1、本科毕业设计（20_届）NAC对坛紫菜高温胁迫下HSP70基因表达的影响所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12材料与方法221实验材料2211实验样品2212菌株和载体2213试剂和试剂盒2214实验仪器222实验方法2221坛紫菜总RNA的提取2222第一链CDNA的合成3223实时荧光定量PCR引物的设计3224实时荧光定量PCR标准质粒的构建3225实时荧光定量PCR检测样品43结果与分析531组织RNA提取和目的基因片段的制备532重组质粒的鉴定633标准品质粒的荧光定量PCR检测6331扩增曲线分析6332标准曲线分析7333溶解曲线分析8334重
2、复性检测1034HSP70基因的差异表达检测结果11341实验样品扩增的动力学参数11342不同处理条件下的样品拷贝数12343不同处理条件下HSP70基因的相对表达134讨论1541温度胁迫与HSP70基因的表达1542NAC干预与HSP70基因的表达1643不同处理条件下HSP70基因表达的相似性165结论17致谢18参考文献18附录19附录1紫菜叶状体总RNA的提取19附录2DH5大肠杆菌感受态的制备19附录3PCR产物的回收19附录4PCR胶回收产物与克隆载体的连接与转化20附录5重组质粒的抽提20附录6阳性质粒的筛选与PCR鉴定20摘要活性氧（ROS）代谢的失调是植物逆境伤害的共同机
3、理之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术，以18S为内源特异参照基因，对坛紫菜HSP70基因在高温胁迫及活性氧清除剂N乙酰半胱氨酸（NAC）干预下的相对表达进行了研究。结果表明在35热胁迫及5MMOL/LNAC处理短时间（5MIN）内，坛紫菜HSP70基因的表达都会迅速升高，随后继续逐渐上升，且都在12小时时达到顶峰，然后又急剧下降；NAC干预下HSP70基因表达的上升幅度较热胁迫大，热胁迫NAC干预下上升幅度最大。该结果提示5MMOL/LNAC可能对坛紫菜耐高温胁迫并没有保护作用，对正常坛紫菜细胞也有一定的毒害作用，而且较热胁迫要强烈，这可能与外源药物NAC破坏了正常细胞内的ROS稳态有关。
4、这种伤害是否由高浓度的NAC引起或者低浓度的NAC是否能保护坛紫菜细胞免受ROS损害需要更进一步的研究。关键词高温胁迫；HSP70；N乙酰半胱氨酸（NAC）；实时荧光定量PCR；ROSABSTRACTTHEIMBALANCEOFREACTIVEOXYGENSPECIESROSMETABOLISMISONEOFTHECOMMONREASONSFORSTRESSINJURYINPLANTSINTHEPRESENTSTUDY,THEEXPRESSIONOFHSP70GENEOFPORPHYRAHAITANENSISUNDERHIGHTEMPERATURESTRESSANDTHEROSREMOVERN
5、ACETYLCYSTEINENACTREATMENTWEREDETECTEDBYTHEREALTIMEQUANTITATIVEPCRTECHNIQUETHERESULTSHOWEDTHATTHELEVELOFMRNAEXPRESSIONOFHSP70GENEINCREASEDRAPIDLYAFTERASHORTPERIODOFHEATSHOCK35,5MIN,SOTHATINTHEEXPERIMENTALGROUPSUNDERNAC5MMOL/LTREATMENTTHENTHEEXPRESSIONOFHSP70CONTINUEDTORISEGRADUALLYUNTILITREACHEDITSP
6、EAKAFTER12HOURSANDDECLINEDDRAMATICALLYTHEEXPRESSIONOFHSP70GENEUNDERNACTREATMENTINCREASEDHIGHERTHANTHATOFNACTREATMENTWITHOUTHEATSHOCK,WHILETHEVALUEOFTHEGROUPBEINGHEATEDSHOCKONLYWASTHELOWESTAMONGTHREEEXPERIMENTALGROUPSTHERESULTINDICATEDTHATNAC5MMOL/LMIGHTHAVETOXICEFFECTSONTHEPHAITANENSISCELLSINSTEADOF
7、PROTECTINGTHEORGANISMSBYREMOVALROSASREPORTEDINOTHERARTICLES,ANDTHETOXICEFFECTSWEREMUCHWORSETHANTHATOFHEATSHOCKTHATMAYBERELATEDTOEXOGENOUSDRUGSNACWHICHPERTURBROSHOMOSTASISINNORMALCELLSWHETHERTHEHURTWERECAUSEDBYTHEHIGHCONCENTRATIONNACORNACWITHTHELOWCONCENTRATIONMAYPROTECTTHEPHAITANENSISCELLSFROMDISAST
8、ERCAUSEDBYROSNEEDFUTHERSTUDYKEYWORDSHIGHTEMPERATURESTRESSHSP70NACETYLCYSTEINENACREALTIMEQUANTITATIVEPCRROS11引言坛紫菜（PORPHYRAHAITANENSIS）是我国最重要的经济藻种之一，为潮间带大型藻类的典型代表，生活环境复杂多变，具有特殊的抗逆应答机制，是研究藻类抗逆机理的良好材料。近年来由于海水养殖无节制扩大和工业发展造成海水污染以及全球气候变化等自然和人为因素的影响，越来越多海区环境日益恶化，成为逆境，严重威胁着藻类养殖业的健康发展。深入了解紫菜的抗逆机理对全面紫菜健康养殖并进行
9、紫菜抗逆品种培育有重要意义1。植物的抗逆性不只是单一机制起作用的结果，而是一个十分复杂的过程2。有氧代谢是大多数植物生存所必须的，植物将氧气还原成水，为植物的生长和发育提供能量。但还原过程不完全时，就会产生一类化学性质活泼，氧化能力极强的含氧物质H2O2、单线态氧和羟自由基等，即通常说的活性氧（REACTIVEOXYGENSPECIES，ROS）3,4。ROS是所有需氧生物代谢过程中不可避免的产物。在正常生长条件下，植物细胞内活性氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态。当外界条件如温度、盐度等急剧变化时，这种平衡就会被破坏，致使活性氧自由基大量积累，进一步形成氧化损伤，随着胁迫时间的延长，有可能
10、导致植株死亡。从本质上讲，活性氧代谢的失调是植物逆境伤害的共同机理之一5。与此同时，ROS也是植物体在胁迫条件下的一种信号转导因子，启动了ROS清除系统以及抗胁迫基因系统的表达6。研究表明，植物在热胁迫下，ROS作为信号分子能够诱导热激蛋白（HSP）的合成，但是ROS如何调控HSP的表达目前并不清楚7。N乙酰半胱氨酸NACELYLCYSTEINE，NAC是L半胱氨酸的乙酰化合物，它是一种含巯基的广谱型抗氧化物，在细胞内去乙酰化后生成半胱氨酸，提供合成细胞内重要的非酶类抗氧化物质谷胱甘肽GSH的底物，维持细胞内GSH水平，保护细胞活性。NAC也可通过形成巯中心自由基及其后的继发反应，有效清除自由
11、基，保护细胞免受ROS损害8。同时，NAC可减少外界刺激引起的细胞内ROS水平的过度升高，提高细胞的去毒性作用和减少氧自由基的释放，从而阻断ROS的第二信使作用，阻断基因转录的起始，调节细胞的增殖和凋亡9。目前，NAC在呼吸、心血管、神经系统和AIDS的临床和实验研究中均有广泛应用10。已有研究报道，NAC作用于一些动物组织或器官后能够明显增强其抗氧化能力，表现为体内毒性物质减少、SOD活性增强等8。但是其作用机理目前并不十分明确。HSP70是重要的抗逆蛋白，由HSP70基因家族编码，重金属（镉和铜）、温度、PH、光照、除草剂等都可能诱导它们差异的表达，来适应环境条件的变化。HSP70家族由于
12、在应激反应中的敏感性，以及功能多样性而成为研究热点。HSP70基因没有内含子，转录一旦启动就可产生出成熟的MRNA来快速表达HSP70，防止应激原对HSP70MRNA前体的影响，从而保证了机体对HSP70的需要14。HSP70具有多种生物学功能，作为分子伴侣，HSP70家族在应激状态下帮助蛋白质正确折叠，加快正常蛋白质合成的恢复；在细胞保护方面，HSP70表达的增加可以缓解细胞受伤害，增强机体对应激的抵抗力,同时，HSP70在细胞抗凋亡、抗氧化和免疫反应中也起着重要作用15。在各种绿色植物以及藻类中，不同HSP70基因的编码产物分布在胞质溶浆、叶绿体和线粒体内，参与新生蛋白质的正确折叠、转运及
13、其降解，对细胞的生长、分化和环境的适应等都起着重要作用。环境胁迫能诱导植物抗逆蛋白热激蛋白、抗氧化酶等活性的变化，究其本质是逆境诱导植物抗逆基因表达变化的结果，检测环境胁迫导致的抗逆基因的表达有助于了解植物的抗逆本质。MRNA水平上的定量检测是反映某个抗逆蛋白合成、调控的最直接可靠及灵敏的途径11。以往的研究中，检测基因表达水平的方法有NORTHERN杂交、RNASE保护分析、原位杂交等多种方法，但这些方法无法对MRNA进行精确定量，上世纪90年代中期诞生的实时荧光定量PCR（REALTIMEFLUORESCENCEQUANTITATIVEPCR）技术解决了这些问题，实现了MRNA从定性到定量
14、的飞跃，使得从转录产物水平上精确研究基因的表达成为了可能12。并且以其定量准确、检测范围宽（11011拷贝）、敏感度高（NAC组热激组，热激NAC组的表达量大约相当于热激组同一时间点的两倍。但是不同处理组HSP70基因的表达趋势较相似，均是逐渐上升而后急剧下降（图18）。17无论是热激还是NAC处理下，HSP70基因的表达量均是逐渐上升（见图18），12小时到达顶峰，24小时也仍高于正常表达，可见坛紫菜HSP70基因功能的发挥不但具有“及时性”，而且具有“长时性”，即在整个处理过程中，HSP70基因会长时间的高量表达。原因可能和HSP70在细胞中行使的复杂功能有关。HSP70是典型的“分子伴侣
15、”，多种新生蛋白质分子的定向移位及穿过亚细胞膜的过程都需要HSP70及其相关蛋白的参与。DESHAIES等人23认为定位于亚细胞器（内质网、线粒体等）的蛋白质，在细胞质中合成后需要改变构象，变成非折叠状，然后在HSP70的“陪伴”下才能穿过亚细胞膜，因此HSP70起着“伸展酶”的作用，使新生蛋白质保持无活性状态，护送它们到达适当的位置。随着对HSP70生物学功能的深入研究，现已发现HSP70不仅可以结合ATP，而且具有ATPASE功能，还具有钙调蛋白结合位点，这在机体适应逆境的过程中具有重要的调节作用。5结论本课题利用实时荧光定量PCR技术研究了NAC对坛紫菜高温胁迫下HSP70基因表达的影响
16、，发现无论是热胁迫还是NAC干预下，HSP70基因的应答反应不但具有“及时性”，短时间的胁迫就会导致其表达量迅速升高，而且具有“长时性”，即在整个处理过程中，HSP70基因会长时间的高量表达，这可能与HSP70在细胞内行使的复杂功能有关。5MMOL/LNAC可能对坛紫菜耐高温胁迫并没有保护作用，对正常坛紫菜也有一定的毒害作用，而且这种毒害作用较热胁迫还要强烈，HSP70基因的大量表达是对这种胁迫的保护性应答，这可能与外源药物NAC破坏了正常细胞内的ROS稳态有关，但是，ROS是否作为这种应答的中间信号分子并不确定。这种伤害是否由高浓度的NAC引起或者低浓度的NAC是否能保护坛紫菜细胞免受ROS
17、损害需要更进一步的研究。但也不排除其他假设，因为NAC的作用机理并不明确。图18不同处理组HSP70基因的表达差异FIG18THEDIFFERENTEXPRESSIONOFTHEHSP70GENEINDIFFERENTGROUPS18参考文献1杨锐，张晓龙，徐丽宁等坛紫菜耐高温胁迫机理之初步研究EB/OLHTTP/EPUBCNKINET/GRID2008/DETAILASPXFILENAMEZGHI200708001174DBNAMECPFD20072MITTLERR,VANDERAUWERAS,GOLLERYM,ETALREACTIVEOXYGENGENENETWORKOFPLANTSJTR
18、ENDSINPLANTSCIENCE,2004,104904963HALLIWELLB,GUTTERIDGEJMCFREERADICALSINBIOLOGYANDMEDICINEM4RDEDITION,OXFORD,CLARENDONPRESS,20064ASADAKPRODUCTIONANDSCAVENGINGOFREACTIVEOXYGENSPECIESINCHLOROPLASTSANDTHEIRFUNCTIONSJPLANTPHYSIOLOGY,2006,1143913965MAHALINGAMR,FEDOROFFNSTRESSRESPONSE,CELLDEATHANDSIGNALLIN
19、GTHEMANYFACESOFREACTIVEOXYGENSPECIESJPHYSIOLOGIAPLANTARUM,2003,11956686XUSC,DINGHD,SANGJRREACTIVEOXYGENSPECIES,METABOLISM,ANDSIGNALTRANSDUCTIONINPLANTCELLSJACTABOTANICAYUNNANICA,2007,2933553657SACHINK,JANEL,UNGL,ETALCOMPLEXITYOFTHEHEATSTRESSRESPONSEINPLANTSJCURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY,2007,10310316
20、8于敏，李永春氧化应激对COPD大鼠膈肌影响N乙酰半胱氨酸的作用J广东医学，2010，31（19）224622489金鑫，吴河水，田元等N乙酰半胱氨酸对小鼠巨噬细胞TOLL样受体2/4基因表达的影响J中华肝病杂志，2006，14（11）85285410鲍红荣，童立力N乙酰半胱氨酸的药理作用及其临床应用J浙江临床医学，2008，10（9）1274127511GUANL,SCANDALIOSJGTWOSTRUCTURALLYSIMILARMAIZECYTOSOLICSUPEROXIDEDISMUTASEGENES,SOD4ANDSOD4A,RESPONDDIFFERENTIALLYTOABSCIS
21、ICACIDANDHIGHOSMOTICUMJPLANTPHYSIOL,199811721722412PFAFFLMWANEWMATHEMATICALMODELFORRELATIVEQUANTIFICATIONINREALTIMERTPCRJNUCLEICACIDSRESEARCH,2001292002200713KELD,CHENZ,YUNGWKARELIABILITYTESTOFSTANDARDBASEDQUANTITATIVEPCREXOGENOUSVSENDOGENOUSSTANDARDSJMOLCELLPROBES,2000,1412713514林钟婷，朱静，翁银标等热休克蛋白70的
22、研究进展J中国畜牧兽医，2007，34（3）677015任宝波，王玉艳，王纯净等HSP70家族的分类及基因结构与功能J动物医学进展，2005，26（1）9810116SACHINKOTAK,JANELARKINDALE,UNGLEEETALCOMPLEXITYOFTHEHEATSTRESSRESPONSEINPLANTSJCURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY,2007,1031031617BIERKENSJ,VANDEPERREW,MAESJEFFECTOFDIFFERENTENVIRONMENTALVARIABLESONTHESYNTHESISOFHSP70INRAPHI
23、DOCELISSUBCAPITATAJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTA120,1998293418IRELANDHE,HARDINGSJ,GRAHAMA,ETALEVALUATIONOFHEATSHOCKPROTEIN70ASABIOMARKEROFENVIRONMENTALSTRESSINFUCUSSERRATUSANDLEMNAMINORJBIOMARKERS,2004,9213915519KIMPELJA,NAGAORT,GOEKJIANV,ETALREGULATIONOFTHEHEATSHOCKRESPONSEINSOYBEANSEED
24、LINGSJPLANTPHYSIOL,1990,9498899520HARVEYBH,JOUBERTC,PREEZJL,ETALEFFECTOFCHRONICNACETYLCYSTEINEADMINISTRATIONONOXIDATIVESTATUSINTHEPRESENCEANDABSENCEOFINDUCEDOXIDATIVESTRESSINRATSTRIATUMJNEUROCHEMRES,2008,3350851721郭志新N乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠肾脏NADPH氧化酶表达的影响J中国糖尿病杂志，2008，16（9）54454822朱超，苏冠方N乙酰半胱氨酸对GGO诱导HRPE细胞氧化损
25、伤的保护作用J中国实验诊断学，2010，14（4）50851023DESHAIESRJ,KOCHBD,WERNERWASHBURNEM,ETALNATURE,1988,33280080519附录1紫菜叶状体总RNA的提取AXYPREP总RNA小量制备试剂盒1）取适当量新鲜洁净的紫菜叶状体（75100MG），剪成小块，转移至预冷研钵中，加入液氮，快速充分研磨至粉末装（研磨时不断加入液氮，防止组织融化）；2）加入400LBUFFERRI，用装有18到23号针头的注射器反复抽吸810次，转入15ML离心管中。3）加入300LBUFFERRII，漩涡振荡1530SEC，12000G，4离心5MIN（4
26、离心）。4）取上清至15ML离心管中，加入250L异丙醇，混合均匀。5）将制备管置于2ML离心管中，转移步骤4中的混合液移到制备管中，6000G离心1MIN（4离心）。6）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，加入500LBUFFERW1A，12000G离心1MIN。7）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，加入700LBUFFERW2，12000G离心1MIN。以同样方法用700LBUFFERW2再洗涤一次。8）弃滤液，将制备管置回到原来的2ML离心管中，12000G离心1MIN。9）将DNA制备管置于另一洁净的15ML离心管中，在制备管膜中央加入4560LBUFFERTE或RN
27、ASEFREE水，10）室温静置1MIN，12000G离心1MIN，洗脱得RNA。附录2DH5大肠杆菌感受态的制备1）取取70保存的菌种划线接种于不含抗生素的LB固体培养基，培养过夜（12到16小时）2）挑取单菌落，接种于约4ML的LB液体培养基中，37摇床培养过夜。3）过夜培养物（20ML）加入LB液体培养基（20ML）中，37（5000R/MIN）培养约2小时，至细菌浓度达到OD600为0305。4）无菌条件下迅速将培养物置于冰浴1530MIN，缓慢摇匀以保证培养物充分冷却至05）于44000RPM离心10分钟，收集菌体。6）倒出培养液，将管倒置1MIN，使残留液体流尽7）加10ML预冷的
28、01MMOL/LCACL2溶液，重新悬浮沉淀混匀，冰浴30分钟（期间不断轻柔振荡混匀）；8）4000RPM离心10分钟，倒去上清（尽可能将所有的上清液去净），用2ML预冷的01MCACL2溶液重新悬浮菌体；9）按每管100L分装于预冷的灭菌EPPENDORF管中（加入终浓度为20的无菌甘油），10）感受态细胞制备完成后在4冰箱中放置424小时内用于DNA转化。或者放入70或液氮中保存备用。附录3PCR产物的回收使用GENERAY试剂盒（上海捷瑞），按试剂盒操作指南回收特异PCR片段。具体操作步骤如下1）用干净锋利的手术刀片从琼脂糖胶中切下含有目的条带的凝胶块，放入15ML离心管；2）每100M
29、G琼脂糖凝胶加入900LBINDINGSOLUTIONB，于5060温510MIN，每2MIN颠倒混匀一次，直至凝胶完全融化；3）将融化的凝胶转移至GENCLEANCOLUMN中，3000RPM室温离心1MIN；4）取出GENCLEANCOLUMN，并倒掉收集管中废液，将GENCLEANCOLUMN重新放回收集管中，加入500LWASHSOLUTION，于8000RPM，室温离心30S；5）重复步骤（4）一至两次；6）再次弃废液，并于10000RPM，室温离心2MIN，以彻底去除WASHSOLUTION；7）将GENCLEANCOLUMN放入干净的15ML离心管中，加入15LELUTIONBU
30、FFER在结合膜柱中央，37放置202MIN；8）10000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为包含目的DNA片断的溶液，取25L进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于20冻存。附录4PCR胶回收产物与克隆载体的连接和转化1）取少量胶回收的PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳定量。2）在一个02ML的EP管中加入003PMOLPMD18T载体、0103PMOL纯化PCR产物，总体积控制在510L，再加入等体积的SOLUTIONI510L，混合均匀。3）16水浴中连接过夜，备用。4）把连接产物加入到感受态大肠杆菌中，冰浴30MIN。5）将离心管置于42水浴中保温90S，然后快速取出
31、置于冰上56MIN；6）在离心管中加入200L的LB培养基；移至37，140RPM的恒温培养箱中振荡培养1H左右；涂平板，每个平板涂120L的菌液；7）37恒温培养箱中培养过夜，待菌落长出。附录5重组质粒的抽提1）使用35毫升菌液过夜培养，将菌液加入15ML离心管，12000RPM离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。2）每管加入200微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3）每管加入400微升溶液II，轻轻颠倒离心管46次，使细菌完全裂解，溶液透明。4）每管加入700微升溶液III，随即颠倒离心管46次混匀，可见白色絮状物产生，室温放置
32、2MIN。5）最高速12,000RPM左右室温离心5分钟。6）将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。静置2MIN，8000RPM离心60秒，弃流出液。保留收集管，将剩余液体加入纯化柱，8000RPM离心60秒。7）弃流出液，在质粒纯化柱内加入500微升WASHSOLUTION，8000RPM离心60秒。8）弃流出液，重复上一步骤。9）弃流出液，放回收集管，10000RPM离心60秒，以除去残余WASHSOLUTION。10）将质粒纯化柱置于新的15毫升离心管上，加入50微升ELUTIONBUFFER至管内柱面上，放置1分钟。注ELUTIONBUFFER需要加至管内柱面中央，使液体被纯
33、化柱吸收。室温放置2MIN，10000RPM离心2MIN。纯化后的质粒20保存备用。附录6阳性质粒的筛选和PCR鉴定挑取经AMP抗性筛选出的转化菌落进行小量液体培养，按照质粒快速提取试剂盒的操作说明书进行。PCR法对重组质粒进行鉴定用灭菌牙签挑选单个阳性菌落，用20L灭菌超纯水溶解，作为PCR扩增模板备用。PCR扩增时，选外侧引物。PCR总反应体系为20L，反应成分包括质粒模板2L，上游引物05L，下游引物05L，10PCRBUFER2L，MGCL225MMOLL16L，DNTP10MMOLL04L，TAQDNA聚合酶02L，最后加超纯水至总体积20L。PCR反应条件94预变性3MIN，94变性30S，60复性30S，72延伸30S，共进行35个循环，最后于72延伸10MIN。PCR反应结束后，12的琼脂糖凝胶电泳检测产物。
