1、本科毕业设计（20_届）环境废物净化光合菌的筛选及其代谢特性初步研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录1前言22材料与方法221实验材料2211实验试剂2212仪器设备3213培养基3214采集样品322实验方法3221光合细菌的富集、分离纯化及保存3222光合细菌代谢特性的初步研究43结果与讨论431菌株的分离纯化432三个光合细菌菌株的生长曲线433三株光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢能力的初步探究5331培养基组分对三株光合菌（PSBS，PSBL，PSBH）生长的影响5332三个光合细菌菌株对PO43的代谢能力的定量分析5333三个光合细菌菌株对NA2
2、S的代谢能力的定量分析7334三个光合细菌菌株对KNO3的代谢能力的定量分析74结论与建议8致谢错误未定义书签。参考文献9附录错误未定义书签。I摘要从自然界中分离一株光合细菌，对其代谢特性进行初步研究，为其在环境废物净化方面的应用奠定基础。采用厌氧培养法富集光合菌，半固体试管法和双层平板法划线分离单菌落，得到了PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌。通过在富集培养基中添加KH2PO4、NA2S和将氯化铵替换为KNO3进行培养来研究其对氮、磷、硫化合物的代谢能力。结果表明，在改动后的培养基中，三株光合菌都能生长；PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌培养4天后对磷酸盐的代谢率分别为1580、
3、1349和1301；在培养了6天后，对硫化物的代谢率分别为4658、3288和3918；在培养了17天后，对硝酸盐的代谢率分别为9638、8931和9004。关键词光合细菌；分离；代谢特性。ABSTRACTINORDERTOMAKEAFOUNDATIONOFDISPOSINGTHEENVIRONMENTALWASTEBYPHOTOSYNTHETICBACTERIA,THREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS,WHICHWERENAMEDPSBL、PSBH、PSBS,WEREISOLATEDFROMTHEENVIRONMENTANDTHEIRMETABOLICCHARACTERSW
4、EREPRELIMINARYSTUDIEDTHESINGLECOLONIESWERESEPARATEDTHROUGHANAEROBICFERMENTATION,SEMISOLIDTUBEANDDOUBLELAYERPLATESANDTHEIRMETABOLICCHARACTERSWERESTUDIEDBYCULTUREDINTHEMEDIUMWHICHWEREADDEDKH2PO4、NA2SORREPLACEDNH4CLWITHKNO3ONTHEBASISOFENRICHMENTMEDIUM,RESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHATTHETHREEPHOTOSYNTHE
5、TICBACTERIAS,PSBL、PSBH、PSBS,WEREALLABLETOGROWINTHECHANGEDMEDIUM,ANDTHEMETABOLICRATEOFKH2PO4WERE1580、1349AND1301AFTER4DAYSCULTURED,THEMETABOLICRATEOFNA2SWERE4658、3288AND3918AFTER6DAYSCULTURED,THEMETABOLICRATEOFKNO3WERE9638、8931AND9004AFTER17DAYSCULTURED,RESPECTIVELYKEYWORDSPHOTOSYNTHETICBACTERIAISOLA
6、TIONMETABOLICCHARACTERS21前言光合细菌PHOTOSYNTHETICBACTERIA,PSB是一类能进行光合作用但不产生氧气的特殊生理类群的原核生物的总称，广泛存在于自然界中，在水田、河流、池塘、海洋及土壤中都有分布。是地球上最古老的生物之一。光合细菌的生理类型很复杂，在不同环境下，有不同的代谢类型，能够代谢含有氮、磷、硫元素的化合物，在自然界物质循环中起重要作用1。光合细菌还具有产氢的特性，在解决能源危机方面很有前景，所以国外大部分学者都在研究光合菌产氢的特性，如YASUOASADA等2重新评价了一些能够利用醋酸作为碳源的光合菌产氢的能力，并与以乳酸作为碳源的菌株做比较
7、。而国内的学者主要集中在废水处理的应用上，邹文娟等3研究了光合细菌和枯草芽孢杆菌在污水处理方面的效果，发现两种菌混合起来能够很好的除去氨氮和活性磷酸盐。国外也有学者做此方面的研究，如KENJITAKENO等4对利用光合菌除去牡蛎养殖场底泥中分的含磷化合物进行了研究。光合细菌菌体富含蛋白质、氨基酸、辅酶Q及B族维生素等多种生理活性物质，能够提供生物体所必需的营养，增强其抗病能力5。但国内的研究大多放在水产养殖方面，赵倩等6阐述了光合细菌在水产养殖上的应用和注意事项。王志永等7研究了将光合细菌作为火烈鸟的饲料添加剂的效果，优化了火烈鸟的饲养方法，但火烈鸟主要栖息在有大片水域的地方。王玲娜等8研究了
8、光合细菌作为鱼类饵料添加剂的效果，结果表明黑曲鱼添加光合菌的实验组比对照组成活率显著提高了20。近些年来畜禽养殖业不断发展，相应带来了一系列的问题，畜禽养殖对饲料的需求增加，导致各种化学药物和激素的滥用，进而引发食品安全问题；畜禽养殖排泄物对环境的污染问题等等。光合细菌在畜禽养殖方面的应用也有研究，但报道较少。陈坤等9报道了光合细菌在处理农村猪场污水的效果，发现光合细菌与水浮莲共同作用，使污水的总氮量和总磷量分别下降了418和618。本文希望从自然界中分离几株光合细菌，筛选出一株对含有氮、磷、硫元素的化合物有较好代谢能力的菌株10，初步探究其净化环境方面的能力，为将来制作混合菌剂用于作畜禽养殖
9、的饲料添加剂，提高饲料利用率，减少饲料消耗，降低成本，净化畜禽养殖环境奠定基础。2材料与方法21实验材料211实验试剂NACL、MGSO47H2O、CACL2、NH4CL、CH3COONA、KH2PO4、K2HPO4、KNO3、NA2S、AGNO3等均为分析纯，琼脂粉（杭州微生物试剂有限公司），酵母膏（国药集团化学试剂有限公司）。磷酸盐工作溶液（1ML含01MGPO43）称取在105干燥过的KH2PO41433G，溶于蒸馏水中稀释定容至1000ML，制成磷酸盐标准溶液，将磷酸盐标准溶液用蒸馏水稀释10倍，既得磷酸盐工作溶液。钼酸铵硫酸混合溶液于600ML蒸馏水中缓慢加入167ML浓硫酸（184
10、G/ML），冷却至室温，称取20G钼酸铵NH46MO7O244H2O，研磨后溶于上述硫酸溶液中，用蒸馏水稀释至1000ML。氯化亚锡甘油溶液（15G/L）称取15G优级纯氯化亚锡于烧杯中，加20ML浓盐酸（119G/ML），加热溶解后，再加80ML纯甘油（丙三醇），搅匀后转入塑料瓶中备用（密封保存，室温下不超过20天）。硫代硫酸钠标准溶液（01000MOL/L）称取25G硫代硫酸钠（NA2S2O35H2O）溶于煮沸放冷的蒸馏水中，加水至1000ML，加入04G氢氧化钠或02G无水碳酸钠，贮存在棕色瓶中。按下述方法标定浓度取碘酸钾（KIO3）在105烘烤1H，置于干燥器内冷却30MIN，用万分之
11、一天平准确称取两份各015G，分别放于250ML碘量瓶中，各加100ML蒸馏水，待碘酸钾溶解后，各加3G碘化钾及10ML冰乙酸，暗处静止10MIN，用待标定硫代硫酸钠溶液滴定，至溶液呈淡黄色时，加入1ML05淀粉溶液，继续滴定至蓝3色退去为止，记录硫代硫酸钠溶液的用量，按A式计算硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度。67351000VWMA式中M硫代硫酸钠溶液的摩尔浓度，MOL/L；W碘酸钾的重量，G；V硫代硫酸钠溶液的用量，ML。两次标定结果之间相差不得大于02。碘溶液（0005MOL/L）称取碘化钾40G，加蒸馏水25ML溶解，再加碘13G，搅拌使完全溶解，用蒸馏水稀释至1000ML，加3滴浓盐酸，盛
12、于棕色瓶中，保存在暗处，此溶液稀释10倍，既得0005MOL/L的碘溶液。淀粉溶液（05）称取05G可溶性淀粉，用少量蒸馏水调成糊状，用刚煮沸的蒸馏水稀释至100ML，冷却后加01G水杨酸或04G氯化锌。NA2CO3溶液（10G/L）。二磺酸酚溶液称取15G结晶酚（C6H5OH）于250ML锥形瓶中，加入105ML浓硫酸（184G/ML），放一短颈漏斗在瓶口，水浴加热，直至生成浅棕色稠状液，保存于棕色玻璃瓶中。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液（20G/L）。氢氧化钾溶液C（KOH）10MOL/L。硝酸根标准溶液（100UG/ML）称取01631GKNO3与烧杯中，蒸馏水溶解后移入1000ML容
13、量瓶总，稀释至刻度，摇匀。此溶液100ML含1000UG硝酸根。212仪器设备SLN电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司TDL5台式低速大容量离心机，江苏金坛市医疗仪器厂LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂RXZ智能型人工气候箱，宁波江南仪器厂超级洁净工作台，上海淀山湖净化设备厂T6新锐可见分光光度计，上海普析通用仪器有限责任公司电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司213培养基富集培养基11,12乙酸钠30G，氯化铵10G，NACL10G，K2HPO405G，KH2PO405G，MGSO405G，CACL2005G，酵母膏20G，水1000ML，PH68半固体培
14、养基在富集培养基的配方中添加1的琼脂。含硝酸盐的培养基13将富集培养基的氯化铵去掉，换成20G的KNO3。含磷酸盐的培养基14在富集培养基中多添加20G的KH2PO4。含硫化物的培养基15在富集培养基的配方中添加20GNA2S。214采集样品从林杏琴会堂对面的水池采集样品1；从海运学院对面的水池采集样品2；从双桥的水沟采集样品3。22实验方法221光合细菌的富集、分离纯化及保存（1）光合细菌的富集16,17。以18MM180MM的试管作为厌氧培养容器，注入富集培养基，液面距离4试管口留有2CM的空隙。取适量从环境中采集的样品（水与底泥）注入试管中，用液体石蜡密封，塞好橡皮塞，放到光照培养箱中在
15、30下，光照强度20003000LX培养，直至培养液出现红色或棕红色，吸取1ML富集培养液到另一只盛有新鲜富集培养基的试管中培养，重复上述操作45次，此时富集培养液中主要是光合细菌菌群。（2）光合细菌的半固体试管法分离纯化。取1ML光合细菌的富集培养液进行梯度稀释，分别取104、105、106、107等几个浓度（具体浓度梯度根据富集培养液的颜色深浅决定）菌悬液1ML接种于盛有融化状态的半固体培养基的试管中（培养基的温度以不烫手为准，太热会把光合菌烫死），在半固体培养基凝固前反复翻转，使光合细菌均匀的分布在半固体培养基中，然后放到光照培养箱中培养，直至试管中出现单菌落。（3）双层平板法纯化光合细
16、菌。挑取试管中的单菌落在半固体培养基的平板上划线，再在上面倒一层半固体培养基，造成厌氧环境，用保鲜膜封口，放到光照培养箱中培养。挑取单菌落镜检，达到菌株纯。（4）光合细菌的保藏。挑取菌株纯的单菌落用富集培养基培养，然后梯度稀释富集培养液按半固体试管法培养，待试管中出现单菌落后，将含有十几个到几个单菌落的试管放到冰箱中4保藏。222光合细菌代谢特性的初步研究（1）生长曲线的测定17。取三个菌株单菌落培养后的菌液1ML接种到新的100ML的富集培养基中，在光照培养箱中培养。每隔24H取样，用分光光度计在（T6新锐）于660NM处测定OD值，连续测定7天，按OD值与时间的关系绘制三株光合细菌的生长曲
17、线。（2）光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢实验。A定性试验10，含有氮、磷、硫化合物的培养基三种，每种培养基注入6支试管中，每种培养基各有两支接种同一种光合菌，然后以富集培养基培养的三种光合菌作对照，培养7天后于660NM处测吸光值，比较其生长状况。B定量实验，分别向锥形瓶中注入含有氮、磷、硫化合物的培养基各100ML，然后分别接种三个菌株的对数期菌悬液10ML，以不接种光合菌的培养基做对照，放到光照培养箱中培养。（3）对培养基中氮、磷、硫化合物的残留量的测定。磷酸根的测定方法采用磷钼蓝比色法18。硫化物的测定方法采用碘量法19。硝酸根测定的方法采用二磺酸酚分光光度法20。3结果与讨论31菌株的
18、分离纯化从三个地点采样，采用厌氧培养富集，双层平板法划线分离，得到三个菌株，分别命名为PSBL（从林杏琴会堂对面的水池采集的样品1中分离得到）、PSBH（从海运学院对面的水池采集的样品2中分离得到）、PSBS（从双桥处得水沟采集的样品3中分离得到）。其中PSBL和PSBH菌株在光照厌氧条件下富集培养基菌液呈深红色，PSBS菌株的菌液在试管培养时有点偏橙黄色，锥形瓶培养时呈红色。镜检观察三个菌株的菌体都为卵圆形。32三个光合细菌菌株的生长曲线分别取PSBL、PSBH、PSBS三个菌株的菌悬液1ML接种到100ML新鲜的富集培养基中，在660NM测定吸光值，每隔24H测定一次，以OD值与培养时间的
19、关系做三株光合细菌的生长曲线（见图1）。试验结果表明在48H左右时三个菌株都进入对数生长期，72H后细菌总量达到最大值，即进入光合细菌生长的稳定期，此时菌体最多，代谢效率最高，适合观察三株光合菌对氮、磷、硫化合物的代谢能力，因此取培养72小时后的菌进行代谢活性的研究。5图1三个光合菌株的生长曲线FIG1THEGROWTHCURVESOFTHETHREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS33三株光合细菌对氮、磷、硫化合物代谢能力的初步探究331培养基组分对三株光合菌（PSBS，PSBL，PSBH）生长的影响分别以盛有含硝酸盐的培养基、磷酸盐的培养基和硫化合物的培养基的试管作为实验组，
20、以富集培养基作为对照组，分别接种三个光合细菌菌株富集培养72H后的菌悬液1ML，在厌氧、光照、30条件下培养10D，将菌悬液稀释6倍，在660NM处测OD值，观察氮、磷、硫化合物对三株光合细菌生长的影响，结果如图2。图2结果表明，三个光合细菌菌株在含有氮、磷、硫化合物的培养基中都有生长，但氮、磷、硫化合物对不同的菌株的生长的影响是不同的。将培养基中的氮源完全替换为KNO3，对光合菌的生长有负面影响，三株菌的生长状况较对照组都减弱，其中PSBH菌株生长减弱的程度最大。而在富集培养基中添加2G/L的NA2S并没有对三株光合菌的生长产生负面影响，三株光合菌相对于富集培养基中的对照组，生长量都有不同程
21、度的增加，其中PSBL增加的程度最大。当KH2PO4增加到25G/L时，刺激了三株光合菌的生长，与各自的对照组相比，PSBL的生长量增加程度同样最大。根据三个菌株的生长受氮、磷、硫化合物影响的程度的不同，将PSBL列为重点观察菌株。图2培养基组分对三株光合菌生长的影响FIG2THEEFFECTIONOFTHEMEDIUMCOMPONENTSONTHEGROWTHOFTHETHREEPHOTOSYTHETICBACTERIAS332三个光合细菌菌株对PO43的代谢能力的定量分析6磷酸盐标准曲线的制备。取10支具有磨口塞的25ML比色管，按表1配制各管溶液，混匀后于660NM处测其OD值，根据OD
22、值与磷酸盐含量的关系绘制标准曲线（图3）。表1磷酸盐标准曲线的制作TAB1PREPARATIONOFSTANDARDCURVEOFPHOSPHATE管号0123456789项目磷酸盐工作溶液/ML000010020040060080100150200250蒸馏水稀释/ML20202020202020202020钼酸铵硫酸混合溶液/ML25252525252525252525氯化亚锡甘油溶液/滴3333333333定容至/ML25252525252525252525在10个100ML的锥形瓶中各注入100ML含磷酸盐的培养基，取培养72H后的三个光合细菌的悬浮菌液各10ML分别接种3瓶作为实验组
23、，留下一个不接种细菌的培养基作为对照，在厌氧、光照、30条件下培养4D，将发酵培养液离心（3000R，5MIN）过滤，取滤液稀释400倍，用磷钼蓝比色法18测稀释后滤液中PO43的浓度，结果见表2。图3磷酸盐标准曲线FIG3THESTANDARDCURVEOFPHOSPHATE表2三个菌株对PO43的代谢能力TABLE2THEPO43METABOLICCAPACITYOFTHETREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS菌株起始PO43/MG/L4DPO43/MG/ML4D代谢率/实验组对照PSBH2402199723761349PSBL2402194323761580PSBS240
24、2200823761301表2结果表明，三株光合细菌对磷酸盐都有较好的降解能力，而且三株光合菌的生长都明显加快，4天后PSBH、PSBL、PSBS对PO43的代谢率分别为1349、1580和1301，其中PSBL菌株的降解能7力最强，为1580，与由图2得出的PSBL在磷酸盐增加时，生长增加的幅度最大的结论是相符的。333三个光合细菌菌株对NA2S的代谢能力的定量分析同样用对对PO43的代谢能力的定量分析的分组方法，将培养基换成含硫化物的培养基，在厌氧、光照、30条件下培养6天，应用碘量法测定NA2S的残留量，其中空白组是用水、滤纸与碘液混合，然后用NA2S2O3标准溶液滴定；实验组是用接种光
25、合菌的培养液与碘液混合，然后用NA2S2O3溶液滴定；对照组是以不接种光合菌的培养基与碘液混合，然后用NA2S2O3溶液滴定，最后结果见表3。表3三个菌株对NA2S的代谢能力TABLE3THENA2SMETABOLICCAPACITYOFTHETREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS菌株6D硫代硫酸钠消耗量/ML6D代谢率/空白实验组对照PSBH6053602403288PSBL6054102404658PSBS6053832403918在富集培养基中添加2G/L的NA2S制成的含有硫化物的培养基中分别接种三株光合菌进行培养，培养结果出乎意料，三个光合细菌菌株的生长没有受到NA2
26、S的抑制，反而有不同程度的增加，表明三个菌株对NA2S都有较好的代谢能力，其中PSBL菌株在6天后对NA2S的代谢率达到了4658。因为国内对于光合细菌在硫化物处理方面的研究不是很多，所以关于硫化物的处理效果可作为进一步研究这三株光合菌代谢特性的一个潜在研究点。334三个光合细菌菌株对KNO3的代谢能力的定量分析硝酸根标准曲线的绘制。准确移去0、400、600、800、1000、3000、5000UG的硝酸根标准溶液于50ML烧杯中，滴加NA2CO3溶液至碱性，电热板上加热蒸干，冷却至室温。加2ML二磺酸酚溶液，搅拌使干涸物充分溶解，静置10MIN，然后移入50ML容量瓶中，加2MLEDTA溶
27、液，摇匀。加KOH溶液至黄色（或碱性）并过量1ML，若因水中钙、镁等离子浓度较大，而在加KOH溶液时出现沉淀，表明EDTA溶液添加量不足，补加EDTA溶液，直至沉淀消失，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以试剂空白做参比，用1CM比色皿在420NM处测其OD值，根据OD值与硝酸根含量的关系绘制标准曲线，见图4。同样用对PO43的代谢能力的定量分析的分组方法，将培养基换成含KNO3的培养基，在厌氧、光照、30条件下培养17天，测定培养基中NO3的残留量，结果见表4。将在含有KNO3培养基中培养了17天的三个菌株在660NM处的OD值与其在培养10天时的OD值对比，同时以三个菌株在富集培养基中培养10
28、天的OD值做参比，结果见图5。表4结果表明，在培养了17天后，经检测含有KNO3的培养基中NO3的残留量已经很少了。17后，PSBH、PSBL、PSBS三株光合菌对NO3的代谢率分别为8931、9638、9004。即培养基中的氮源已经消耗殆尽，相应的光合菌的生长也停止了。但是第17天时三株光合菌菌悬液在660NM的OD值并不高，如图5所示，与第10天时的OD值相比，对于同样在KNO3培养基中培养的菌悬液，OD值仅有少量增加，但与在富集培养基中培养了10天的菌悬液相比，PSBH和PSBL的OD值还没有富集培养基中的OD值高，PSBS仅稍微超过富集培养基中的OD值。8图4硝酸根标准曲线FIG4TH
29、ESTANDARDCURVEOFNITRATERADICAL表4三个菌株对NO3的代谢能力TABLE4THENO3METABOLICCAPACITYOFTHETREEPHOTOSYNTHETICBACTERIAS菌株起始NO3/MG/ML17DNO3/MG/ML17D代谢率/实验组对照组PSBH1226011811048931PSBL122600411049638PSBS122601111049004图5硝酸盐培养基中第10天与第17天的OD值对比FIG5THECONTRASTOFTHEODVALUEBETWEENTHE10THDAYAND17THDAYAFTERCULTUREDINTHEME
30、DIUMWHICHCONTAINSNITRATE4结论与建议41结论从自然界中分离纯化得到了PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌，并对其在降解含有氮、磷、硫元素9化合物方面的能力进行了初步研究。PSBL、PSBH、PSBS三株光合细菌培养4天后对磷酸盐的代谢率分别为1580、1349和1301；在培养了6天后，对硫化物的代谢率分别为4658、3288和3918；在培养了17天后，对硝酸盐的代谢率分别为9638、8931和9004，可以考虑将PSBL与PSBH混合培养。42建议本实验仅对从自然界中得到的三株光合菌的代谢特性进行了初步的研究。但畜禽养殖场的环境污物成分复杂，氮素的存在形式除了硝
31、酸盐外，还有铵态氮，如三甲胺、二甲胺等，硫化物中还有甲硫醇、硫化甲醇、二硫化甲醇等，所以对光合菌代谢特性的进一步研究还要研究对这些物质的代谢能力。另外，以作为饲料添加剂为目的，还可以研究光合菌的营养价值。在培养方面还要研究它的扩大化培养等。参考文献1陈培林光合细菌应用的研究进展J科技信息,20092271722YASUOASADA,MITSUTAKAOHSAWA,YUICHIRONAGAI,ETALREEVALUATIONOFHYDROGENPRODUCTIVITYFROMACETATEBYSOMEPHOTOSYNTHETICBACTERIAJINTERNATIONALJOURNALOFHYD
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34、研究J渔业现代化,2007,346474912张峰峰,周克,赵玉洁等光合细菌培养条件的研究J天津农业科学,2009,15291113李晓玲,金晓弟,张小民脱氮光合细菌的分离及其脱氮条件研究J山西大学学报,2002,25435035314张李阳,吴向华不同条件光合细菌同化磷能力的初步探究J南京晓庄学院学报,2004,2041415袁盈波,潘志崇,张德民一株光合细菌的分离及其硫化物的处理J宁波大学学报,2010,2321516刘芳,王敏,杨慧等1株紫色非硫光合细菌的分离鉴定J安徽农业科学,2008,36187538753917宋志文,席俊秀,张锡义等一株光合细菌的筛选及对污水的净化效果J青岛建筑工程学院学报,2004,254454818国家环境保护局水合污水监测分析方法第三版M北京中国环境出版社,198928319国家海洋局海洋调查规范M北京海洋出版社,197520中华人民共和国地质矿产行业标准DZ/T00645893,地下水质检验方法二磺酸分分光光度法测定硝酸根S北京中国标准出版社,1996,165168
