1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全铁螯合剂对微生物的抑制作用一、选题的背景与意义食品质量与安全事件近些年不断频发，尤其是微生物引起的食物中毒事件每年都有发生。为了防止细菌、病毒和霉菌等导致的微生物危害，人们长期以来采用各种方法与各类微生物的危害进行斗争。抗菌一直是人类所关注的课题。人们将研制出的抗菌剂加入各种包装材料或食品中，抑制微生物生长或杀菌，提高食品的安全性。目前，已研制及应用的抗菌剂可归为天然抗菌剂、有机抗菌剂及无机抗菌剂。天然抗菌剂是人类最早使用的抗菌剂，它是从某些动植物体内提取出的具有抗菌活性的高分子有机物。最常用的天然抗菌剂是壳聚糖及其衍生物。季铵盐类是目前国际上使用最广泛的
2、有机抗菌剂，早在1995年KOURAIH等人就发表了关于含有不饱和烷基的季铵盐抗菌剂具有高效、广谱抗菌活性的报道。无机抗菌剂根据杀菌机理的不同，又可以分为溶出型和光催化型两种。溶出型无机抗菌剂的主要品种包括以沸石、活性炭、羟基磷灰石等为载体的银、铜、锌等金属离子无机抗菌剂。光催化型无机抗菌剂的价格极为低廉，且无毒，主要品种有锐钛型TIO2、ZNO、SIO2等。随着合成技术的不断发展，人们又开发了许多抗菌剂，在医药、食品中得到了广泛的应用。本课题选取最近新开发的CP262、CP263以及LMS系列的0609A、0512A、0612、0608A、0514A、0610C和0611，对它们的抗菌性能进
3、行全面系统地研究，并与已应用的DTPA的抗菌性能进行比较，研究出抗菌效果好的螯合剂，使得人们能有更多的选择，去更好的抗菌，这对人们的健康安全将有着重要的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1课题研究的基内容铁螯合剂对微生物抗菌效果的研究（抗菌试验；2拟解决的主要问题（1）微生物菌液浓度的控制2铁螯合剂浓度的选择3确定铁螯合剂对实验菌种的最低抑制浓度三、研究的方法与技术路线1研究方法MIC测定方法和稀释到平板法2技术路线抗菌试验37静置2小时37培养24小时37培养24小时四、研究的总体安排与进度201009201010查阅资料，撰写实验计划、熟悉基本的实验操作。201010201012完
4、成开题报告、文献综述，开题论证，2篇外文翻译及新型抗菌剂螯合能力的研究。201101201105整理数据，书写论文，完成答辩。五、主要参考文献1肖干雄微生物学及微生物检验学M天津天津科学技术出版社，19892王燕，车振明新型抗菌剂的研究进展J山西食品工业，2005，220223孙洪，夏英，陈莉，等国内外抗菌剂的研究现状及发展趋势J塑料工业，2006，34（9）144朱一凡，魏兰芬，陆龙喜，等季铵化壳聚糖抗菌剂杀菌效果观察JCHINESEJOURNALOFDISINFECTION，2008，2532362375李秀丽，朱平，董朝红新型抗菌剂壳聚糖双胍盐酸盐的抗菌性能研究J纺织科技进展，20009
5、，23234实验前准备稀释倒平板测原菌液浓度（含对照组）试管中加入80UL抑菌剂和20UL菌液（含对照组）加入900UL培养液观察，确定MIC稀释倒平板测MIC菌液浓度结果6沈东风，孔祥东，贾之慎壳聚糖及其衍生物的抗菌活性研究进展J海洋科学，2000，24728307曾名勇，陈胜军，张联英海洋生物抗菌剂的研究进展J精细与专用化学品，200219368JLSEBAT,AJPASZCZYNSKI,MSCORTESE,ETALANTIMICROBIALPROPERTIESOFPYRIDINE26DITHIOCARBOXYLICACID,AMETALCHELATORPRODUCEDBYPSEUDOMO
6、NASSPPJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2001,679393439429YANLINGZHANG,ERICBALLARD,SHILONGZHENG,ETALDESIGN,SYNTHESIS,ANDEVALUATIONOFEFFLUXSUBSTRATEMETALCHELATORCONJUGATESASPOTENTIALANTIMICROBIALAGENTSJRECEIVEDINBIOORGANICIRONCHELATINGAGENTTHEMINIMUMINHIBITIONCONCENTRATIONSINHIBITION0引言自然界有害细菌分布非常广
7、泛，而且数量庞大，种类繁多，它们不仅会引起各种材料的分解、变质和腐败，同时还严重威胁着人们的健康。每年因食物被微生物污染而导致的食物中毒事件，以及曾在世界范围内因细菌传染而引起的霍乱、疟疾、结核病导致人类的死亡频频见报等使得人类不断采取各种方法来抗菌。尤其是现在，随着生活水平的提高和科学技术的不断发展，人们对生活环境的认识和要求也在不断的提高，特别是对健康的意识也在不断增强，使得人们对抗菌课题的关注也不断提高，尤其是在一些致病菌对一些药物等产生了耐药性，传统的一些抗菌剂失去效用后，开发、研究更多的新型抗菌剂就成为迫切的需要。因而抗菌剂的研究和发展成为人类一直关注的课题。抗菌剂的研究、开发始于2
8、0世纪80年代初1。目前，已经研制出来并在各个领域得到广泛应用的抗菌剂主要有有机抗菌剂、无机抗菌剂和复合抗菌剂3类。有机抗菌剂包括从一些动物体内提取出的具有抗菌活性的高分子有机物的天然抗菌剂和研究学者合成的合成型有机抗菌剂。目前普遍认为有机抗菌剂的杀菌作用机理是1带有正电荷的有机分子链与细菌和霉菌的细胞膜表面阴离子结合或与巯基反应，从而破坏有害微生物细胞膜的组成，使其细胞内物质如K、DNA、RNA等泄漏，最终导致菌体死亡，从而起到抑菌、杀菌的目的。最常见的天然有机抗菌剂是壳聚糖及其衍生物。于1979年，ALLAN指出，壳聚糖具有安全广谱的抗菌性能2，对自然界的细菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同
9、程度的抑制作用3。但壳聚糖只能在酸性领域内显示出抗菌活性4，为了发挥壳聚糖的抗菌活性及扩大其应用范畴，研究人员纷纷对其进行改性，研究出同样具备很好的抗菌活性的壳聚糖衍生物。朱一凡5等人将壳聚糖季铵化，用含季铵化的壳聚糖200MG/L的抗菌剂溶液对大肠杆菌作用5MIN，杀灭菌的对数值500；对金黄色葡萄球菌作用25MIN，杀灭菌的对数值500。而以含季铵化壳聚糖1000MG/L的该抗菌剂溶液白色念珠菌作用5MIN，杀灭菌的对数值500。季铵化壳聚糖均显示出了良好的杀菌效果。HUANGRH等6通过化学方法制备出壳聚糖硫酸盐及其衍生物，这种抗菌剂对金黄色葡萄球菌等具有非常显著的抑制效果。有机抗菌剂中
10、，除了天然抗菌剂，另一类更占主导地位的有机抗菌剂是合成有机抗菌剂。主要是一些季铵盐、季膦盐、有机锡、卤代胺和双胍盐类等。而最季铵盐类有机抗菌剂由于价格低廉，杀菌速度快的特点被广泛应用。KOURAI等人7在1995年就报道了一些含有不饱和烷基季铵盐抗菌剂，指出它们均具有高效、广谱的抗菌活性，并且认为季铵盐中引入不饱和烷基大大提高了其抗菌活性。无机抗菌剂主要是利用一些具有抗菌能力的无机成分通过各种方法与载体结合而制得的。根据杀菌机理的不同可分为金属离子型和光催化型两种无机抗菌剂。金属离子型无机抗菌剂的主要品种包括以沸石、硅胶、磷盐等多孔材料或层状晶体材料为载体的银、铜、锌等金属离子无机抗菌剂。徐光
11、亮等人8，利用干湿循环法以天然矿物斜发沸石为载体，制备出一种含锌量很高的无机抗菌剂；当锌含量为1032时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很大的抗菌活性，杀菌率均大于999。而光催化型无机抗菌剂的品种主要包括锐钛型TIO2、ZNO、SIO2等。其中，纳米TIO2具有活性高、耐热性好及热稳定性、持续性长、安全性高、即效性好等优点，因而是最受关注的无机抗菌剂之一。徐瑞芬等9将纳米TIO2添加到苯丙乳液中，由此制得的抗菌涂料对大肠杆菌、枯草芽孢和金黄色葡萄球菌的杀菌率均达到了99以上，且杀菌彻底、抗菌长效。许秋颖等人10制备出纳米TIO2苯丙聚合物乳液，该纳米TIO2复合抗菌涂膜经自然光照射24H后，
12、对大肠杆菌的抗菌活性也不错，杀菌率达84。复合抗菌剂是通过不同的方式将不同类型的抗菌剂化合，以合理利用这些抗菌剂的优点，使这些参与化合的抗菌剂相互作用，取长补短，达到提高抗菌性能和扩大使用范围的效果。张欣等人11研究合成了酰基吡唑啉酮与CU2、CO2、ZN2、NI的配合物，实验表明配体和配合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有一定的抑制作用，但配合物的抑菌活性比配体的高，说明配合物形成后,过渡金属离子对配体的抑菌活性起到了增强的效应。最近，一些学者通过有机合成技术，研究合成了几种新型抗菌剂，并提出了一个新的抗菌理念通过螯合作用，螯合培养基中微生物生长所必需的铁离子来达到抗菌的目的。铁元素是地壳中含
13、量最丰富的元素之一。铁几乎是所有生物体进行生命活动所必需的元素，对于微生物也不例外，是微生物生长所必需的营养之一。铁在微生物生长过程中的作用主要有构成有机化合物，合成菌体组分；调节细胞的渗透压；作为酶的组成成分，维持酶的活性；参与能量的储存和转运；与微生物生长繁殖和致病作用密切相关12。在微生物的生长过程中，铁的最低浓度约为107105M13。因此，通过螯合作用螯合微生物生长环境中的铁离子，使铁离子的浓度低于其生长所必需的浓度，从而抑制微生物的生长，即可达到抗菌的效果。铁离子螯合剂就是根据这一原理被开发研究出来的，是一种新型的抗菌剂，并在医药、食品等领域得到了广泛的应用。ADRIAAN14等人
14、于93年合成具有螯合三价铁功能的HMP，实验证明，该铁螯合剂能有效抑制供试菌株大肠杆菌和李斯特氏菌的生长。铁离子螯合剂二乙烯三胺五乙酸（DIETLYLENETRIAMINEPENTAACETICACID,DTPA）已在医疗领域上得应用15。MA,MD,DCHROBERTMCDONALD16用去铁胺与DTPA治疗四名患有珠蛋白生成障碍性贫血且尿液中伴有大量铁的患者。结果显示，铁积累最大的患者获得了最好的疗效；而对于那些没有积累太多铁的患者则效果就不显著了。由于铁螯合剂的有效抑菌作用，最近，人们开发了几种新型的铁螯合剂，基于螯合剂螯合培养基中微生物生长所需的铁离子来达到抗菌的目的的这样一个理念，我
15、们将对它们进行抗菌效果的检验。并且将它们的抗菌性能与DTPA的抗菌性能进行比较，为人们在抗菌方面有更多的选择。1材料与方法11材料111菌种革兰氏阴性细菌（G菌）大肠杆菌ESCHERICHIACOLI、铜绿假单胞菌PSEUDOMONASAERUGINOSA革兰氏阳性细菌（G菌）金黄色葡萄球菌STAPHYLOCCOCUSAUREUS、蜡样芽胞杆菌BACILLUSCEREUS、枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS真菌指状青霉PENICILLIUMDIGITATUM上述菌株均由实验室分离得到。112试剂铁螯合剂CP262、CP263和LMS系列的0514A、0521A、0608A、0609A
16、、0610C、0611、0612以及DTPA。113培养基脑心浸液琼脂BRAINHEARTINFUSIONAGAR,苏州兴化市联发化工试剂有限公司脑心浸液培养基BRAINHEARTINFUSIONMEDIUM,苏州兴化市联发化工试剂有限公司孟加拉红培养基（ROSEBENGALMEDIUM,杭州微生物试剂有限公司）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）114主要仪器设备培养皿、1575MM玻璃试管、移液枪（50L、1000L、5000L）、枪头、移液管、吸耳球、酒精灯、试剂瓶、锥形瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、镊子、牛津杯、记号笔、废物缸等。快速蒸汽灭菌锅（天津超拓制造）；生化培养箱（上海精宏实验设备
17、有限公司）；无菌操作台（上海精宏实验设备有限公司）；新型电热恒温鼓风干燥箱（宁波江南仪器厂）；密封式恒温可调电炉（嘉兴市欣欣仪器设备有限公司）；电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）。12方法121斜面保种细菌短期保藏普通营养琼脂斜面划线，37下培养24小时后，用报纸包扎置于冰箱中冷藏保藏。一般1530天转管一次。细菌长期保藏普通营养琼脂斜面划线，37下培养24小时后，往长好的斜面菌试管中加入已灭菌的石蜡油至高出斜面顶部约1CM（故斜面不宜过长），用报纸包扎置于冰箱中冷藏保存。霉菌PDA培养基斜面划线，28下培养48小时后，用报纸和塑料袋包扎置于冰箱中冷藏保藏。122试剂配制铁螯合剂分别称取3
18、0MG抗菌剂（CP262、CP263和LMS系列的0514A、0521A、0608A、0609A、0610C、0611、0612以及DTPA）粉末，溶于5ML的双蒸水中，待全部溶解后，转移到10ML的容量瓶中，定容到10ML，作为这些抗菌剂的母液（3000PPM）。水溶性不是很好的抗菌剂，配制时可适当加热和超声。然后根据实验要求，适当稀释抗菌剂母液，配制成实验所需的一系列不同浓度（200、300、500、1000、1500、2000、2500PPM等）的抗菌剂试剂。123培养基配制脑心浸液琼脂在洗净晾干的300ML锥形瓶中称取10G脑心浸液琼脂培养基BHI，然后加入200ML蒸馏水混合，在电炉
19、上加热搅拌至完全混合、溶解。在温度121下高压灭菌20分钟。允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。它们可以保存在冷藏中直到使用。脑心浸液培养基称取37G脑心浸液培养基和100ML蒸馏水加入250ML的锥形瓶中，加热并搅拌至完全溶解，然后在温度121下高压灭菌20分钟。孟加拉红培养基称取72G孟加拉红培养基（虎红琼脂）溶于200ML蒸馏水中，加热并搅拌至完全溶解，然后在温度121下高压灭菌20分钟。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）称取200G马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂（煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验
20、需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管，加塞、包扎，（121）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。124菌悬液的制备细菌分别从斜面菌种上通过无菌操作的方法挑取一环接种到已编号的脑心浸液琼脂斜面上，置于37恒温培养箱中培养24小时，活化菌株。然后再从已活化的菌种中分别挑取一环接种到5ML的脑心浸液培养基上，置于37恒温培养箱中再培养24小时。接着，用移液器吸取50L转移一支新的的脑心浸液培养基上，置于37恒温培养箱中培养，直到其终浓度达到107CFU/ML，大约需要1820小时。霉菌通过无菌操作的方法用接种环挑取少许菌体于装无菌水的试管中，
21、震荡混匀，用血球计数板计数，调整菌悬液的浓度，使其含孢子量约为107个/ML。125铁螯合剂对微生物的最低抑制浓度（MIC）测定最低抑制浓度（MIC）测定是指测定抗菌剂抑制微生物生长的最低浓度17。对于细菌，在试管中加入一定量的菌液和一系列不同浓度的抗菌剂，待螯合作用结束后，在温度37下培养24小时，用肉眼观察试管菌液的浑浊度。具体方法如下所有的试样将在1575MM的试管中进行，培养基为脑心浸液培养基，无菌操作。取无菌试管排成排，用移液枪往试管里加入抗菌剂和菌悬液。所有的试管中包含80L抗菌剂和20L菌悬液。对照管中只包含80L无菌水和20L菌悬液。抗菌剂和菌悬液加入结束后，用已灭菌烘干的试管
22、塞将试管塞好，拿到37恒温培养箱箱中，静置2小时，进行螯合作用。接着用培养基将所有试管总体积补足1000L，置于37恒温培养箱中培养24小时。每一种抗菌剂的各个浓度对供试菌株的螯合作用实验设3个试管平行。用肉眼观察试管菌液的浑浊度，以肉眼可见浑浊度最小的最低抗菌剂浓度为测定抗菌剂对检测菌的最低抑菌浓度MIC。对于霉菌，在牛津杯测试培养法的基础上16进行改良。具体方法如下取200L抗菌剂和5ML灭菌孟加拉红培养基混合均匀后加入平板培养皿中，同时200L无菌水5ML灭菌孟加拉红培养基做空白对照，待培养基凝固后，在平皿中央放入灭菌牛津杯，并注入10L的霉菌孢子悬液。静置待悬液缓慢扩散进入琼脂中，在2
23、8，相对湿度75条件下培养，待空白样霉菌长满整个平板时，以长霉菌数最小的最低抗菌剂浓度为最低抑制浓度，每个浓度2平行。2结果与讨论21铁螯合剂对革兰氏阴性菌的抗菌效果铁螯合剂对革兰氏阴性菌的最低抑制浓度MIC见表1。表1铁螯合剂对革兰氏阴性菌的最低抑制浓度MIC测定结果TAB1THEMICRESULTSOFIRONCHELATINGAGENTSAGAINSTGRAMNEGATIVEBACTERIUM铁螯合剂大肠杆菌MIC值G/ML铜绿假单胞菌MIC值G/MLCP2624040CP2634040LMS0514A2416LMS0521A2424LMS0608A120240LMS0609A24024
24、0LMS0610C1616LMS06114040LMS06124040DTPA4040由上表可知，铁螯合剂CP262、CP263和LMS系列的0514A、0521A、0608A、0609A、0610C、0611、0612以及DTPA对革兰氏阴性菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用，对大肠杆菌的最低抑制浓度分别为40G/ML、40G/ML、24G/ML、24G/ML、120G/ML、240G/ML、16G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML；对铜绿假单胞菌的最低抑制浓度分别为40G/ML、40G/ML、16G/ML、24G/ML、240G/ML、240G/ML、16G/ML、40G/
25、ML、40G/ML、40G/ML。其中，LMS0610C（MIC值为16G/ML）有着最好的抑制效果。其余几个新型抗菌剂的抑制效果大小顺序为LMS0514ALMS0521ALMS0611、CP262、CP263、LMS0612LMS0608ALMS0609A。22铁螯合剂对革兰氏阳性菌的抗菌效果铁螯合剂对革兰氏阳性菌的最低抑制浓度MIC见表2。表2铁螯合剂对革兰氏阳性菌的最低抑制浓度MIC测定结果TAB2THEMICRESULTSOFIRONCHELATINGAGENTSAGAINSTGRAMPOSITIVEBACTERIUM铁螯合剂金黄色葡萄球菌MIC值G/ML蜡样芽胞杆菌MIC值G/ML枯
26、草芽孢杆菌MIC值G/MLCP262804040CP2638080240LMS0514A404040LMS0521A404040LMS0608A808080LMS0609A404040LMS0610C804040LMS0611404040LMS0612808040DTPA404040由上表可看出，铁螯合剂CP262、CP263和LMS系列的0514A、0521A、0608A、0609A、0610C、0611、0612以及DTPA对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌也有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的MIC分别为80G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML
27、、40G/ML、80G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML；对蜡样芽胞杆菌的MIC分别为40G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML；对枯草芽孢杆菌的MIC分别为40G/ML、240G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML。其中，抑制效果较好的铁螯合是DTPA、LMS0514A、LMS0521A、LMS0609A和LMS0611，但抗菌效果不如革兰氏阴性菌（MIC值40G/ML）。根据表1和表2，铁螯合剂螯合了
28、细菌生长环境中的铁离子，细菌的生长受到了抑制，说明铁是微生物生长所必需的重要元素之一。虽然自然界中铁元素是最丰富的元素之一，但在生理条件下其溶解性差，铁离子的浓度不超过1018M，而在微生物的生长过程中，其最低浓度约为107105M。因此，微生物需要形成一套高效的铁运转机制获得铁离子，达到它们生存所需的浓度。这些机制包括一合成嗜铁素。嗜铁素是一类低分子量铁螯合物，对铁具有较高的亲和力，故可介导微生物细胞的铁摄取。二合成蛋白水解酶。微生物可合成蛋白水解酶并释放到周围环境中，以降解宿主铁结合蛋白，从中获得所需的铁19。三利用乳铁蛋白受体获取铁。有些细菌如链球菌，其菌体膜上表达乳铁蛋白受体，可直接与
29、宿主乳铁蛋白结合，由此可从宿主含铁蛋白上获取铁20。这些铁转运机制中最重的一种是利用嗜铁素来螯合环境中的铁，进而转运铁。以铜绿假单胞菌为例，它能分泌合成两种嗜铁素，分别是荧光铁载体和非荧光铁载体。荧光铁载体对多种金属离子有相对低的亲和力，能亲和多种金属离子，如MO6，CO2，FE3等；非荧光铁载体则特异性负责对铁离子的结合和转运21。在培养基中加入抗菌剂后，抗菌剂就开始螯合培养基中的铁离子。当培养基中的铁离子越来越少时，铜绿假单胞菌则会分泌出上述两种嗜铁素，以完成铁的转运，促进该菌对铁离子的吸收利用。但在试验中，加入铁螯合剂后，其生长仍受到很大程度的抑制，可能原因是其分泌的嗜铁素对铁离子的螯合
30、能力不如这些抗菌剂螯合金属的能力，所以生长受到了抑制。23铁螯合剂对霉菌的抗菌效果霉菌的抗菌实验进行了一次，初步结果显示对霉菌的抑菌效果不是很好，铁螯合剂对霉菌的抑制作用还需要在以后继续探讨研究。24讨论CP262、CP263和LMS系列的0514A、0521A、0608A、0609A、0610C、0611、0612铁螯合剂以及DTPA这10个抗菌剂均对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌有不同程度的抑制作用。由表1可知，这些新型抗菌剂对革兰氏阴性菌的抑制作用中，LMS0610C有着最好的抑制效果。由表2可知，这些螯合剂对于革兰氏阳性菌的抑制效果较好的是DTPA、
31、LMS0514A、LMS0521A、LMS0609A和LMS0611。在本试验中，铁螯合剂对革兰氏阴性菌的抑制效果好于革兰氏阳性菌。究其原因，可能跟细菌的结构有关。通常，营养物要通过细胞外膜可由孔蛋白来完成，但对于铁嗜铁素复合物，由于分子量较大，不能通过被动扩散方式进入，它的转运需要受体和能量的参与。对于革兰氏阳性菌，其受体蛋白在质膜上，能传递铁嗜铁素复合物到以ATP为能量来源的ABC结合盒型转运蛋白（ATPBINDINGCASSETTE,ABC），然后ABC系统会帮助、促进嗜铁素复合物通过膜22。ABC转运系统又叫ATP依赖的转运系统，包括壁膜间隙蛋白、膜的通透酶和与ATP结合的脂蛋白，这三
32、者用于结合不同的配体23。我们都知道革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌最大的差异在于它们的细胞壁结构不同。革兰氏阳性菌细胞壁主要是由一层厚厚而紧密的肽聚糖和磷壁酸构成，虽然结构坚固，但是细胞壁的选择透过性还是比较差的，所以当嗜铁素和螯合剂跟三价铁离子结合时，此种复合物还是能通过ABC转运系统进入到膜内，促进革兰氏阳性菌对培养基中铁离子的利用。但对于革兰氏阴性菌，其细胞壁比革兰氏阳性菌薄而结构复杂，分外膜和肽聚糖层。外膜的基本成分是脂多糖，它同细胞质膜一样是双层类脂。因此，铁嗜铁素复合物必须都通过外膜和内膜这脂双层结构才能进入细胞质，从而使得转运过程较为复杂。革兰氏阴性菌会自己合成一系列特异性的高亲和性
33、的受体蛋白，使得它们能够在细胞表面有效地结合铁嗜铁素复合物。随后，铁嗜铁素结合物通过主动运输方式进入壁膜间隙，主动运输需要能量，此时则靠以质子动势作动力（PROTONMOTIVEFORCE,PMF）的TON系统。TON系统包含TONB，EXBB和EXBD三个蛋白。其中，TONB被认为是一种能量转导物，可以把内膜上产生的PMF偶联到外膜受体上，为铁嗜铁素复合物的转运提供动力、能量使它们进入壁膜间隙24。通过外膜进入壁膜间隙后，接着要通过内膜，这与革兰氏阳性菌通过内膜一样，需要ABC转运系统的参与，并借助细胞内ATP的水解产生的能量。由于革兰氏阴性菌合成的外膜受体蛋白的特异性，使得外膜除了具有保障
34、运输功能外，还有保护屏障作用，能阻止多种物质通过，起到对多种抗生素有很强抵抗力的作用25。所以铁嗜铁素抗菌剂的复合物不能通过被动扩散方式进入膜内，它的转运需要受体和能量的参与。且铁嗜铁素抗菌剂的复合物无法被外膜上的特异受体识别，所以，微生物铁的转运过程停止，即便培养基中的铁离子浓度再高，微生物也利用不了，生长则受到抑制，从而达到了抗菌的目的。故抗菌剂对革兰氏阴性菌的抑制效果好于革兰氏阳性菌。一般认为芽孢菌的抗性较强。但是，我们发现在铁螯合剂对革兰氏阳性菌抑制作用实验中，芽孢菌的抗菌性与非芽孢菌相差无几。可能在芽孢菌产芽孢前，铁螯合剂对其作用已完成。3结论通过本次新型铁螯合剂CP262、CP26
35、3、LMS0514A、LMS0521A、LMS0608A、LMS0609A、LMS0610C、LMS0611、LMS0612的体外抗菌活性试验发现1）铁螯合剂CP262、CP263、LMS0514A、LMS0521A、LMS0608A、LMS0609A、LMS0610C、LMS0611、LMS0612以及DTPA对细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，对大肠杆菌的最低抑制浓度分别为40G/ML、40G/ML、24G/ML、24G/ML、120G/ML、240G/ML、16G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML；对铜绿假单胞菌
36、的最低抑制浓度分别为40G/ML、40G/ML、16G/ML、24G/ML、240G/ML、240G/ML、16G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML；对金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度分别为80G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML；对蜡样芽胞杆菌的最低抑制浓度分别为40G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、80G/ML、40G/ML；对枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度分别为40G/ML、240G/ML、40G/ML、40G/
37、ML、80G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML、40G/ML。由此说明，铁是微生物生长所必需的元素之一，通过螯合作用，螯合微生物生长环境中的铁离子，可达到抑制微生物生长的目的。2）铁螯合剂对革兰氏阴性菌的抑制效果要好于革兰氏阳性菌。3）从铁螯合剂对霉菌的抗菌效果试验可初步判定铁螯合剂对霉菌的生长没有多大的影响。抗菌一直是人们所关注的话题，随着人们的健康意识的不断增加，越来越多的高效、安全、新型抗菌剂会不断地被研制和开发，并在各领域的应用也将会越来越广泛。参考文献1孙洪,夏英,陈莉,等国内外抗菌剂的研究现状及发展趋势J塑料工业,2006,349142季君晖,史维明编抗
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