELDOBTAINEDBYCHEMICALMUTAGENESISOFLINOLEICACIDISOMERASEMUTANTSTRAINSOFLACTICACIDBACTERIALPLANH31SECRETIONOFLINOLEICACIDISOMERASECATALYZEDLINOLEICACIDINSOYBEANMEALLAINTOCONJUGATEDAS
35、IAOLEICACIDCLA,ANDITSBASICCONDITIONSFORTHEOPTIMIZATIONOFFERMENTATIONTOENHANCETHEABILITYOFENZYMEPRODUCTIONSTRAINSFORTHESUBSEQUENTFERMENTATIONOFSOYBEANMEALWITHTHEFUNCTIONALITYOFCLATOPROVIDEATHEORETICALBASISMETHODSSINGLEFACTOREXPERIMENTS,THEFERMENTATIONOFCLAFERMENTATIONTIME,INOCULUMSIZE,THEAMOUNTOFSOYF
36、LOURRESEARCHANDANALYSISTODETERMINETHEOPTIMUMCONDITIONSRESULTSOPTIMIZATIONOFTHEFERMENTATION,THESINGLEFACTORMETHODTODETERMINEITSOPTIMALCONDITIONSFORENZYMEPRODUCTIONFERMENTATIONTIME60H,INOCULUM10,SOYBEANMEALADDITIONOF35GCONCLUSIONLPLANH31STRAINOFCONJUGATEDLINOLEICACIDPRODUCEDTHEBESTFERMENTATIONCONDITIO
37、NSFERMENTATIONTIME60H,INOCULUM10,SOYBEANMEALADDITIONOF35GFOUNDINTHEEXPERIMENTTHANINSTERILIZEDWITHSOYPOWDERSTERILIZEDFERMENTATIONPRODUCTSWEREGOOD,THEFORMERWITHSOYFRAGRANCE,SAVELONGERKEYWORDSLACTICACIDBACTERIACONJUGATEDLINOLEICACIDOPTIMIZATION前言共轭亚油酸（CONJUGATEDLINOLEICACID，以下简称CLA），又称共轭二烯亚油酸,是指在碳9、碳11
38、或碳10、碳12位具有双键的亚油酸（LINOLEICACID，以下简称LA）的位置和几何异构体。CLA的立体异构体多达十几种甚至更多，其中CIS9,TRANS11CLA（C9,T11CLA）和TRANS10,CIS12CLA（T10,C12CLA）2种异构体被认为最具生物活性,特别是C9,T11CLA，这是因为C9,T11CLA是唯一能被动物细胞吸收进入其磷脂层并参与动物组织磷脂片段组成1的共轭亚油酸异构体，同时C9,T11CLA也是人们日常食物中含量最高的共轭亚油酸异构体。而T10,C12CLA和8T,10CCLA在改善人体的身体组成，减少脂肪、增加肌肉2、3等方面具有明显的效果。这些异构体
39、使CLA具有抗癌、减肥、降胆固醇、防治糖尿病、提高免疫力等功能4从而使其在医学保健品和保健食品等方面具有重要应用价值59。20世纪50年代末,一些科学家发现在反刍动物中亚油酸能被转化成C9,T11CLA,并且认为是厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶的作用。到20世纪70年代末,PARIZA等人最先发现烧烤牛肉的提取物具有抗癌作用,经过对提取物的分析最终鉴定认为抗癌成分是共轭亚油酸混合物1012。自PARIZA发现CLA具有抗癌作用以来,人们越来越关注CLA,欧洲还成立了专门研究CLA的机构13。目前，CLA工业化生产采用化学异构法2，化学方法主要是利用碱法生产,即亚油酸在强碱条件下异构化为CLA
40、,但这种方法得到的是各种CLA异构体的混合物因不同异构体生理活性的差别,要得到各种纯的异构体还要进一步分离,从而增加了分离步骤和生产成本另外,化学合成法的安全性问题受到质疑，不利于在食品和医药方面使用而生物合成法反应条件温和,产物中异构体组成较单一,与天然食品中的CLA异构体组成相似,产品安全性较高,因此具有良好的发展前景14。目前对CLA的分析采用的方法有很多,主要包括紫外分光光度法,高效液相色谱法HPLC、气相色谱法（GC）,气质联用GCMS。他们各有优缺点，比如说紫外分光光度法，其检测成本最低、操作简便快速,但是紫外检测法的检测限较高10GML，检测结果易受干扰，而且紫外检测法只能对样晶
41、中的CLA进行定量分析，并不能对样品中IA和CLA各异构体进行定性和定量分析气,也就是说其检测结果为各种CLA异构体的总和,适合于单一异构体转化产物的高通量操作；GC分析法灵敏度高、重现性好,对有生理活性的C9,T11CLA和C10,T12CLA异构体分离效果好,较适用于生物转化生成专一性活性异构体的反应,此法也能将活性异构体和其他副产物（如羟基脂肪酸HY15）进行分离,但GC分析法中样品的预处理比较复杂，需要对样品进行衍生化等处理，而且其分析样品的时间较长；AGHPLC分析灵敏度高,分离的选择性好,可将GC不能分离的各种CLA异构体进行分析,此法适合于生物转化产物脂肪酸组成较复杂的反应体系；
42、GCMS法对样品的处理要求高,操作较复杂,但其稳定性好、灵敏度高,而且可以将CLA异构体产物与其他副产物明确区分开来,给GC法检测CLA异构体的准确性予以保证。人类CLA的膳食来源主要是奶制品和反刍动物的肉制品1。每克乳脂中含量从225MG不等。这是因为反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌产生的亚油酸异构酶能使亚油酸转化为CLA，且主要以C9,T11CLA存在，而哺乳动物还能把比较多的CLA分泌到乳中。游离CLA的稳定性较差,氧化速度比亚油酸更快,在空气中氧化时很快被分解成呋喃脂肪酸16，因此需要低温、避光、真空保藏CLA样品。共轭亚油酸也少量存在于其他动物的组织、血液中，但植物中CLA含量很少
43、，海洋食品中CLA含量也很少。有人发现，发酵乳制品中的CLA含量较原料乳要高得多，且奶酪等乳制品中CLA的含量受到加工过程、贮存期的影响1718。不论是在消化道中合成还是从食物中摄取，CLA都是在肠中被吸收而分布到全身，然后结合到血脂、细胞膜及脂肪组织19中。在肠黏液、肝、脂肪组织中可以检测到共轭亚油酸。早期研究认为，CLA只能由瘤胃内溶纤维丁酸弧菌BUTYRIVIBRIOFIBRISOLVENS、埃氏巨球菌MEGASPHAERAELSDENII分泌的亚油酸异构酶氢化亚油酸而获得2021，植物中几乎不含有CLA。但后来一些学者陆续在婴儿粪便、酸奶和酸泡菜中发现费氏丙酸杆菌和乳酸菌能够分泌亚油酸
44、异构酶，可将亚油酸转化成为CLA1,22,23。一些研究还成功将乳酸菌亚油酸异构酶基因在大肠杆菌和酵母中进行了克隆表达2425。程茂基等在2006年首次在青贮饲料中检测到CLA，表明青贮中可能存在一种能将亚油酸转化成为CLA的微生物26。杜波等（2007）首次自青贮饲料中分离筛选到一株植物乳酸菌ANCLA01，能将1MG/ML亚油酸转化成3344UG/MLCLA27。豆粕是反刍动物尤其是奶牛的主要日粮组分之一，也是最重要的植物性蛋白源，其中粗蛋白含量高达4348，并有较平衡的氨基酸组成28，具有很高的利用价值。其发酵同泡菜、酸奶发酵相似，青贮过程是在缺氧或厌氧条件下的乳酸菌固态发酵29。既然青
45、贮中植物乳酸菌能够转化合成CLA，那么能否利用自然发酵技术来提高豆粕中CLA含量成为一项十分有意义的课题。为此，本文以1株经化学诱变获得的高产亚油酸异构酶突变乳酸菌株编号为LPLANH31为发酵试验菌株，豆粕为培养基，黄豆粉为底物，探讨其不同发酵时间，不同接种量和不同黄豆粉添加量对豆粕中CLA产量（因CLA标准品未到货不能绘制标准曲线，故不能对CLA进行定量测定，而是相比未发酵的豆粕进行定性测定）的影响，以进一步优化高效生产CLA的发酵培养条件，从而为CLA功能性豆粕生物调控技术提供理论依据。1材料和方法11实验材料111菌种共轭亚油酸高产菌株LACTOBACILLUSPLANTARUMH31
46、简写为LPLANH31，宁波大学食品生物技术实验室保存112培养基1种子培养基蛋白胨10G牛肉膏5G酵母粉4G葡萄糖20G柠檬酸三铵2G乙酸钠5GMGSO402GK2HPO42GMNSO4005G吐温801ML蒸馏水1000ML调节PH为70，121灭菌20MIN。种子培养基即液体筛选培养基。1种子扩大培养基萝卜汁豆芽汁体积比为15榨汁后用四层纱布过滤，滤液煮沸10分钟后再用四层纱布过滤，配制1000ML，调节PH为70，121灭菌20MIN。3发酵培养基豆粕500G黄豆粉500G蔬菜汁1000ML豆粕来自金光食品（宁波）有限公司，是大豆先经压榨法再用浸提法提取大豆油后得到的，故可认为其含油量
47、为零，进而把黄豆粉作为LA的来源。调节PH为70，121灭菌20MIN。113溶液和试剂1萃取CLA的溶剂正己烷（分析纯）国药集团化学试剂有限公司2调PH用的酸碱溶液1）1MOL/L的盐酸溶液吸取36的浓盐酸862ML，用蒸馏水溶解并定容至1000ML，得到1MOL/L的盐酸溶液2）01MOL/L的盐酸溶液1MOL/L的盐酸溶液10ML蒸馏水90ML3）1MOL/L的氢氧化钠溶液称取氢氧化钠400G，用蒸馏水溶解并定容至1000ML即可。4）01MOL/L的氢氧化钠溶液1MOL/L的氢氧化钠溶液10ML蒸馏水90ML114仪器LRH190S微电脑控制恒温恒湿培养箱广东省医疗器械厂新型电热恒温鼓
48、风干燥箱宁波江南仪器厂D37520台式低速大容量离心机MADEINGERMANYLDZX40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂SL502N电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司PHS25数显PH计上海民桥精密科学仪器有限公司WFZUV4802H紫外可见分光光度计龙尼柯（上海）仪器有限公司小型榨汁机，250ML三角瓶，10ML移液管，100ML烧杯，1000ML量筒，玻璃棒，胶头滴管，洗耳球，移液枪12产CLA条件优化121发酵时间对产CLA的影响取4个250ML的三角瓶，分别添加50G豆粕，50G黄豆粉，100ML蔬菜汁，其中一瓶不接种作为空白，其他3瓶的接种量为10，用玻璃棒搅拌
49、均匀后放到37恒温箱中培养，发酵24，36，48，60，72，84H分别取样检测CLA，确定最佳发酵温度。122不同接种量对产CLA的影响取19个250ML的三角瓶，分别添加25G豆粕，25G黄豆粉，50ML蔬菜汁，其中一瓶不接种作为空白，其他18瓶分成3组作为平行，接种量分别为2、4、6、8、10、12，用玻璃棒搅拌均匀后放到37恒温箱中培养，发酵60H后取样检测CLA，确定最佳接种量。123黄豆粉添加量对产CLA的影响取16个250ML的三角瓶，取5瓶分别加25G、30G、35G、40G、45G黄豆粉和45G、40G、35G、30G、25G豆粕，再添加50ML蔬菜汁，接种量为10，再做2组平行，另取1三角瓶加70G豆粕和50ML蔬菜汁的作为空白，用玻璃棒搅拌均匀后放到37恒温箱中培养，发酵48H和96H后取样检测CLA，确定最佳黄豆粉添加量。13CLA的提取和检测131CLA的提取从三角瓶中取2G发酵物到10ML烧杯中，加正己烷5ML，加水5ML，振荡萃取3MIN，取正己烷相离心（10000XG,4,5MIN）破除形成的乳化层，取正己烷相备测。132CLA的检测提取物用5ML正己烷溶解，在波长为233NM处测定吸光度。测定时需用石英比色皿，比色皿先用纯水洗，再用正己烷润洗，然后用样品润洗，最后才装样品，每次测定都按上述四步来
