1、本科毕业设计（20_届）环境废物净化芽孢杆菌的筛选及其代谢特性初步研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要引言11材料和方法211材料2111样品来源2112原料2113仪器设备4114主要培养基及试剂配制412方法5121菌株分离纯化和保存5122菌株最适生长温度与PH测定6123菌株鉴定6124试验菌的代谢特性初步实验6125试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定72结果和分析821菌株筛选822最适生长温度与PH探索9221最适生长温度测定9222最适生长PH测定923菌株的鉴定1024试验菌的代谢特性初步实验10241酪素分解实验10242色氨酸分解实验
2、10243油脂分解实验10244过氧化氢分解实验11245淀粉分解实验1225试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定12251纤维素分解实验12252酪蛋白分解实验133讨论134结论145建议14致谢14参考文献16附录17摘要为探索自然界中芽孢杆菌在环境废物净化方面和有机物分解代谢能力方面的特性。从环境样品中分离并鉴定得到三株实验用芽孢杆菌Y1、Z1、Z2，经过最适生长条件探索后确定三株菌最适生长温度分别为32、32、37，最适生长PH值分别为7、7、75。后在此基础上对其一些产酶特性作了初步的定性与定量探索。主要包括对酪素、色氨酸、油脂、过氧化氢和淀粉代谢的定性实验以及对纤维素、酪蛋白分解特性
3、的定量实验。结果表明，三株菌均可分解油脂、过氧化氢，对色氨酸均无代谢能力，淀粉透明圈比值分别为1823，1168，1826。Y1、Z2菌株纤维素酶活力分别为21034U/G与17370U/G，Z1菌株无分解纤维素能力；Z1、Z2菌株酪蛋白酶活力分别为1115U/G与392U/G，Y1菌株无分解酪蛋白能力。关键词芽孢杆菌分离纯化；代谢特性ABSTRACTTHISSTUDYISTOEXPLOREBACILLUS，ABILITYOFPURIFYINGENVIRONMENTALWASTEANDDECOMPOSINGORGANICMATTERTHREESTRAINSOFBACILLUS,NAMEDASY
4、1,Z1ANDZ2WEREOBTAINEDANDIDENTIFIED,WHICHWEREISOLATEDFROMENVIRONMENTALSAMPLESAFTEREXPLORINGTHEOPTIMALGROWTHCONDITIONS,THEOPTIMUMGROWTHTEMPERATUREOFTHETHREESTRAINSOFBACTERIAWAS32,32,37,THEOPTIMUMGROWTHPHVALUESWERE7,7,75ONTHISBASIS,PRELIMINARYQUALITATIVEANDQUANTITATIVETOEXPLORETHECHARACTERISTICSOFITSEN
5、ZYMEPRODUCTIONMAINLYINCLUDINGCASEIN,TRYPTOPHAN,GREASE,HYDROGENPEROXIDE,STARCHMETABOLISMQUALITATIVEEXPERIMENTSANDCELLULOSE,CASEINDECOMPOSITIONCHARACTERISTICSQUANTITATIVEEXPERIMENTSRESULTSSHOWTHATTHREESTRAINSOFBACTERIACANBEDECOMPOSEDOILANDHYDROGENPEROXIDE,BUTEXCEPTTRYPTOPHANTHERATIOOFSTARCHCLEARZONESE
6、PARATELYARE1823,1168,1826CELLULASEACTIVITYOFY1,Z2STRAINSSEPARATELYARE21034U/GAND17370U/G,Z1STRAINSBEWITHOUTABILITYTOBREAKDOWNCELLULOSECASEINPROTEASEACTIVITYOFZ1,Z2STRAINSSEPARATELYARE1115U/GAND392U/G,Y1STRAINHAVENOABILITYTOBREAKDOWNCASEINPROTEINSKEYWORDSBACILLUS，PURIFICATION，METABOLICCHARACTERISTICS
7、17引言芽孢杆菌是一群需氧或兼性厌氧、G目前发现有G一的并在一定条件下可形成芽孢的化能异常杆菌12。它们广泛分布于空气粉尘3、土壤4、水5及动物肠道6中，在各个空间各个领域发挥着自己的作用。A芽孢杆菌的分类90年代以来，芽孢杆菌的分类已由原来的2个属发展到目前的13个属，130多个种。13个属分别为芽孢杆菌属（72种）、芽孢乳杆菌属（5种）、兼性芽孢杆菌属（1种）、硫化芽孢杆菌属（3种）、耐热芽孢杆菌属（1种）、脂不酸芽孢杆菌属（4种）、类芽孢杆菌属（27种）、喜盐芽孢杆菌属（3种）、短芽孢杆菌属（10种）、解硫胺素芽孢杆菌属（3种）、枝芽孢杆菌属（2种）、需盐芽孢杆菌属（1种）、薄壁芽孢杆菌
8、属（2种）。其中后八个属是1992年到1999年间从芽孢杆菌属中独立出来的新属2。B芽孢杆菌的芽孢芽孢是某些细菌在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭球形的休眠体。它们对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在7080时10MIN就会死亡，而芽孢在120140情况下还能生存几个小时，营养细胞在5苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15D，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全如此。决定芽孢形成的根本
9、原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制芽孢形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。芽孢形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面变化。芽孢作为芽孢杆菌的特有结构，因其特点可有很多用途。如其可用于分类鉴定，是因为不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，可以作为分类鉴定的依据或参考。可用于科研材料，由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。还可以用作保存菌种和分离菌种，因芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过
10、恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料；而且芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离，将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。其他方面还有些可用于生物杀虫，有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。C芽孢杆菌的产酶芽孢杆菌可产生多种多样的酶，如蛋白酶78、纤维素酶9、淀粉酶8、脂肪酶10、过氧化氢酶7等等。同时其有不错的除臭功能11，故有些菌很可能没有水解色氨酸产生吲哚的能力，也就是缺乏色氨酸酶导致有除臭功能。D芽孢杆菌的应用芽孢杆菌可制成适宜菌剂掺入饲料作为饲料添加剂12喂养
11、家禽13家畜6。芽孢杆菌在养殖业中，可提高畜禽生产性能，防治畜禽疾病14，净化养殖环境。它们可调节消化道微生态平衡，提高畜禽消化能力，提高畜禽免疫力，产生营养素15。蜡样芽孢杆菌微生态制剂已在养殖业上得到应用16。蜡样芽孢杆菌以孢子状态进入动物消化道后,生长繁殖、支持厌氧菌的生长繁殖,保持肠内微生物与动物之间处于微生态平衡状态,同时参与肠道内的物质代谢,从而达到抗菌、促进生长、提高饲料利用率的作用17。18动物的正常新陈代谢过程中，淀粉、脂肪、蛋白质等在体内不能完全的利用，而或多或少有一部分随着粪便进入肠道，不免造成资源的浪费，而且这些有机物在体外的环境下很容易腐败变质，发臭造成环境的污染与破
12、坏。芽孢杆菌如果能对其进行利用，则即能节约资源又可保护净化环境。不少动物体内都缺乏纤维素酶，所以食入体内的植物中的丰富的纤维素都随着粪便排出，纤维素是植物材料的主要成分，是地球极为丰富的可再生资源。纤维素的结构复杂，自然界中在纤维素酶的作用下纤维素可彻底水解成葡萄糖。充分利用这些纤维素又是课题的一个基本内容18。且芽孢杆菌产生的过氧化氢酶可以分解肠道内的过氧化氢生成游离氧，对肠道内的多种病原菌有杀灭作用，如果芽孢杆菌不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，可有效降低血液及粪便中吲哚的浓度，起到净化环境的作用19。而幼仔动物肠道中消化酶的分泌不足消化能力差，而且肠道内的大肠杆菌等腐败菌增多，会产生一些
13、有害物质如吲哚、氨和硫化氢等，这些物质有潜在抑制生长和致癌的作用。需氧的芽孢杆菌在肠道中主要通过生物夺氧维持肠道生态平衡，它在肠道中短时间定植后，可以消耗大量氧气，维持肠道的厌氧环境，为消化道中的乳杆菌、肠球菌和乳球菌等兼性厌氧菌及拟杆菌等厌氧菌提供更为理想的生长环境，增强肠道对厌氧菌的定植能力2021。E本论文的研究目标本论文通过从从自然界即包括杂质与芽孢杆菌的混合样品中专一地分离出芽孢杆菌。通过一系列的产酶实验及酶活性测定实验来考察其对生物大分子分解代谢的能力和探索其在环境净化过程中的作用机制，从而使该菌株产生实际意义。1材料和方法11材料111样品来源本实验的样品有两个，从舟山猪舍饲养槽
14、得到的混合样品编为1号样品，从宁大旧体育场周围提取的泥土样品编号为2号样品。112原料试剂出厂地址酵母抽提物生化试剂国药集团化学试剂有限公司蛋白胨鱼粉生化试剂国药集团化学试剂有限公司氯化钠（NACL）分析纯宜兴市第二化学试剂厂琼脂粉细菌级杭州微生物试剂有限公司葡萄糖C6H12O6分析纯广东省化学试剂工程技术研究开发中心七水合硫酸镁MG2SO47H20分析纯上海化学试剂公司硫酸铵NH42SO4分析纯上海试四赫维化工有限公司三水合磷酸氢二钾K2HPO43H20分析纯上海化学试剂公司脱脂纯奶粉食品级河北三元牛奶粉石蕊国药集团化学试剂有限公司乙醚C4H10O分析纯杭州双林化工试剂厂19对二甲基氨基苯甲
15、醛C9H11NO分析纯上海化学试剂公司95乙醇CH3CH2OH杭州双林化工试剂厂浓盐酸HCL分析纯中国杭州化学试剂有限公司牛肉膏生化试剂上海化学试剂公司花生油食品级山东省烟台市鲁花花生油3氨基7甲氨基2甲基吩嗪盐酸盐（中性红）上海化学试剂公司过氧化氢H2O2分析纯浙江中星化工试剂有限公司可溶性淀粉C6H10O5N分析纯国药集团化学试剂有限公司碘片I上海试剂一厂碘化钾KI杭州化学试剂有限公司3,5二硝基水杨酸（C7H4N2O7）分析纯国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠（NAOH）分析纯天津市永大化学试剂开发中心酒石酸钾钠（C4H4O6KNA4H2O）分析纯天津市永大化学试剂开发中心苯酚（C6H5O
16、H）分析纯国药集团化学试剂有限公司无水亚硫酸钠（NA2SO3）分析纯上海化学试剂公司一水合柠檬酸（C6H8O7H2O）分析纯上海化学试剂公司二水合柠檬酸钠（NA3C6H5O72H2O分析纯上海化学试剂公司钨酸钠NA2WO42H2O分析纯上海化学试剂公司钼酸钠NA2MOO42H2O分析纯中国兴达化工试剂厂磷酸（H3PO4）分析纯上海化学试剂公司硫酸锂LI2SO4分析纯上海化学试剂总厂所属上海第二厂溴上海试剂一厂无水碳酸钠NA2CO3分析纯宜兴市第二化学试剂厂三氯乙酸CCL3COOH分析纯上海化学试剂公司磷酸二氢钠NAH2PO42H2O分析纯上海化学试剂公司磷酸氢二钠NA2HPO412H2O分析纯
17、上海化学试剂公司干酪素广东医药站化学试剂综合公司分装20酪氨酸分析纯中国医药集团上海试剂厂孔雀绿国药集团化学试剂有限公司番红国药集团化学试剂有限公司113仪器设备仪器出厂地址分析天平北京赛多利斯仪器系统有限公司恒温培养箱宁波江南仪器厂台式离心机MICROCL17，THERMO电炉浙江上虞市化验器材厂灭菌锅宁波医疗器械厂水浴锅上海一恒科技有限公司72型分光光度计上海精密科学仪器有限公司电冰箱伊莱克斯烘箱宁波江南仪器厂PH计上海精密科学仪器有限公司超声波破碎器宁波新芝生物科技股份有限公司纯净水制造机杭州天创净水设备有限公司其他设备包括超净工作台磨口回流装置棕色瓶培养皿锥形瓶试管胶头滴管移液枪枪头移
18、液管漏斗玻璃珠等等浙江宁波本地114主要培养基及试剂配制（1）LB液体培养基05酵母抽提物，1蛋白胨，1NACL，PH7678，121高压蒸汽灭菌20MIN。（2）LB固体培养基05酵母抽提物，1蛋白胨，1NACL，15琼脂粉，PH7678，121高压蒸汽灭菌20MIN。（3）生孢培养基01蛋白胨，01葡萄糖，007酵母粉，002MGSO47H20，002（NH4）2SO4，01K2HPO43H20，15琼脂，PH7678，121高压蒸汽灭菌20MIN。（4）石蕊牛奶培养基1脱脂牛奶，00075石蕊，PH68，121灭菌15MIN。（5）蛋白胨水培养基1蛋白胨，05NACL，PH调为76，12
19、1灭菌20MIN。（6）中性红水溶液004G中性红，28ML95乙醇，72ML蒸馏水。（7）油脂培养基1蛋白胨，05牛肉膏，05NACL，1花生油，01中性红水溶液，15琼脂粉，PH72，121灭菌20MIN。（8）淀粉培养基1蛋白胨，05NACL，05牛肉膏，02可溶性淀粉，15琼脂粉，PH72，121灭菌20MIN。（9）卢戈氏碘液1G碘片，2G碘化钾，300ML蒸馏水，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，混匀，定容。（10）葡萄糖标准液葡萄糖在恒温干燥箱中105下干燥至恒重，准确称取100MG于100ML小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100ML容量瓶中用蒸馏水定容至
20、100ML，充分混匀。4冰箱中保存。21（11）DNS溶液准确称取DNS63G于500ML大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2MOL/LNAOH溶液262ML，再加到500ML含有185G酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5G结晶苯酚和5G无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后移入1000ML容量瓶中用蒸馏水定容至1000ML，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。（12）柠檬酸缓冲液A液（01MOL/L柠檬酸溶液）准确称取柠檬酸21014G于500ML大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000ML容量瓶中用蒸馏水定容至1000ML，充分混匀。4冰箱中保存备用。（13）柠檬酸缓冲液B液（01MOL/L
21、柠檬酸钠溶液）准确称取柠檬酸钠29412G于500ML大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000ML容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1000ML，充分混匀。4冰箱中保存备用。（14）柠檬酸缓冲液取上述柠檬酸缓冲液A液2712ML，柠檬酸缓冲液B液2288ML，充分混匀后移入100ML容量瓶中用蒸馏水定容至100ML，充分混匀，即为005MOL/LPH45的柠檬酸缓冲液。4冰箱中保存备用。（15）福林试剂FOLIN试剂于2000ML磨口回流装置内，加入钨酸钠100G，钼酸钠25G，蒸馏水700ML，85磷酸50ML，浓盐酸100ML，文火回流10H。取去冷凝器，加入硫酸锂50G，蒸馏水50ML，混匀
22、，加入几滴液体溴，再煮沸15MIN，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000ML，用细菌漏斗NO45过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。（16）04MOL/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠424G，定容至1000ML。（17）04MOL/L三氯乙酸TCA溶液称取三氯乙酸654G，定容至1000ML。（18）PH72磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠312G，定容至1000ML，即成02MOL溶液A液。称取磷酸氢二钠7163G，定容至1000ML，即成02MOL溶液B液。取A液28ML和B液72M
23、L，再用蒸馏水稀释1倍，即成01MOL/LPH72的磷酸盐缓冲液。（19）2酪蛋白溶液准确称取干酪素2G，称准至0002G,加入01N氢氧化钠10ML，在水浴中加热使溶解必要时用小火加热煮沸，然后用PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。（20）100G/ML酪氨酸溶液精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸01000G，逐步加入6ML1N盐酸使溶解，用02N盐酸定容至100ML，其浓度为1000G/ML，再吸取此液10ML,以02N盐酸定容至100ML，即配成100G/ML的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以
24、免繁殖细菌而变质。（21）无菌生理盐水09NACL，121灭菌20MIN。12方法121菌株分离纯化和保存A制备菌悬液分别从1号样品和2号样品中取出5G固体物质，无菌室研磨均匀后迅速倒入带玻璃珠的45ML无菌生理盐水锥形瓶中，震荡5MIN使菌剂充分扩散，100下恒温处理10MIN2223，冷却静置，得到菌悬液1号样与菌悬液2号样。B涂布无菌条件下分别在菌悬液1号样与2号样中取上清液100UL，然后在LB固体培养基涂布均匀。置于37恒温培养箱中培养至长出长势良好的单菌落。22C划线纯化无菌条件下分别将从涂布培养基上得到单菌落菌株在另一LB固体培养基上划线，在37情况培养24小时，得到划线平板。D
25、保藏无菌条件下在上述划线平板中分别挑取单菌落，每一菌株分别接种到两个LB固体培养基斜面上，对应编号，37培养24小时后放置于冰箱内4保存。122菌株最适生长温度与PH测定A最适生长温度测定将上述分离到的菌株分别接种于正常PH值的LB液体培养基中，每个菌株做三个平行，分别在27、32、37、42、47恒温培养箱中培养24H后取出，用72型分光光度计测量其OD值。B最适生长PH测定将上述分离到的菌株分别接种于LB液体培养基（PH分别为6、65、7、75、8，其他条件正常）中，每个菌株做三个平行，分别在其最适温度恒温培养箱中培养24H后取出，用72型分光光度计测量其OD值。123菌株鉴定24将上述分
26、离到的菌株分别在生孢培养基（最适温度与PH值条件下）中培养48H后，进行芽孢染色。染好色后用100倍油镜观察。如菌丝为杆状或短杆状并出现有绿色的芽孢或观察有伴孢晶体的存在则证明其为芽孢杆菌；如无，则证明其不是。124试验菌的代谢特性初步实验252627A酪素分解实验分别在菌株保存斜面LB固体培养基中加入等量无菌生理盐水制备成菌体悬液，破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN，取等体积上清液分别接种于固定体积的石蕊牛奶培养基，每株菌分别做5个平行，在最适生长温度下培养48H后观察，如培养基变澄清则说明为阳性反应，该菌株可以分解酪素；反之，则说明为阴性反应，该菌株不能分解酪素。B色氨酸分解实
27、验分别在菌株保存斜面LB固体培养基中加入等量无菌生理盐水制备成菌体悬液，破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN，取等体积上清液分别接种于固定体积的蛋白胨水培养基中，每株菌分别做5个平行，在最适生长温度与PH条件下培养48H后，在此培养基中加入34滴乙醚，数次，静置1MIN，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂后观察。如果在乙醚和培养物之间产生红色环状物，则说明为阳性反应，该菌株可以分解色氨酸；反之，则说明为阴性反应，该菌株不能分解色氨酸。C油脂分解实验分别取分离到的菌点种于油脂培养基中，每株菌分别做5个平行，在最适生长温度条件下培养24H后观察菌苔颜色。如果出现红色斑点，则说明为
28、阳性反应，该株菌可以分解油脂；反之，则说明为阴性反应，该菌株不能分解油脂。D过氧化氢分解实验取干净的载玻片，在上面滴L滴35的过氧化氢溶液，然后挑取L环培养1824H的待测菌株，每株菌分别做5个平行，在过氧化氢溶液中涂抹后观察。如果有气泡氧气出现，则说明为阳性反应，该菌株可以分解过氧化氢；反之，则说明为阴性反应，该菌株不能分解过氧化氢。E淀粉分解实验28将灭菌后的淀粉培养基冷却到50左右，倒成平板，凝固后，取待测菌株1824H的纯培养物点于平板上，23每皿可点种35个菌株，适温培养24D形成菌落后，在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色，再观察。如果菌落周围有无色透明圈出现，则
29、说明为阳性反应，该菌株可以分解淀粉；反之则说明为阴性反应，该菌株不能分解淀粉。透明圈的大小说明分解淀粉能力的大小。125试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定A纤维素分解实验29A葡萄糖标准曲线测定取8支洗净烘干的20ML具塞刻度试管，编号后按表1加入标准葡萄糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入15MLDNS溶液，摇匀后沸水浴5MIN，取出冷却后用蒸馏水定容至20ML，充分混匀。在540NM波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（MG）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲
30、线。表1葡萄糖标准曲线制作管号试剂12345678葡萄糖标液（ML）002040608101214蒸馏水（ML）2181，61412100806葡萄糖含量002040608101214B滤纸酶活力的测定每株分离到的菌株均接种于LB液体培养基中培养，分别在最适生长温度与PH值条件下培养48H后得到培养液。培养液经过超声波破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN后取上清液得到粗酶液。对每株菌分别采取以下方法测定取3支洗净烘干试管，编号后各加入05ML酶液和15ML005MOL/LPH45的柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入15MLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将3支试管同时
31、在50水浴中预热510MIN，再各加入滤纸条50MG（新华定量滤纸，约1CM1CM），50水浴中保温1H后取出立即向2、3号试管中各加入15MLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5MIN10MIN，取出冷却后用蒸馏水定容至25ML，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540NM波长下测定2、3号试管液的光密度值并记录结果。C计算根据2个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力（U/G）。在上述条件下，每小时由底物生成1UMOL葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。滤纸酶活力（U/G）葡萄糖含量（MG）酶液定容总体积ML556反应液中酶液加
32、入量（ML）样品重（G）时间（H）式中556为1MG葡萄糖的UMOL数。（1000/180556）B蛋白质分解能力实验30A酪氨酸标准曲线测定测定步骤取6支试管分别编号，按表2分别吸取不同浓度酪氨酸1ML,各加入04MOL碳酸钠5ML,再各加入24已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN，分别用72型分光光度计测定光密度OD波长660NM。测三次,取平均值。将16号管所测得的光密度OD减去1号管蒸馏水空白试验所测得的光密度为净OD数。以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K。表2酪氨酸标准曲线制作管号试剂123456蒸馏
33、水（ML）1086420100G/ML酪氨酸（ML）0246810酪氨酸最终浓度（G/ML）020406080100B样品测定每株分离到的菌株均接种于LB液体培养基中培养，分别在最适生长温度与PH值条件下培养48H后得到培养液。培养液经过超声波破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN后取上清液得到粗酶液。取15100MM试管3支,编号1、2、3,每管内加入粗酶液或稀释的粗酶液1ML,置于40水浴中预热2MIN,再各加入经同样预热的酪蛋白1ML,精确保证10MIN,时间到后,立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML,以终止反应,继续置于水浴中保温20MIN,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另
34、取15150MM试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1ML,再加04MOL碳酸钠5ML,已稀释的福林试剂1ML,摇匀,40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验也取试管3支,编号1、2、3,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML,使酶失活,再加入酪蛋白。样品的平均光密度OD一空白的平均光密度OD净OD值。C计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基A/104N式中A由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44毫升反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；2结果与分析2
35、1菌株筛选2个实验样品分别制备样品悬液并加热煮沸10MIN处理后，对应涂布于LB固体培养基中正常条件培养，总共得到了三株菌从1号样品里得到的一株菌，编号为Y1；其他两株为2号样品里得到的菌株，分别编号为Z1、Z2。样品悬液没有经过梯度稀释而直接如上处理后涂布，最后却仅仅只分离到三株菌，这是因为筛选方法的特25殊。因为芽孢是高度耐热的抗逆性休眠体，本身就在100中10MIN内不受很大影响，而一般营养型菌体因正常生命活动被破坏而被同时杀死，从而筛选掉了大部分的杂菌。这是本筛选方法的最主要优点选择性非常高。当然也不排除有嗜热菌的存在，这需在后续的鉴定实验中进行补充验证。22最适生长温度与PH探索22
36、1最适生长温度测定将上述得到的三株菌Y1、Z1、Z2分别接种于LB液体培养基中，每个菌株做三个平行，分别使其在27、32、37、42、47恒温培养箱中培养，其他条件不变，培养24H后取出后用72型分光光度计测量其OD值。结果如图1所示。由图1所示，三株菌Y1、Z1、Z2的最适生长温度分别为32、32和37。其生长情况基本都符合抛物线形式，分别在最适温度达到最大OD值，实验结果准确性相对较高。Z1菌株对温度相对比较敏感，最适温度与相邻选择温度之间测定的OD值差额明显，对温度的恒定要求较高。而Y1和Z2菌株则表现的不是那么明显，可以适应较广泛的温度培养条件。相比较来说三株菌在分别在其最适生长温度情
37、况下培养，Z1号菌生长情况最优，Z2号菌次之，Y1号菌生长情况最差。00102030405062732374247温度（）OD值（A）Y1Z1Z2图1三株菌最适生长温度探索222最适生长PH测定将上述得到三株菌Y1、Z1、Z2分别接种于LB液体培养基（PH分别为6、65、7、75、8，其他正常）中，每个菌株做三个平行，分别在其最适生长温度下恒温培养24H后取出后用72型分光光度计测量其OD值。结果如图2所示。由图2可得，三株菌Y1、Z1、Z2的最适生长PH值分别为7、7、75。其生长情况基本都符合抛物线形式，分别在最适PH值达到最大OD值，实验结果准确性相对较高。Z2株对PH值相对比较敏感，最
38、适PH值与相邻选择PH值之间测定的OD值差额明显，对PH值恒定要求较高。而Y1和Z1菌株则表现的不是那么明显，可以适应较广泛的PH值培养条件。尤其明显的是Y1菌株在PH6575范围内OD值相差无几，Z1菌株在PH值65与7时测量OD值几近相同。相比较来说三株菌在分别在其最适PH情况下培养，Z2号菌生长情况最优，Z1号菌次之，Y1号菌生长情况最差。2600102030405066657758PH值OD值（A）Y1Z1Z2图2三株菌的最适PH值探索23菌株的鉴定以上得到的三株菌Y1、Z1、Z2分别在液体生孢培养基中最适条件下培养48H后，经过芽胞染色及100倍油镜显微观察，多个观察点得出一致结论，
39、Y1、Z1、Z2三株菌的单个菌体均呈小的杆状，在菌体中间有观察到绿色的芽孢存在，故判定三株菌Y1、Z1、Z2均为芽孢杆菌。24试验菌的代谢特性初步实验241酪素分解实验分别在三个菌株保存斜面LB固体培养基中加入等量无菌生理盐水制备成菌体悬液，破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN，取等体积上清液分别接种于固定体积的石蕊牛奶培养基，每株菌分别做5个平行，在最适生长温度下培养48H后观察原来浑浊的石蕊牛奶培养基变化情况，结果如表3所示。由表3可知，Y1号菌不能分解酪素，Z1号菌可分解酪素，而Z2号菌因其结果相差不大而不能确定是不是对酪素有分解能力，故为空白。这个实验只是为了为后面定性实验做
40、个小小的铺垫，大致了解一下其产蛋白酶的情况。故而对Z2号菌实验结果的不理想情况没有进行再度的重复实验。242色氨酸分解实验分别在三个菌株保存斜面LB固体培养基中加入等量无菌生理盐水制备成菌体悬液，破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN，取等体积上清液分别接种于蛋白胨水培养基中，分别做5个平行，在最适生长温度与PH条件下培养48H后分别对培养液进行处理，观察乙醚与培养物间红色产生情况，结果如表3所示。由表3可知，三株菌均表现出了一致的实验结果，反应均为阴性反应，可证明三株菌均不可以分解色氨酸，即不能因之产生出吲哚，而粪便的主要臭味主要就是吲哚及其衍生物的浓度太大导致的，这也说明此三株菌均
41、有除臭的作用。243油脂分解实验分别取三株菌点种于油脂培养基中，每个菌株分别做5个平行，在最适生长温度条件下培养24H后，观察菌苔颜色，结果如表3所示。由表3所知，三株菌均表现出了一致的实验结果，反应均为阳性反应，即可证明三株菌均可以分解油脂，对油脂均有代谢分解能力。244过氧化氢分解实验27取干净的载玻片，在上面滴L滴35的过氧化氢溶液，分别挑取L环培养24H的待测菌株在载玻片上的过氧化氢溶液中涂抹，每个菌株分别做5个平行，同时取体积相似的除菌泥清洁泥土同样涂抹作为空白，观察结果如表3所示空白结果为阴性反应，表3所知，三株菌的5个平行均表现出了一致的实验结果，反应均为阳性反应，可证明三株菌均
42、可以分解过氧化氢，对过氧化氢有代谢分解能力。表3三株菌酪素、色氨酸、油脂、过氧化氢分解实验结果项目菌别Y1Z1Z2酪素色氨酸油脂过氧化氢注以上所得结果分别来自于5个平行数据，代表为阳性反应，代表为阴性反应，空白为不能确定245淀粉分解实验将灭菌后的淀粉培养基冷却到50左右，倒成平板，凝固后，分别取三株待测菌株培养24H的纯培养物点于平板上，每皿可点种5个菌株，在最适温度下培养48H形成菌落后，分别在平板上滴加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色，再观察。实验结果如表4所示。表4三株菌淀粉分解实验结果项目菌别Y1Z1Z2透明圈出现情况透明圈直径/菌落直径182311681826注以上所得结
43、果分别来自于5个平行数据，代表为阳性反应，代表为阴性反应。由表4所示，三株菌均表现为阳性反应，即均可以产生透明圈，以上三株菌其透明圈直径与菌落直径比值分别为1823，1168，1826，相比来说三株菌其比值相差不大，Y1菌株与Z2菌株直径比值基本相同，Z1菌株相对小一些。但三株菌比值均未超过2，实际说明其分解淀粉能力不是很强。究其原因，可能是菌本身分解淀粉能力就差一些，还可能是因为一些培养过程中的条件没设置好。仍需经过将这些因素优化后再进行进一步研究与探索。25试验菌的纤维素蛋白质分解能力测定251纤维素分解实验A葡萄糖标准曲线的绘制不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入15MLDN
44、S溶液，摇匀后沸水浴5MIN，取出冷却后用蒸馏水定容至20ML，充分混匀。在540NM波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（MG）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。如图3所示。B纤维素酶活测定Y1、Z1、Z2菌株均接种于LB液体培养基中培养，分别在最适生长温度与PH值条件下培养48H后得到培养液。培养液经过超声波破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN后取上清液得到粗酶液。对每株菌分别采取以下方法测定取3支洗净烘干试管，编号后各加入05ML粗酶液和15ML005MOL/LPH45的柠檬酸缓冲液，向
45、1号试管中加入15MLDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将3支试管同时在50水浴中预热10MIN，再各加入滤纸条50MG（新华定量滤纸，约1CM1CM），50水浴中保温1H28后取出立即向2、3号试管中各加入15MLDNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴10MIN，取出冷却后用蒸馏水定容至25ML，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540NM波长下测定2、3号试管液的光密度值并记录结果。结果如表5所示。Y14417X00042R209992050051152250020406081121416葡萄糖浓度（MG/MLOD值（A）图3葡萄糖标准曲线表5三株菌纤维素酶活
46、测定结果菌别结果吸光值（A）酶活（U/G）Y1菌株54521034Z1菌株0015476Z2菌株45017370注以上所得结果均来自于2个平行数据由表5所示，Y1与Z2菌株都有一定的纤维素酶活性，Y1活性最高，Z2活性次之。而Z2菌株其吸光值仅为001，而酶活测定结果为5476U/G，比其他菌株数值少了三个数量级，基本确定其无纤维素酶活性。252酪蛋白分解实验A酪蛋白标准曲线测定不同浓度酪氨酸1ML,各加入04MOL碳酸钠5ML,再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN用72型分光光度计进行测定波长660NM。一般测三次,取平均值。将16号管所测得的光密度OD减
47、去1号管蒸馏水空白试验所测得的光密度为净OD数。结果如图4所示。B酪蛋白酶活测定每株分离到的菌株均接种于LB液体培养基中培养，分别在最适生长温度与PH值条件下培养48H后得到培养液。培养液经过超声波破碎5MIN后5000R/MIN离心10MIN后取上清液得到粗酶液。取15100MM试管3支,编号1、2、3,每管内加入粗酶液或稀释的粗酶液1ML,置于40水浴中预热2MIN,再各加入经同样预热的酪蛋白1ML,精确保证10MIN,时间到后,立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML,以终止反应,继续置于水浴中保温20MIN,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15150MM试管3支,编号1、2、3,每管
48、内加入滤液1ML,再加04MOL碳酸钠5ML,已稀释的福林试剂1ML,摇匀,40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验也取试管3支,编号1、2、3,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加04MOL三29氯乙酸2ML,使酶失活,再加入酪蛋白。结果如表6所示。Y00506X00366R20998305005115225335445020406080100浓度UG/MLOD值（A图4酪蛋白标准曲线表6三株菌酪蛋白酶活测定结果菌别结果OD值（A）酪蛋白浓度（UG/ML）酶活（U/G）Y1菌株001092037Z1菌株14127871115Z2菌株046981392注以上所得结果均来自于3个平行数
49、据由表6可知，Z1、Z2菌株均有酪蛋白酶活性，Z1菌株活性大于Z2菌株，而Y1菌株所测OD值约为0，故判定其没有分解酪蛋白的能力。相对三株菌来说，三株菌所测最后酶活性相差不大，尤其是已经被判断为无分解酪蛋白能力的Y1菌株与有酪蛋白酶活性的Z2菌株相比，结果相差不大。所以判断Z2菌株酶活性也不是甚高。三株菌酪蛋白酶活性均不是很高，当然还是Z1菌为优。3讨论本实验从自然界样品中分离得到三株芽孢杆菌分别编号Y1、Z1、Z2，采用的是加热煮沸样品液10MIN后再进行涂布分离，这也是分离芽孢杆菌最简单也是最有效的实验方法。究其最大优点即其筛选程度非常之高，自然界中的菌多种多样，但如此处理，就仅仅分离出三株芽孢杆菌。当然，自然界中芽孢杆菌种类也是繁多的，如此处理后菌种类如果太多，则有必要进行二级筛选，即实验用的LB培养基可用纤维素培养基（糖类物质仅包含有纤维素）代替，如果不能分解纤维素则其不能在其上生长，能够更有效的有方向的分离。对菌株的鉴定仅做了芽孢染色，因其具有芽孢，芽孢染色如果成功的话，对实验本身已经有很大说服力了。客观因素是没有条件进行16SRNA序列比对，如果有条件的话可以进行此鉴定，更有说
