1、本科毕业设计（20_届）浒苔多糖磷酸化工艺条件的优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言32材料与方法421材料4211原料4212试剂422仪器523实验方法5231粗多糖的提取与制备5232磷酸化反应6233样品磷酸根的测定6234磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响7235单因素实验工艺优化72351反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响72352反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响72353反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响72354磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响8236浒苔粗多糖磷酸化正交试验工艺优化83结果与讨论831粗多糖的提取8
2、32样品磷酸根测定933磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响1034单因素实验工艺优化11341反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响11342反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响12343反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响12344磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响13345单因素实验结论1335浒苔多糖磷酸化正交试验工艺优化14351实验结果及分析14352验证试验144结论155展望15致谢错误未定义书签。参考文献15附录错误未定义书签。附录1文献综述错误未定义书签。附录2中英文翻译错误未定义书签。摘要本文研究了磷酸化浒苔多糖，采用混合磷酸盐（三聚磷酸钠三偏磷酸钠61）作为磷酸化试
3、剂对浒苔粗多糖进行磷酸化，并通过单因素实验来确定影响磷酸化反应的因素，继而设计正交试验优化磷酸化工艺条件。根据测定经修饰后的粗多糖的磷酸根含量来确定结果。主要研究了反应温度、反应时间、PH和混合磷酸盐浓度对磷酸化反映的影响。单因素实验结果温度80，反应时间5H，反应PH为90混合磷酸盐浓度010G/ML，在此条件下可获得最大磷酸根接枝量9386。而经过正交优化后确定影响反应的因素主次顺序为磷酸化试剂浓度反应PH反应时间反应温度,其最优组合为反应温度90，反应时间6H，反应PH90，磷酸化试剂浓度010G/ML，此时最大接枝量可大于等于9965。关键词浒苔多糖；磷酸化；工艺优化ABSTRACTI
4、NTHISPAPER,THEPHOSPHORYLATEDPOLYSACCHARIDEWASSTUDIEDMIXEDPHOSPHATESTPPSTMP61WASUSEDASTHEPHOSPHORYLATIONREAGENTINTHEREACTIONOFTHEPHOSPHORYLATIONOFENTEROMORPHAPOLYSACCHARIDESANDTHESINGLEFACTOREXPERIMENTSWEREDONETODETERMINETHEFACTORSOFAFFECTINGPHOSPHATEREACTION,FOLLOWEDBYORTHOGONALTESTTOOPTIMIZEPHOSPHO
5、RYLATIONCONDITIONSTHERESULTSWEREDETERMINEDBYTHEQUANTITYOFPHOSPHATEINTHEMODIFIEDANDUNMODIFIEDPOLYSACCHARIDESEVERALFACTORS，SUCHASTEMPERATURE,TIME,PHANDTHEQUANTITYOFPHOSPHORYLATEDREAGENTSWEREINVESTIGATEDANDTHEQUANTITYOFPHOSPHATEINTHEMODIFIEDANDUNMODIFIEDPOLYSACCHARIDEWEREEVALUATEDASWELLRESULTSOFSINGLEF
6、ACTOREXPERIMENTSTEMPERATURE80，TIME5H，PH90，THEPHOSPHATECONCENTRATION010G/MLUNDERTHESECONDITIONS,THEGRAFTQUANTITYOFPHOSPHATEWAS9386THEORDEROFTHESEFACTORSAFFECTINGTHEREACTIONTHATDETERMINEDTHROUGHORTHOGONALTESTWASPHOSPHORICACIDREAGENTCONCENTRATIONSREACTIONPHREACTIONTIMETHEREACTIONTEMPERATURE,THEOPTIMUMC
7、OMBINATIONWASREACTIONTEMPERATURE90,REACTIONTIME6H,REACTIONPH90,PHOSPHORYLATIONREAGENTCONCENTRATION010G/ML,THENTHEMAXIMUMAMOUNTOFTHEQUANTITYOFPHOSPHATECANBEGREATERTHANOREQUALTO9965KEYWORDSENTEROMORPHAPOLYSACCHARIDE；PHOSPHORYLATION；OPTIMIZATIONOFPROCESSING1引言多糖作为生命活动四大基本物质之一,是一种重要的生物活性成分，在生命活动中发挥着重要作用
8、。多糖不仅参与细胞识别、分子识别、生物体受精生长发育以及免疫过程,而且还发现了其具有重要的医疗价值，有抗肿瘤、抗凝血和免疫调节等多种药理作用。随着糖生物学和糖化学的发展，多糖的生物活性越来越受到人们的重视，有关多糖生物活性的研究有了长足的进步和发展。据研究表明，浒苔水溶性多糖是药理活性很强的成分,具有很好的降血脂、抗疲劳、抗菌、抗病毒及增强免疫力等多种生物学活性。富含浒苔水溶性多糖的浒苔ENTERMORPHA为绿藻门CHLOROPHYTA、石莼目ULVALES、石莼科ULVALEAE藻类，是野生藻类资源中的优势种。浒苔营养丰富，含多种人体必需的氨基酸、脂肪酸、维生素和矿物质。同时，它还含有多种
9、活性功能成分如脂氧合酶和多糖类等，药用价值较高，开发潜力巨大。自古以来，浒苔即为食用和药用藻类，本草纲目中记载，浒苔可“烧末吹鼻止衄血；汤浸捣敷手背肿痛”14。虽然浒苔多糖具有丰富的来源并且具有较高的药用和食用价值，但由于它的生物活性受分子结构的的影响而大大限制了其在食品工业中的应用，因此可以通过通过对多糖的分子修饰改变其分子结构以提高它的应用范围。分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得众多结构类型衍生物的方法。已完成的研究证实,多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。分子修饰可通过改变多糖的空间结构、分子量及取代基种类、数目和位置而对其理化性质、生物活性、功
10、能特性产生影响。由此可分析多糖构效关系，并为多糖类药物及其他多糖产品的设计提供理论依据。选择合适的方法对多糖进行分子修饰，可改善其功能特性，提高其生物活性或降低其毒副作用。因此，对多糖进行分子修饰已成为多糖构效关系研究的重要手段，也是开发多糖产品的重要途径。将多糖或寡糖进行衍生化,如降解、硫酸化、磺酰化、乙酰化、烷基化等,有可能大大提高多糖的生物活性5。其它修饰方法,如磷酸酯化、硬脂酰化、棕榈酰化、二乙基氨基乙基化、羧甲基化、羧乙基化、碘化、氨化等。如对灵芝多糖进行硒化研究中将无机硒转化成有机硒不仅提高了吸收硒的能力而且经修饰后的灵芝硒多糖抗肿瘤和抗氧化活性均大大提高6。李庆伟等还在在小鼠试验
11、中发现灵芝硒多糖可明显增加小鼠血浆和肝GSHPX、SOD的活性,降低小鼠血浆和肝脏脂质过氧化产物含量,其作用效果明显强于灵芝多糖7。而在对分子进行磷酸化的研究中，蛋白分子磷酸化修饰以及对玉米淀粉的磷酸化修饰较多。食品蛋白通过磷酸化引入了大量带有负电荷的磷酸基团，增加了蛋白质分子之间的静电斥力，在溶液中更易分散，从而增加其溶解度；降低了乳化液的表面张力，增加乳化性和乳化稳定性；改变了等电点，有效地拓宽了其在食品的应用范围。植物中的淀粉磷酸酯化,使其在黏度、渗透性、凝胶性和吸水性等理化性能上有显著加强的特点。谢淑蓉4等阐述了淀粉磷酸化的机制，主要是利用一种叫做葡聚糖水合二激酶GLUCANWATER
12、DIKINASE,GWD的作用下完成淀粉的磷酸化。周家春8等则以淀粉冷冻状态下的持水能力为主要指标,从磷酸盐浓度、反应温度、反应时间、PH值等方面初步研究了磷酸化淀粉制备的工艺条件。以上均是针对蛋白质以及淀粉等大分子磷酸化的研究，而国内外在多糖磷酸化的研究甚少，因此对蛋白质和淀粉的磷酸化研究方法为后面我们探讨磷酸化浒苔多糖的工艺条件提供了借鉴意义。与其它大分子的化学修饰一样,多糖的磷酸化分子修饰也是一种共价修饰。多糖经过磷酸化分子修饰后,支链上的羟基被磷酸根取代,从而增强多糖抗肿瘤和抗氧化等的生物活性。DANA等10利用微晶纤维素与熔融尿素中的磷酸反应，介绍了水溶性纤维素磷酸化后在合成和表征上
13、的一些新的研究成果,由该方法可获得的DS的最大值约为1。对多糖的磷酸化这方面国内进行的研究较少，张难等1113采用混合磷酸盐试剂（三偏磷酸钠和三聚磷酸钠）对香菇多糖进行磷酸化修饰,并对其工艺条件进行了初步的探索研究，以修饰后香菇多糖的磷酸根接枝量、黏度为考察指标,通过单因素和正交实验,考察磷酸化试剂、温度、时间、PH值对修饰后香菇多糖磷酸根接枝量、黏度的影响。结果确定最佳磷酸化工艺条件为8混合磷酸化试剂、温度80、时间5H、PH值80,所得磷酸化香菇多糖衍生物的磷酸根接枝量为777,黏度测定表明香菇多糖经磷酸化后黏度几乎没有变化。并对修饰后的香菇多糖进行化学性质、物理性质以及对红外光谱的分析得
14、出修饰后的香菇多糖未受损伤且活性增加，最后通过正交试验确定最佳磷酸化工艺条件。此外宋玥等15研究并优化了磷酸化壳寡糖的制备工艺，通过单因素试验,考察磷酸化试剂、温度、时间、PH值对磷酸化壳寡糖磷酸根含量的影响。但是对于浒苔多糖磷酸化的报道到目前为止还没有，鉴于浒苔在食品中广泛的应用，经磷酸化后的浒苔多糖将有更大应用空间。本实验拟采用热水浸提法提取浒苔粗多糖，继而从反应温度、反应时间、PH和混合磷酸化试剂浓度等4个对浒苔多糖磷酸化反应有影响的方面进行单因素实验，并探讨浒苔多糖磷酸化反应的条件，通过正交实验优化浒苔多糖磷酸化反应的工艺条件。2材料与方法21材料211原料浒苔干品,由浙江省奉化市腾宇
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17、海仪器有限公司其他仪器烧杯、透析袋，超滤离心管、容量瓶、移液枪、锥形瓶、试管、量筒、离心管、玻璃棒、冰箱等等。23实验方法231粗多糖的提取与制备本实验采取热水浸提法提取粗多糖，并用木瓜蛋白酶脱蛋白，30双氧水脱色纯化粗多糖。具体流程如下浒苔干品热水浸提抽滤超滤酶法脱蛋白双氧水脱色抽虑浓缩4倍体积95乙醇沉淀真空冷冻干燥浒苔粗多糖苯酚硫酸法测多糖含量具体步骤浒苔干品粉碎过筛后取2040目部分,用热水浸提，。取容积为1L的烧杯，称取15G浒苔粉，加水溶解，175的固液比，并放入温度为90的水浴锅中水浴4H。4H后取出置于通风处冷却，进行抽滤后过3000DA膜超滤。将超滤后的样液置于温度为60的水
18、浴锅中，并加入木瓜蛋白酶水浴35H，目的是脱蛋白。此处是经过考马斯亮蓝法测定蛋白含量确定使用木瓜蛋白酶来脱蛋白。然后加入30双氧水脱色并放入温度为60的水浴锅中水浴4H。离心过滤取浸提液并旋转蒸发浓缩,然后加4倍体积的无水乙醇沉淀,将醇沉后的多糖醇溶液离心，参数为5000R/MIN，20MIN。将离心后的多糖加水复溶后再冷冻干燥后即可得到浒苔粗多糖。称取一定量浒苔粗多糖溶解于蒸馏水中，在恒温水浴中溶解得到待反应液。232磷酸化反应向制备好的待反应液中加入一定量的磷酸化试剂，在恒温水浴锅中充分溶解冷却后调节PH，在一定温度下反应一定时间，反应后样液用4倍体积乙醇醇沉24H。将醇沉多糖冷冻干燥，再
19、于60水浴锅中加水复溶，接着将复溶后的溶液放在透析袋中（截留分子量为10000DA）中用蒸馏水透析2D，透析过程中每隔12H更换透析液，以加快透析速度，将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得到浒苔粗多糖磷酸化衍生物。233样品磷酸根的测定2331磷酸根标准曲线的绘制采用钼蓝比色法,原理样品经灰化后，在酸性溶液中，磷酸盐与钼酸铵作用产生淡蓝色的磷钼酸铵，遇还原剂后产生亮蓝色络合物钼蓝，比色测定，则可测定出样品中的磷含量。步骤以磷酸二氢钾为标准物，做两个平行组，分别置于25ML的比色管中,依次加入520ML的钼酸铵溶液,摇匀,静置几秒后,分别加入210ML亚硫酸钠溶液和0510ML的对苯二酚
20、溶液,摇匀,加水至刻度,静置30MIN后,以参比调零,在660NM处测定吸光度,以磷酸根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2332样品磷酸根含量的测定取适量的样品于烧杯中,分别加入1ML的浓硝酸和浓硫酸,在电炉上加热至冒烟,待冷却后加入1ML的30的过氧化氢,再缓慢加热,重复以上的步骤直至瓶内不再冒烟,溶液呈无色透明或淡黄色冷却后加入1ML6MOL/ML的盐酸,在电炉上加热使酸彻底分解,用蒸馏水稀释到50ML的容量瓶中。取5ML按照钼蓝比色法的步骤测定磷酸根含量。234磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响磷酸化试剂不同可能导致多糖磷酸化反应的磷酸根接枝量的差异，将三聚磷酸钠和三偏磷酸钠
21、选择为磷酸化试剂，在总量相同的情况下两者按照不同比例与多糖进行磷酸化反应，测定接枝量后选择最优组合，步骤如下准备8个空离心管，编号，浒苔粗多糖并加水溶解制成多糖反应样液，按照以下质量比分别加入三聚磷酸钠和三偏磷酸钠的混合物7/0,0/7,1/6,2/5,3/4,4/3,5/2,6/1。在温水浴中溶解，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，反应时间2H，反应PH60，用4倍乙醇醇沉24H。冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，消化，将溶液中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷含量。235单因素实验工艺优化影响浒苔粗多糖磷酸化修饰的因素很多。如反应温度、反应时
22、间、反应PH、磷酸化试剂浓度等。为提高浒苔粗多糖的磷酸根含量，采用单因素试验找出影响浒苔粗多糖磷酸根接枝量的关键因素。2351反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响反应温度是影响磷酸化反应的重要因素。根据上面已选出的混合磷酸化试剂，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，反应时间2H，反应PH60，将温度分别设置为20，40，60，80，90，100，反应2H用4倍乙醇醇沉24H。将醇沉后的多糖冷冻干燥，加水复溶后透析，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。2352反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响在
23、化学反应中时间是一个重要的因素，时间不同最后的结果也不相同。我们将反应时间分别设置为2H,3H,4H,5H,6H,7H，研究在不同反应时间下对浒苔多糖磷酸化反应的影响。步骤根据上面选取的磷酸化试剂及其浓度，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，调节反应PH60，在80水浴锅中反应2H后加入4倍体积乙醇，醇沉24H。将醇沉后的多糖冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。2353反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响改变反应环境的PH也可能对反应结果产生影响。将PH作为单因素考
24、察其对反应的影响。步骤根据上面选取的磷酸化试剂，固定磷酸化试剂浓度为01G/ML，将反应样液加入混合磷酸盐后，将PH分别调节为50，60，70，80，90，100，110。反应温度80，反应时间5H，反应完成后加入4倍体积乙醇醇沉24H。冷冻干燥，加水60水浴中复溶，放入透析袋中透析2D（每间隔12H换水一次），冷冻干燥。加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，按照钼蓝比色法测定磷酸根含量。2354磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响在上面步骤中我们选取了两种磷酸化试剂比例为61，但是磷酸化试剂在整个反应中所占的比例对浒苔多糖磷酸化反应也可能产生影响，因此这里将磷酸化试剂浓度作为单因素，研究它
25、对磷酸化修饰的影响。步骤在7个离心管中加入相同体积的反应样液后分别加入002，004，006，008，01，012，014（G/ML）的混合磷酸化试剂（STPPSTMP61）,调节PH60，置于80水浴锅中反应5H加入4倍体积乙醇，醇沉24H，冷冻干燥，加水复溶后透析2D，冷冻干燥，得到浒苔多糖的磷酸化衍生物，加1ML浓硫酸和1ML浓硝酸消化，将多糖中的有机磷消化为无机磷按照钼蓝比色法测定样品中的磷酸根含量。236浒苔粗多糖磷酸化正交试验工艺优化2361正交实验根据单因素实验的结果，选择混合磷酸化试剂浓度、反应温度、反应时间及PH四个因素，各取三个水平，采用L934正交实验设计，因素水平见表1
26、水平A反应温度B反应时间HC反应PHD混合磷酸试剂浓度（G/ML）1704800828059010390610012表1因素水平表TABLE1FACTORLEVELTABLE2362验证试验以优化所得工艺条件进行验证实验,每个实验平行做3份。3结果与讨论31粗多糖的提取采用热水浸提法（工艺参数为温度90，固液比175，时间4H）提取粗多糖得率可达1612。相对于其他对提取浒苔水溶性多糖的研究来说（张智芳等17浸提液PH值50，温度70，固液比180，提取时间为2H，在此实验条件下多糖得率为948）提取率较高，提取效果较为显著。原因可能是提取温度较高提取时间稍长，使浒苔水溶性多糖溶解更加充分导致
27、最终得率的升高。多糖的提取方法很多，主要有热水浸提法、酶法提取、超声法提取、超临界萃取法等。但由于热水浸提法工艺简单，操作方便，得率较高等优点，目前国内提取多糖大多采用热水浸提法，如高梦祥等对海带多糖的提取中运用了此方法，徐大伦16等用热水浸提法通过单因素实验确定其最佳提取工艺条件为浸提时间4H,温度90,固液比为175此外张智芳等也用热水浸提法对浒苔多糖进行工艺优化，设计了单因素四水平的正交实验研究PH、温度、浸提时间和固液比对多糖得率的影响。多糖与蛋白质两种高分子成分共存，且两种物质分子量相近，另外多糖常常与蛋白形成糖蛋白复合物，脱蛋白质成为多糖纯化的一个重要步骤。主要用到的是SEVEAG
28、E法，三氯乙酸法、酶法等。通过比较得出采用木瓜蛋白酶脱蛋白既经济又有效，因此本法中采用木瓜蛋白酶脱蛋白。此外浒苔多糖中还含有大量的色素，色素的取出常采用吸附法（纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等）、离子交换法、金属络合物法等。采用热水浸提法提取浒苔水溶性多糖，操作方便、简单，成本较低，适合工业化大规模提取，对于扩大浒苔多糖在食品工业中的应用范围也有帮助。32样品磷酸根测定Y03957X00214R2099950051152250123456磷酸根浓度（微克/ML）吸光度A图1磷酸根含量标准曲线FIG1THECALIBRATIONCURVEOFPHOSPHATE磷酸根标准曲线见图1。对于样品中的磷
29、酸根含量测定可从下列换算公式中求出磷酸根含量磷酸根含量（）A00214/03957102/M100其中A为样品在660NM处测定的吸光度，M为样品质量，G。为了提供浒苔粗多糖磷酸化修饰后磷酸根含量的对照依据，本研究在单因素实验前，首先测定了未经磷酸化修饰的浒苔粗多糖的磷酸根含量为1850。33磷酸化试剂对浒苔粗多糖磷酸化的影响15171921232527297007162534435261STPPSTMP质量比磷酸根含量（）图4磷酸化试剂对磷酸化反应的影响FIG4THEEFFECTSOFPHOSPHORYLATIONREAGENTONPHOSPHORYLATION由图4知，单独使用这两种试剂时
30、的磷酸根含量明显较混合使用的低。这可能是由于两种试剂共同作用，可以在磷酸化反应过程中起到相互催化、互补的作用。然后将两种试剂按照不同比例的混合物作用于浒苔多糖，发现对浒苔磷酸化影响并不显著，其中选择混合磷酸盐且两者质量比为61作用于浒苔多糖时，可达到较佳的效果，磷酸根含量可达到264，因此选择两种磷酸化试剂比例61的混合磷酸盐作为浒苔多糖磷酸化反应的磷酸化试剂。34单因素实验工艺优化341反应温度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响1152253354455551030507090110温度（）磷酸根含量（）图5反应温度对磷酸根接枝量的影响FIG5THEEFFECTOFTEMPERATUREONTHE
31、AMOUNTOFPHOSPHATE由图5可知反应温度对磷酸化修饰影响显著，温度升高时磷酸根含量明显增加，且增加幅度明显，当反应温度达到80时磷酸根含量达到最大，高达5044。这可能是因为温度升高增加化学反应的能量，是高分子键的活性增强，使得浒苔多糖与磷酸化试剂的反应机会增加，导致最后的磷酸根含量显著增高。当温度超过80时，磷酸根含量略有下降，初步分析可能有以下两个原因温度过高，大分子多糖产生焦化作用，从而降低了与磷酸化试剂的结合率；温度过高，磷酸化试剂间发生结合作用，使游离的磷酸化试剂减少，间接降低了磷酸化试剂的浓度。综合考虑选取80作为磷酸化反应的温度条件。342反应时间对浒苔粗多糖磷酸化修
32、饰的影响4567812345678反应时间（H）磷酸根含量（）图6反应时间对磷酸化反应的影响FIG6THEEFFECTSOFREACTIONTIMEONPHOSPHORYLATION有图6可知，反应时间5H时，磷酸根含量最高。随着反应时间的延长，磷酸根含量呈逐步升高趋势，这可能是由于反应比较充分，磷酸根与浒苔多糖充分接触磷酸根含量也逐步增大。当反应时间达到5H后，时间继续延长而磷酸根含量反而出现了一些下降趋势，这可能是由于多糖在高温下长时间反应使多糖发生降解或者长时间的反应使已经结合的磷酸化多糖再次分离从而使磷酸根含量下降。因此确定5H为最佳反应时间。343反应PH对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响
33、012345678910456789101112反应PH磷酸根含量（）图7反应PH对磷酸化根接枝量的影响FIG7THEEFFECTSOFPHONPHOSPHORYLATION由图7可知，反应PH对磷酸化反应后浒苔多糖的接枝量有显著影响。磷酸根含量在PH为90时，达到最大值，高达875。这可能是由于在该条件下，PH对磷酸化反应的进行起到了催化作用，使浒苔多糖链上的羟基更易被磷酸根取代，因此使得磷酸根含量大为增加。而在反应体系在强酸（PH50）或强碱（PH110）下反应时，磷酸根含量较低,这可能是由于三聚磷酸钠和三偏磷酸钠在较低的PH下不稳定，会分解成活性较低的焦磷酸钠和正磷酸钠，而PH过高会对磷
34、酸化试剂与多糖的酯化反应产生不良的影响。三聚磷酸钠和三偏磷酸钠两种磷酸化试剂本身就是良好的缓冲液，因此当PH变化时，反应后的磷酸根含量也会出现波动。344磷酸化试剂浓度对浒苔粗多糖磷酸化修饰的影响024681012000200400600801012014016磷酸化试剂浓度（G/ML）磷酸根含量（）图8磷酸化试剂浓度对磷酸化反应的影响FIG8THEEFFECTSOFTHECONCENTRATIONOFPHOSPHORICACIDREAGENTONPHOSPHORYLATION由图8可知，一定范围内（002014G/ML），EP结合磷的含量随着磷酸盐浓度的提高而增加，这可能是因为随着磷酸盐浓度
35、增大,磷酸盐之间的结合迅速上升,造成结合磷的含量增加，而当浓度高于01G/ML时，磷酸根含量维持平衡，这可能是由于高浓度的磷酸化试剂使EP结合磷达到饱和。因此综合考虑确定磷酸化试剂浓度为01G/ML。345单因素实验结论通过上述单因素实验，初步得出浒苔多糖磷酸化修饰的最佳工艺条件，即磷酸化试剂为三聚磷酸钠和三偏磷酸钠（质量比61）的混合磷酸盐，浓度为010G/ML，反应时间为5H，温度80，反应PH为90。35浒苔多糖磷酸化正交试验工艺优化351实验结果及分析试验号ABCD磷酸根含量11111601221222996531333850642123964352231676962312860773
36、1328338832138633933218705K18161799877517162K283484569438897K38559860678718927极差R0398060816871808因素主次DCBA优方案A3B3C2D2表2实验结果及分析TABLE2EXPERIMENTALRESULTSANDANALYSIS经极差分析结果可知影响磷酸化浒苔粗多糖的磷酸根接枝量的顺序为磷酸化试剂浓度反应PH反应时间反应温度，即磷酸化试剂浓度对磷酸化反应影响最大，其次是反应PH，而反应时间和反应温度的影响并不显著。其最优组合为A3B3C2D2即反应温度为90，反应时间为6H，反应PH为90，磷酸化试剂浓
37、度010G/ML。352验证试验结果表明,在此条件下所获得的磷酸化浒苔多糖的磷酸根含量为（92410170）。表明优化所得的工艺稳定,重复性较好，磷酸根接枝量较高。在已经发表的有关多糖磷酸化的研究中，研究者大部分也是从反应温度、时间、PH和混合磷酸盐的浓度等四个方面着手考察最终磷酸化多糖的磷酸根接枝量，其中比较有代表性的就是张难1113等对香菇多糖磷酸化反应工艺条件的优化结果确定最佳磷酸化工艺条件为8混合磷酸化试剂（STPPSTMP52）、温度80、时间5H、PH值80,所得磷酸化香菇多糖衍生物的磷酸根接枝量为777，而宋玥等15对磷酸化壳寡糖的制备工艺优化时，通过单因素试验,考察磷酸化试剂、
38、温度、时间、PH值对磷酸化壳寡糖磷酸根含量的影响所确定的最佳磷酸化工艺条件为以浓度5的多聚磷酸钠STPP和浓度1的六偏磷酸钠SHMP的混合液作为磷酸化试剂,温度80,时间4H,PH值70。在此最佳条件下所得磷酸化壳寡糖的磷酸根含量为1873。显然，采用本试验方法所得的最终磷酸根含量最高，该研究可为磷酸化浒苔多糖在食品领域的应用提供试验基础。4结论（1）在试验设计范围内，影响磷酸化浒苔粗多糖磷酸根含量的单因素顺序为磷酸化试剂浓度反应温度反应时间反应PH，即磷酸化试剂浓度对磷酸化反应影响最大，其次是反应PH，而反应时间和反应温度的影响并不显著。（2）反应温度为90，反应时间为6H，反应PH为90，
39、磷酸化试剂浓度010G/ML。在此条件下浒苔粗多糖磷酸根接枝率除去空白的浒苔粗多糖所含磷酸根含量后可达到9241。通过对工艺条件的优化所获得的多糖磷酸化衍生物在保健因子、功能性食品或药品领域中的应用提供了基础的理论依据,在实践中具有指导意义。而真实值比理论值偏低，可能是试验过程中仍存在干扰因素，建议在深入研究过程中考虑的因素能更彻底、更全面。5展望浒苔水溶性多糖是药理活性很强的成分,具有很好的降血脂、抗疲劳、抗菌、抗病毒及增强免疫力等多种生物学活性。浒苔多糖经过磷酸化分子修饰即支链上的羟基被磷酸根取代后,可以增强多糖抗肿瘤和抗氧化等的生物活性，大大提高了浒苔多糖的营养及药用价值，也拓宽了浒苔多
40、糖在食品及医药行业的应用范围。本实验完成了对浒苔磷酸化工艺条件的优化，为浒苔多糖的精深加工提供了科学参考。拟在本实验的基础上进一步研究浒苔多糖磷酸化的取代位点以及经磷酸化修饰后浒苔多糖抗氧化活性的变化，以便为浒苔多糖在保健食品和医药方面的应用提供科学参考参考文献1徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔多糖的分离纯化及其对非特异性免疫功能的体外实验研究J中国食品学报,2006,6517202林文庭,张智芳浒苔多糖降血脂及抗脂质过氧化作用J中国公共卫生生,2009,2555675703徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔多糖对扇贝SOD和溶菌酶活力的影响J水利渔业,2005,25322234徐大伦,黄晓春,杨文鸽等
41、浒苔多糖的分离纯化及其对非特异性免疫功能的体外实验研究J食品科学,2005,2562322355阳佛送,李雪华多糖结构研究的方法和进展J食品安全与检测,2008,32012036和朝军,李景原,广雍,等芝硒多糖的研究进展J河南农业科学,2005,99117李庆伟,尚德静,崔乔,等灵芝硒多糖SEGLP1抗氧化与抗肿瘤作用的研究J营养学报,2002,2432492518谢淑蓉,浦跃武,张本山植物体内的淀粉磷酸化J农产品加工,2006557599周家春,张达力,曾瀚权淀粉磷酸化及其抗冷冻脱水的研究J广州食品工业科技,1999,161434510DANAMIHAELASUFLET,GABRIELLEC
42、HARLOTTECHITANU,VALENTINIPOPAPHOSPHORYLATIONOFPOLYSACCHARIDESNEWRESULTSONSYNTHESISANDCHARACTERISATIONOFPHOSPHORYLATEDCELLULOSEJSCIENCEDIRECT,2006661240124911张难,吴远跟,莫莉萍等磷酸化香菇多糖制备工艺的研究J食品科技,2008,2818512张难,邱树毅,莫莉萍等磷酸化香菇多糖的工艺优化J工艺技术,2008,29518713张难,邱树毅,吴远跟等磷酸化香菇多糖的制备及其部分理化性质的研究J食品研究与开发,2008,298212414TAR
43、ELLIE,WHEELERSFDRYINGFROMPHOSPHATEBUFFEREDSOLUTIONSCANRESULTINTHEPHOSPHORYLATIONOFPRIMARYANDSECONDARYALCOHOLGROUPSOFSACCHARIDES,HYDROXLYATEDAMINOACIDS,PROTEINS,ANDGLYCOPROTEINSJANALBIOCHEM,1994,22219620115宋玥,林强磷酸化壳寡糖制备工艺研究J安徽农业科学,2010,381485016徐大伦,黄晓春,欧昌荣等浒苔水溶性多糖提取的工艺研究J（浙江海洋学院学报自然科学版,2005,241666817张智芳,林文庭,陈灿坤浒苔水溶性多糖提取工艺研究J中国食物与营养,2009,33941
